Am. J. Respir. Crit. Care Med., Volume 163, Number 1, January 2001, 115-121

Анализ CD4+ и CD8+ Т-клеток в легких и периферической крови при саркоидозе

JAN WAHLSTROM, KIANOOSH KATCHAR, HANS WIGZELL, OLLE OLERUP, ANDERS EKLUND, and JOHAN GRUNEWALD
Microbiology and Tumour Biology Centre, Karolinska Institutet, and Department of Medicine, Karolinska Hospital, Stockholm; and Center for BioTechnology, Karolinska Institutet, NOVUM, Huddinge, Sweden

Введение

Саркоидоз - хроническая, мультисистемная воспалительная болезнь неизвестной этиологии, характеризующаяся формированием неказеозных гранулем в вовлеченных органах, наиболее обычно в легком. T-клетки и макрофаги - ключевые участники этого процесса. Эти клетки могут быть получены для анализа из дыхательных путей с помощью техники бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ). Исследования, в которых это было сделано, показали увеличенное число активизированных CD4+ T-клеток в легких пациентов с саркоидозом. При исследовании T-клеточных рецепторов (ТКР) мы показали, что Скандинавские пациенты с саркоидозом часто имеют ограниченное легкими накопление CD4+ T-клеток, использующих ТКР V-alpha 2.3 (2). Это так называемая экспансия T-клеток, сильно коррелирует с гаплотипом HLA DR17 (3). Наиболее вероятно, что селекция и пролиферация этих T-клеток произошла в ответ на специфический антиген, презентация которого производится молекулой DR17. Наиболее интересной находкой этого исследование было то, что DR17+ Скандинавские пациенты имеют острое начало болезни и намного лучший отдаленный прогноз чем DR17- пациенты (3).

T-клетки - главные регулирующие клетки иммунной системы. Их роль заключается в способности производить Th1 (IL-2 и IFN-gamma) и Th2 (IL-4, IL-5 и IL-13) цитокины (4). Th1 цитокины главным образом участвуют в клеточном иммунном ответе, Th2 цитокины являются медиаторами гуморального ответа. Баланс между Th1 и Th2 цитокинами может иметь критическую важность для результата иммунного ответа, как это происходит при инфекции Mycobacterium leprae, когда Th1 ответ связан с относительно доброкачественной туберкулоидной формой болезни принимая во внимание, что Th2 ответ доминирует при фатальной лепроматозной форме (5). Гетерогенность производства Th1/Th2 цитокинов сначала была обнаружена у клонов CD4+ мышей и человека, но позднее была обнаружена и у других лимфоцитов таких как CD8+ (6). In vivo, однако, между полюсами Th1 и Th2, имеется целый спектр клеток, производящих цитокины.

При саркоидозе, T-клетки в легких спонтанно производят увеличенные уровни IL-2 и IFN-gamma (7) и исследования клонов T-клеток из ЖБАЛ (10, 11) и паренхимы легкого (12) поддерживают понимание саркоидоза как Th1 болезни. Также интересен фактор некроза опухоли альфа (TNF-alpha), так как его ген существует в аллельных вариантах, которые коррелируют с изменениями производства TNF-alpha (15) и с восприимчивостью к различным болезням (16). В частности аллель TNFA2 находится в неравновесном сцеплении с некоторыми аллелями HLA, особенно HLA-DR17 (HLA-DR3 согласно старой спецификации) (17), что, как мы показали ранее, позволяет предсказать хороший прогноз у Скандинавских пациентов с саркоидозом (3).

В отношении клонов Т-клеток из ЖБАЛ, данные о производстве цитокинов противоречивы (11, 12). Так как процедура клонирования может искажать профиль цитокинов, предпочтительнее анализировать клетки как можно скорее после того, как БАЛ был выполнен. Это может быть сделано с помощью проточной цитометрии, когда клетки делаются проницаемыми и производится окрашивание внутриклеточных цитокинов (18, 19). Комбинируя внутриклеточное окрашивание с окрашиванием поверхности, эта техника также позволяет обнаружить производство цитокинов специфическими субпопуляциями клеток. Роль CD8+ T-клеток редко обсуждалась в исследованиях патогенеза саркоидоза из-за относительно небольшого их количества в легком по сравнению с CD4+ клетками, но проточная цитометрия позволила произвести независимое исследование фенотипов цитокинов обоих субпопуляций.

Целью настоящего исследования было количественное установление числа клеток, производящих IL-2, IL-4, IFN-gamma и TNF-alpha среди лимфоцитов периферической крови (PBL) и субпопуляций T-клеток ЖБАЛ пациентов с саркоидозом. T-клетки PBL здоровых индивидуумов служили средством контроля. Мы хотели изучить CD4+ и CD8+ T-клетки отдельно. Мы выдвигаем гипотезу, что существуют различия в профилях цитокинов у HLA-DR17+ и HLA-DR17- пациентов, что может объяснять, почему эти группы пациентов имеют существенно различный прогноз саркоидоза.

Методы

Пациенты

В исследовании участвовало 18 пациентов с нелеченым саркоидозом (средний возраст 39 лет; диапазон от 27 до 59 лет), 8 мужчин и 10 женщин. Семнадцать пациентов имели легочный саркоидоз и один имел только кожные проявления. Десять пациентов имели гистологически доказанную болезнь, остальные восемь имели типичные клинические (одышку, усталость, лихорадку, кашель и потерю веса) и рентгенографические особенности саркоидоза. Пять из этих восьми пациентов имели классический синдром Лёфгрена, который является патогномоничным для саркоидоза и один пациент имел увеит. Пять из этих восьми пациентов имели отношение CD4+/CD8+ в ЖБАЛ превышающее 4.0. Пациент с кожными проявлениями имел ограниченную легкими экспансию V-alpha2.3+ T-клеток, что является обычным у Скандинавских пациентов с саркоидозом. У двух пациентов с синдромом Лёфгрена и увеитом без гистологического подтверждения саркоидоза, поиск микобактерий и грибов был отрицательным. При этом, у них не были обнаружены антитела, по наличию которых можно было бы предположить диагноз экзогенного аллергического альвеолита (EAA), хотя EAA и легочные микозы - очень редкие болезни в регионе, в котором проживали пациенты. Два пациента курили, 2 курили в прошлом и 14 никогда не курили. Девять пациентов были HLA-DR17+. Активность болезни была оценена на основании симптомов, рентгенограммы легких и исследования функции легких. Тринадцать пациентов имели активную болезнь (восемь из них были DR17+ и пять DR17-). Тринадцать здоровых взрослых были включены в группу контроля. Исследование было одобрено комитетом по этике.

Результаты

Пациенты с саркоидозом

Самые большие различия наблюдались для IFN-gamma и TNF-alpha, которые были произведены существенно большим количеством клеток ЖБАЛ. Когда CD4+ и CD8+ PBL и ЖБАЛ всех пациентов с саркоидозом были сравнены, было обнаружено значительно большее количество IFN-gamma+ клеток среди CD4 + клеток ЖБАЛ (69.1 %) чем среди CD4+ клеток PBL (19.0 %). Такая же закономерность наблюдалась для CD8+ клеток ЖБАЛ (86.8 %) по сравнению с CD8+ клетками PBL (65.8 %). Аналогично, имелось значительно большее количество клеток, производящих TNF-alpha среди CD4+ клеток ЖБАЛ (63.9 %) чем среди CD4+ клеток PBL (32.4 %) и среди CD8+ клеток ЖБАЛ (48.6 %) чем среди CD8+ клеток PBL (23.0 %). Напротив, имелось значительно меньшее количество IL-4+ клеток среди CD4+ клеток ЖБАЛ (2.0 %) чем среди CD4+ клеток PBL (4.9 %) и среди CD8+ клеток ЖБАЛ (1.4 %) чем среди CD8+ клеток PBL (4.4 %). Имелись значительно большее количество IL-2+ клеток среди CD8+ клеток ЖБАЛ (15.0 %) чем среди CD8+ клеток PBL (5.8 %). Результаты для IL-2 должны интерпретироваться с осторожностью, так как низкая интенсивность окрашивания этого цитокина сделала результаты очень чувствительными к выбору порога срабатывания фотодатчика. Поэтому, также был сделан анализ IL-2 MFI. Этот анализ не показал никаких существенных различий между различными субпопуляциями клеток или группами пациентов в отношении уровней IL-2 MFI.

Относительно различий между CD4+ и CD8+, было отмечено, что IFN-gamma был произведен значительно большим количеством CD8+ клеток как в PBL так и в ЖБАЛ. С другой стороны, IL-4 имел тенденцию производится относительно большим количеством CD4+ клеток как в PBL так и в ЖБАЛ. Соответствующие различия также наблюдались в группе контроля.

Исследуя различия между HLA-DR17+ и HLA DR17- пациентами, мы обнаружили значительно (p < 0.05) меньшее количество PBL IFN-gamma+ CD4+ клеток у DR17+ пациетов. У DR17- пациентов, имелась тенденция к более низкой экспрессии IL-2+ и IFN-gamma+ CD4+ клеток ЖБАЛ и TNF-alpha+ CD4+ CD8+ клеток ЖБАЛ, чем у DR17- пациентов. Эти результаты показывают тенденцию менее явного Th1 ответа у DR17+ пациентов.

Группа контроля по сравнению с пациентами с саркоидозом

Сравнивая PBL у пациентов c саркоидозом с группой контроля, мы обнаружили значительно большее количество IFN-gamma+ клеток у пациентов с саркоидозом чем в группе контроля, как для CD4+ (19.0 % против 5.8 %) и так и для CD8+ (65.8 % против 32.1 %). IL-4 также производился большим количеством клеток у пациентов с саркоидозом чем в группе контроля, как CD4+ (4.9 % и 2.0 %, соответственно) так и CD8+ клетками (4.4 % и 0.9 %, соответственно). Аналогично, имелось большее количество IL-2+ CD4+ клеток у пациентов с саркоидозом, чем в PBL группы контроля (19.2 % и 6.9 %, соответственно). В отношении TNF-alpha, не имелось никаких существенных различий между пациентами с саркоидозом и группой контроля.

Так как IFN-gamma и IL-4 производятся большим количеством клеток пациентов с саркоидозом чем в группе контроля, мы вычислили отношение IFN-gamma / IL-4 для различных типов клеток. Не имелось никаких существенных различий в отношении IFN-gamma / IL-4, когда CD4+ клетки PBL пациентов с саркоидозом (IFN-gamma / IL-4 = 4.0) сравнивались с CD4+ клетками группы контроля (IFN-gamma /IL-4 = 3.8) или когда CD8+ клетки PBL пациентов с саркоидозом (IFN-gamma / IL-4 = 16.0) сравнивались CD8+ клетками группы контроля (IFN-gamma / IL-4 = 28.6). Напротив, при сравнении CD4+ клеток ЖБАЛ и PBL пациентов с саркоидозом, мы обнаружили, что отношение IFN-gamma / IL-4 было намного выше в ЖБАЛ (IFN-gamma / IL-4 = 43.0) чем в PBL (IFN-gamma / IL-4 отношение = 4.0, p < 0.0001) и для ЖБАЛ CD8+ клеток (IFN-gamma / IL-4 = 48.6) чем для PBL CD8+ клеток (IFN-gamma / IL-4 = 16.0, p < 0.01).

Обсуждение

Профиль T-клеточных цитокинов в PBL и ЖБАЛ у пациентов с саркоидозом был определен с помощью проточной цитометрии. Мы изучали CD4+ и CD8+ клетки отдельно, используя внутриклеточное окрашивание цитокинов (IL-2, IL-4, IFN-gamma и TNF-alpha) и внеклеточное окрашивание поверхностных маркеров. По нашим данным, это первое применение экспериментального подхода для изучения субпопуляций T-клеток в легком и периферической крови при саркоидозе. Этот метод был выбран, чтобы получить лучшее отражение in vivo паттерна цитокинов, чем это может быть достигнуто при использовании других методов. Было обнаружено преобладание Th1 профиля у клеток ЖБАЛ по сравнению с PBL. Среди CD4+ и CD8+ наблюдались значительно больше число T-клеток, производящих IFN-gamma и TNF-alpha и значительно меньшее количество клеток, производящих IL-4. Самое высокое отношение IFN-gamma / IL-4 было обнаружено у CD8+ клеток ЖБАЛ. HLA-DR17+ пациенты, которые, как было ранее показано, имеют очень хороший прогноз (3), имели значительно меньшее количество CD4+ IFN-gamma+ клеток в PBL и тенденцию к менее явному Th1 ответу в ЖБАЛ. По сравнению с группой контроля, пациенты с саркоидозом имели большее количество T-клеток периферической крови, производящих IFN-gamma, IL-4 и IL-2.

Обнаружение внутриклеточных цитокинов с помощью пороточной цитометрии имеет ряд преимуществ по сравнению с другим методам оценки воспалительной функции клеток. Наш метод позволяет провести прямое определение функции клетки на уровне единственный клетки и позволяет изучать специфические субпопуляции клеток, опознаваемых по экспрессии некоторых маркеров на поверхности клеток, в сложных смесях воспалительных клеток (19). Пороточная цитометрия ранее успешно использовалась для исследования клеток ЖБАЛ (23). Однако, это - не прямое измерение in vivo уровня активации клеток, так как изучаемые клетки должны быть стимулированы in vitro, чтобы достичь обнаружаемых уровней цитокинов. Исследование шести пациентов с саркоидозом показало, что без такого возбуждения, можно обнаружить только IFN-gamma+ клетки ЖБАЛ (25). Фитогемагглютинин и иномицин рассматривается как наиболее надежные стимуляторы в большинстве исследований и имеются свидетельства, что паттерн цитокинов, наблюдаемый после стимуляции фитогемагглютинином и иномицином соответствует in vivo клеточному потенциалу производства цитокинов. Хотя фитогемагглютинин и иномицин - мощные стимуляторы, они недискриминационно активизируют все гены (26). Кроме того, клоны T-клеток имели одинаковый профиль цитокинов при стимуляции антигеном или фитогемагглютинином и иномицином (27).

Изучая CD4+ и CD8+ клетки отдельно, мы обнаружили преобладание Th1 профиля у клеток ЖБАЛ, принадлежащих обоим этим субпопуляциям. Самый высокий процент IFN-gamma+ клеток и самая низкая частота IL-4+ клеток, были найдены среди CD8+ клеток ЖБАЛ, что выдвигает на первый план потенциально важный вклад CD8+ T-клеток в Th1- воспалительный процесс, хотя CD4+ клетки более многочисленны. Такой взгляд на роль CD8+ клеток ЖБАЛ совместим с нашей недавней демонстрацией увеличения экспрессии CD26, предложенного в качестве маркера Th1, не только у CD4+ но и у CD8+ клеток ЖБАЛ при саркоидозе (28). Исследование, в котором это было обнаружено, также показало высокую экспрессию нескольких маркеров активации как у CD4+ так и у CD8+ T-клеток ЖБАЛ, а в некоторых случаях особенно у CD8+. Кроме того, паттерн экспрессии рецепторов IL-12 у CD4+ CD8+ T-клеток ЖБАЛ при саркоидозе подразумевает, что обе этих субпопуляции участвуют в производстве Th1 цитокинов (29). Функциональная роль CD4+ и CD8+ T-клеток при саркоидозе должны быть исследованны, но были вне возможностей нашего исследования. Однако, потенциал CD8+ клеток имеет важную роль при таком воспалении, что может быть продемонстрировано фактом, что у некоторых пациентов при саркоидном альвеолите доминируют CD8+ T-клетки (30). Предыдущие исследования, использовавшие другие методы, также поддерживают концепцию, что саркоидоз является Th1 болезнью, сообщая о увеличенном спонтанном производстве IL-2 и IFN-gamma T- клетками ЖБАЛ (7- 9), увеличенном производстве IFN-gamma клонами T-клеток ЖБАЛ (10, 11), паренхимы легкого (12) и увеличенном уровне Th1 цитокинов в ЖБАЛ (13, 14). Обнаружение преобладания Th1 мРНК и высоких уровней Th1 цитокинов в саркоидных лимфатических узлах также интерпретировалось как свидетельство Th1 процесса на участке формирования гранулемы (31, 32). Помимо увеличения числа IFN-gamma+ клеток в ЖБАЛ при саркоидозе, Th1 профиль ЖБАЛ клеток очевиден вследствие нашего обнаружения уменьшения частоты клеток, производящих IL-4 в легком. Исследования уровней IL-4 в ЖБАЛ (13, 14) и клонов T-клеток ЖБАЛ пациентов с саркоидозом (11), вообще не сумели обнаруживать любых различий между ЖБАЛ группы контроля и PBL соответственно, хотя в одном исследовании сообщалось об уменьшении уровня IL-4 в ЖБАЛ (33). В отношении IL-2, наши результаты должны интерпретироваться с осторожностью, по причинам, указанным в секции ''Результаты'', но наши данные согласуются с исследованием клонов T-клеток, показавшем, что производство IFN-gamma намного более обычно чем производство IL-2 клонами T-клеток ЖБАЛ(11). При интерпретации данных, также должно быть отмечено, что PBL у здоровых индивидуумов содержат в несколько раз большее количество клеток, производящих IFN-gamma чем производящих IL-4 клеток (34). В здоровом легком, проведение проточной цитометрии цитокинов выполнить трудно из-за низкого числа лимфоцитов, найденных в отсутствии альвеолита, хотя анализ клонируемых T-клеток указывает на увеличенную пропорцию IFN-gamma+ клеток в ЖБАЛ по сравнению с PBL (35).

Мы обнаружили, что частоты CD4+ и CD8+ IFN-gamma+ и IL-4+ T-клеток, были выше в периферической крови пациентов с саркоидозом, чем в группе контроля. Это также было истинно для IL-2 CD4+. Более высокое число клеток, производящих цитокины, обнаруженных в крови пациентов с саркоидозом, может отражать системный характер болезни и согласуется с нашими предыдущими данными (28) о более высом числе PBL T-клеток, положительных для различных маркеров активации у пациентов с саркоидозом, чем в крови здоровых индивидуумов. Однако, отношение IFN-gamma / IL-4 в PBL (отражающее баланс Th1/Th2) незначительно отличается между пациентами с саркоидозом и группой контроля. Напротив, имелся ясный Th1 уклон как CD4+ так и CD8+ клеток в легком по сравнению с периферической кровью у пациентов с саркоидозом (то есть уклон, ограниченный первичным очагом болезни).

Несмотря на общее согласие о преобладании Th1 инфильтратов в легких пациентов с саркоидозом, имеются противоречивые данные, касающиеся клеток ЖБАЛ, которые относились ко всему спектру от Th1 до Th2 (11, 12). Наше исследование, однако, ясно показывает, что подавляющее большинство T-клеток ЖБАЛ имеет тип Th1. Результаты других исследований, использующие методы клонирования, могут быть объяснены искажением профилей цитокинов в течение процесса клонирования. Кроме того, эффективность клонирования клеток ЖБАЛ более низкая, чем для PBL (11). Наши данные также согласуются с обнаружением увеличенных уровней Th1 цитокина IL-12 в клетках ЖБАЛ при саркоидозе (14).

Другие гранулематозные болезни, типа бериллиоза, туберкулеза и туберкулоидной лепры также характеризуются Th1 ответом. В этих болезнях, также как при саркоидозе, IFN-gamma может вносить вклад в формирование гранулем через воздействие на макрофаги (36).

Баланс Th1/Th2 в легком потенциально мог бы определять прогноз при саркоидозе. Наша гипотеза, что HLA-DR17+ и DR17- пациенты, резко отличающиеся по прогнозу (3), также отличаются по профилям цитокинов, не могла быть проверена в рамках настоящего исследования, так как не было обнаружено никаких существенных различий в частотах цитокин-положительных клеток ЖБАЛ между этими двумя группами пациентов. Однако, обнаружение тенденции менее явного Th1 ответа у DR17+ пациентов может объяснить хороший прогноз в этой группе. Наши данные в этом отношении согласуются с результами предыдущего исследования (33). Демонстрация, что пациенты со спонтанным разрешением болезни имели высокие уровни IgE и IgG₄ в ЖБАЛ, указывает на локальный Тh2 ответ. Так как наиболее поразительной находкой у DR17+ пациентов было очень большое накопление в ЖБАЛ V-alpha 2.3 CD4+ T-клеток (2), особый интерес предсталяет характеристика этих специфических клеток относительно их профиля цитокинов и фенотипа.

TNF-alpha может быть классифицирован как Th1 цитокин на основании его способности стимулировать макрофаги. При саркоидозе, увеличенное производство TNF-alpha альвеолярными макрофагами связано с увеличением риска прогресса болезни (37). К TNF-alpha проявляется специфический интерес из-за полиморфизма в области промотора гена TNF (15). Сообщалось об увеличенной частоте TNFA2 аллеля при синдроме Лёфгрена (38) и что этот аллель находится в неравновесном сцеплении с несколькими генами HLA, включая HLA-DR17, который связан с хорошим прогнозом (3, 17). Можно было бы предположить, что эта связь позволит делать хороший прогноз для DR17+ пациентов, если TNFA2 аллель был бы связан с изменением производства TNF-alpha T-клетками и/или макрофагами. Однако, мы не обнаружили никаких существенных различий у DR17+ и DR17- пациентов в производстве TNF-alpha. Поэтому, наши данные не поддерживают гипотезу, что HLA-DR17 связан с изменением производством TNF-alpha (через неравновесное сцепление с TNFA2 аллелем). Кажется более вероятным, что собственно свойства DR17 - молекулы, осуществляющей презентацию антигенных пептидов, могут объяснять спонтанное разрешение болезни у DR17+ пациентов.

Внутриклеточное окрашивание - ценный инструмент для характеристики иммунного ответа и ранее использовалось другими исследователями, чтобы проанализировать профили цитокинов T-клеток у здоровых индивидуумов. Частота производящих цитокины клеток, которые мы обнаружили в группе контроля, была в том же самом диапазоне, как сообщалось другими группами, использующими подобные протоколы (39). Кроме того, другие методы могут помочь объяснить возможные различия производства цитокинов в различных подгруппах пациентов. Также представляет интерес изучение более широкого диапазона цитокинов, например трансформирующего фактора роста бета, который производится клетками ЖБАЛ пациентов с активным саркоидозом, имеющих спонтанную ремиссию (42). Как было упомянуто ранее, также представляет интерес изучение специфических субпопуляций T-клеток, в особенности V-alpha 2.3+ клеток, которые накапливаются в легких DR17+ пациентов.

Используя внутриклеточную проточную цитометрию, мы продемонстрировали значительно большее количество клеток ЖБАЛ, производящих IFN-gamma и TNF-alpha (как CD4+ так и CD8+) чем в тех же субпопуляциях в PBL у пациентов с саркоидозом и значительно меньшее количество IL-4+ клеток. Таким образом, обе субпопуляции T-клеток в ЖБАЛ демонстрируют Th1 профиль цитокинов, предполагая что не только CD4+ но и CD8+ клетки могут играть важную роль в воспалительном процессе в легких пациентов с саркоидозом. Увеличенное число клеток, производящих цитокины, в периферийной крови пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля, может отражать системный характер болезни. Дальнейшее изучение специфических субпопуляций T-клеток должно помочь в объяснении патогенных механизмом саркоидоза.