Am. J. Respir. Crit. Care Med., Volume 161, Number 5, May 2000, 1636-1642

CD13 / аминопептидаза N, хемоаттрактант Т-лимфоцитов при легочном саркоидозе

KENJI TANI, FUMITAKA OGUSHI, LUPING HUANG, TETSUYA KAWANO, HIROYA TADA, NORIMITSU HARIGUCHI, and SABURO SONE
Third Department of Internal Medicine, School of Medicine, Tokushima University, Tokushima, Japan

Реферат

CD13 / аминопептидаза N (E.C.3.4.11.2) - эктоэнзим, расположенный на наружной мембране различных клеток. Поскольку было показано, что экспрессия аминопептидазы регулируется Th1 цитокином IFN-gamma, мы исследовали роль CD13 / аминопептидазы N при легочном саркоидозе. Активность аминопептидазы в бронхоальвеолярном лаваже (ЖБАЛ) была значительно выше у пациентов с саркоидозом чем у здоровых добровольцев и в групе контроля. Активность значительно коррелировала с процентом лимфоцитов и отношением CD4+/CD8+ в ЖБАЛ и была выше у пациентов с саркоидозом с паренхиматозным вовлечением. CD13 / аминопептидаза N - протеин, имеющий молекулярную массу приблизительно 150 kD, был обнаружен у альвеолярных макрофагов (АМ) у пациентов с саркоидозом с более высокими уровнями, чем в группе контроля. CD13 / аминопептидаза N индуцировала in vitro хемотаксическую миграцию лимфоцитов человека в диапазоне концентраций от 10-5 до 10-1 U/ml. Хемотаксическая активность была больше для CD4+ Т-лимфоцитов чем для CD8+. Ферментативная активность CD13 / аминопептидазы N была ответствена за хемотаксическую активность, так как бестатин, ингибитор CD13 / аминопептидазы N, ингибировал хемотаксическую активность. Увеличение хемотаксической активности лимфоцитов было обнаружено в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля и активность значительно уменьшалась при лечении бестатином. Это исследование указывает, что экспрессия CD13 / аминопептидазы N может играть важную роль в вовлечении T-лимфоцитов при легочном саркоидозе и в патогенезе альвеолита в этой болезни.

Введение

Аминопептидаза N - мембраносвязанная металлопротеиназа, как было показано в (1) идентичная CD13, 150-kD поверхностному гликопротеиду, который первоначально использовался как маркер субпопуляций кроветворных клеток (2). CD13 / аминопептидаза N широко распространена в различных клетках млекопитающих - моноцитах / макрофагах, фибробластах, нейтрофилах, эндотелиальных клетках и эпителиоцитах (3, 4). CD13 / аминопептидаза N - рецептор человеческого коронавируса (5) и играет важную роль при начале ВИЧ (6). Было показано, что эта пептидаза участвует в процессе деградации внеклеточного матрикса при инвазии опухоли (7) и в производстве пептидов клетками, производящими презентацию антигена (8). Хотя имеется мало информации относительно регулирования экспрессии CD13 / аминопептидазы N, недавние исследования показали, что лимфокины IFN-gamma и IL-4 увеличивают экспрессию CD13 / аминопептидазы N у всех типов клеток (3, 9).

Саркоидоз - хроническая воспалительная болезнь, при которой имеется системный гранулематозный процесс и наиболее часто при этой болезни вовлекаются легкие. Паренхиматозные повреждения легкого у пациентов с саркоидозом характеризованы альвеолитом, связанным с мононуклеарными инфильтратами и формированием неказеозных гранулем и, у некоторых пациентов, легочного фиброза (10). Хотя триггер саркоидоза все еще не найден, лимфокины, производимые активизированными CD4+ Т-лимфоцитами играют главую роль в воспалительном процессе при этой болезни. CD4+ Т-лимфоциты могут быть разделены на две различных популяции, Th1 и Th2, определяемым по спектру цитокинов, производимыми этими клетками (11). Th1 клетки производят IL-2, IFN-gamma и фактор некроза опухоли бета и стимулируют клеточный иммунитет, принимая во внимание, что Th2 клетки производят IL-4, IL-5, IL-6 и IL-10 и играют важную роль в гуморальном иммунитете и аллергических болезнях (12). Имеются доказательства, что баланс различных цитокинов является важным для эффективной иммунной реакции и исхода инфекционных и аутоиммуннных болезней (13, 14). При саркоидозе преобладает Th1 ответ, поскольку лимфоциты в легком у пациентов с саркоидозом производят чрезмерные количества IFN-gamma и IL-2 (15). Th1 цитокины могут участвовать в активации макрофагов в местах воспаления и формировании гранулем (15). В этом исследовании мы обнаружили увеличенную активность аминопептидазы в ЖБАЛ и увеличенную экспрессию белка CD13 / аминопептидазы N у альвеолярных макрофагов у пациентов с саркоидозом, что коррелировано с активностью альвеолита. Кроме того, мы продемонстрировали, что CD13 / аминопептидаза N может играть значительную роль в патогенезе саркоидоза как хемоаттрактант T-клеткок.

Пациенты с саркоидозом

В исследовании участвовало 30 пациентов с саркоидозом. Диагноз саркоидоз был основан на ранее опубликованных клинических и гистологических критериях (10). Ни один пациент не получил кортикостероидную терапию до выполнения бронхоальвеолярного лаважа.

Группа контроля

Группа контроля состояла из 13 здоровых, некурящих добровольцев мужчин и 10 пациентов с другими болезнями (шесть мужчин и четыре женщины). Ни один из группы контроля не имел ненормальностей при физикальной экспертизе, рентгенограмме легких или исследовании функции легкого. Все пациенты группы контроля не имели интерстициальных болезней легкого; восемь имели рак легкого и два не имели никаких обнаруживаемых повреждений в легких, хотя имели кровь в мокроте.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Активность аминопептидазы в ЖБАЛ

Очень низкая активность аминопептидазы была обнаружена в ЖБАЛ в группе контроля и пациентов группы контроля (6.8 ± 2.0, 9.1 ± 5.9 nmol/h, соответственно). Среднее значение активности аминопептидазы в ЖБАЛ у пациентов с саркоидозом было значительно выше (49.9 ± 10.8 nmol/h) чем в группе контроля и пациентов группы контроля, но индивидуальные различия были очень большими, от 6 до 221 nmol/h.

Сравнение активности аминопептидазы в ЖБАЛ с другими параметрами у пациентов с саркоидозом

Активность легочного саркоидоза, которая оценивается клиническим, рентренографическими и физиологическими маркерами, является важной в предсказании прогресса болезни и отдаленного прогноза. Предыдущие отчеты показали, что число лимфоцитов, особенно CD4+ в ЖБАЛ является полезным в определении активности альвеолита при саркоидозе, серологические уровни АПФ также полезны при определении активности (24). Поэтому, чтобы определить значение активности аминопептидазы при саркоидозе, корреляцию активности аминопептидазы с процентом лимфоцитов в ЖБАЛ, были исследованы отношение CD4+/CD8+ в ЖБАЛ и серологический уровень АПФ. Активность аминопептидазы в ЖБАЛ имела значительную положительную корреляцию с процентом лимфоцитов и отношением CD4+/CD8+. Однако, не имелось никакой значительной корреляции между активностью аминопептидазы и серологическим уровнем АПФ (r = +0.356, p > 0.05). Значительные корреляции между активностью аминопептидазы и процентом лимфоцитов (r = +0.428, p = 0.0407) или отношением CD4+/CD8+ (r = +0.432, p = 0.030) также наблюдались у пациентов, чей ЖБАЛ имел высокую активность аминопептидазы (>= 18 nmol/h, n = 17). Не имелось значительных различий в активности аминопептидазы между мужчинами и женщинами и между курящими и некурящими пациентами с саркоидозом. Не имелось никакой значительной корреляции между активностью аминопептидазы и возрастом.

Пациенты с саркоидозом были классифицированы в две рентгенографические группы: Группа I без паренхиматозного вовлечения (Стадия I) и Группа II с паренхиматозным вовлечением (Стадия II/III). В соответствии с этой классификацией, 15 пациентов входили Группу I и 15 в Группу II. Значительного различия в среднем возрасте между этими двумя группами не имелось. Уровень активности аминопептидазы в ЖБАЛ был значительно выше в Группе II чем в Группе I. Процент лимфоцитов и отношение CD4+/CD8+ также было выше в Группе II чем в Группе I. Не имелось никакого значительного различия в серологическом уровне АПФ между этими двумя группами. Мы измерили Th1 цитокины; но ни IFN-gamma ни IL-2 не были обнаружены в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом.

Серологическая активность аминопептидазы

Была измерена активность серологической аминопептидазы, чтобы определить, отражается ли эта активность на ЖБАЛ. Мы провели измерение у 3 здоровых индивидуумов группы контроля, 3 пациентов группы контроля и 14 пациентов с саркоидозом и выполнили БАЛ. Не имелось никакого значительного различия в активности аминопептидазы в группе контроля и пациентов группы контроля и пациентов с саркоидозом (145.3±21.3, 188.3±40.1, 178.0±18.3 nmol/h, соответственно). Не имелось значительной корреляции между активностью серологической аминопептидазы и ЖБАЛ у пациентов с саркоидозом (r = 0.091, p > 0.05).

Экспрессия CD13/аминопептидазы N у АМ

Поскольку CD13/аминопептидаза N, как известно, экпрессируется на моноцитах / макрофагах (9), экспрессия CD13/аминопептидазы N в АМ была обнаружена с помощью вестерн-блоттинга. Когда 50 µg лизата АМ были разделены с помошью SDS-PAGE, CD13/аминопептидаза N, имеющая молекулярную массу приблизительно 150 kD, была обнаружена в группе контроля в очень низких уровнях. Лизат АМ у шести из семи пациентов с саркоидозом, содержал большее количество CD13. Увеличенная активность аминопептидазы в ЖБАЛ была обнаружена у шести пациентов с саркоидозом и соответствовала результатам экспрессии CD13/аминопептидазы N у АМ.

Хемотаксическая активность CD13/аминопептидазы N для Т-лимфоцитов

CD13/аминопептидаза N индуцирует хемотаксическую миграцию лимфоцитов в диапазоне концентрации от 10-5 до 10-1 U/ml. Хемотаксическая активность, индуцированная CD13 / аминопептидазой N в диапазоне концентрации от 10-4 до 10-2 U/ml была эквивалентена 50 ng/ml MIP-1. Анализ оказал, что действие CD13/аминопептидазы N было скорее хемотаксическим чем хемокинетическим. Поскольку имелось соответствие между хемотаксическим ответом и ферментативной активностью, мы исследовали связь хемотаксической активности CD13/аминопептидазы N с ее ферментативной активностью, используя бестатин, специфический ингибитор аминопептидаз. Ингибирование ферментативной активности CD13/аминопептидазы N бестатином на 96 % вело к инактивации на 93 % ее хемотаксической активности для лимфоцитов. Бестатин не ингибировал хемотаксическую активность MIP-1. CD13/аминопептидаза N также проявила хемотаксическая активность для очищенных CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов в диапазоне концентраций от 10-4 до 10-1 U/ml и 10-3 до 10-1 U/ml, соответственно, но ответ CD4+ T клеток был больше чем у CD8+ T клеток.

Влияние бестатина на ферментативную и хемотаксическую активность ЖБАЛ

ЖБАЛ 6 пациентов с саркоидозом, имевший высокую активность аминопептидазы и ЖБАЛ 3 здоровых индивидуумов группы контроля, обрабатывались бестатином и затем проверялсь на ферментативную и хемотаксическую активность. Обработка ЖБАЛ пациентов с саркоидозом бестатином приводила к ингибированию активности аминопептидазы в ЖБАЛ (от 85 до 93 %). Хемотаксическая активность для лимфоцитов была обнаружена в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом, но не у здоровых индивидуумов группы контроля и обработка ЖБАЛ пациентов с саркоидозом бестатином привела к ингибированию хемотаксической активности (от 43 до 74 %). Хемотаксическая активность MIP-1, который, как было показано, производится в легких при саркоидозе (25), не уменьшалась при обработке бестатином, указывая, что бестатин может быть специфическим ингибитором хемотаксической активности аминопептидазы в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом.

Обсуждение

Мы обнаружили значительно большую активность аминопептидазы в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом чем в группе контроля. Активность коррелировала с процентом лимфоцитов и отношением CD4+/CD8+ в ЖБАЛ, и, кроме того, активность была значительно выше у пациентов с саркоидозом с паренхиматозным вовлечением. Эти результаты говорят, что активность аминопептидазы в ЖБАЛ соответствует активности альвеолита, наблюдаемого при саркоидозе.

Мы установили, что CD13/аминопептидаза N является хемоаттрактантом для Т-лимфоцитов. Интересно, что хемотаксическая активность была больше для CD4+ чем для CD8+ T клеток. Мы не смогли обнаружить хемотаксис моноцитов или нейтрофилов CD13/аминопептидазой N. Ингибирование ферментативной активности CD13/аминопептидазы N бестатином приводило к ингибированию хемотаксической активности, что позволяет предположить, что ферментативная активность CD13/аминопептидазы N требуется для хемотаксической активности T-клеток. Недавно мы сообщили, что катепсин G и CAP37 / азуроцидин, которые являются нейтрофил-производными протеазами, являются факторами хемотаксиса для мононуклеарных клеток и нейтрофилов и их ферментативная активность требуются для хемотаксической активности (26, 27). Сообщалось, что тромбин, трипсин-подобная протеаза (альфа-амино-бета-оксипропионовая кислота), имеет хемотаксическую активность для моноцитов, комплексы тромбина с ингибиторами тромбина типа антитромбина III и гирудина показали меньшую хемотаксическую активность (28).

Мы показали, что CD13/аминопептидаза N является хемотаксисом для лимфоцитов в концентрации >10- 5 U/ml, для CD4+ и CD8+ в концентрации >10-4 U/ml и >10-3 U/ml, соответственно. Хотя процедура очистки CD4+ и CD8+ клеток может частично уменьшать реактивность клеток к хемоаттрактантам, в настоящее время мы не можем объяснить существующие различия относительно требуемых концентраций.

ЖБАЛ пациентов с саркоидозом имел высокую хемотаксическую активность для лимфоцитов по сравнению с группой контроля. Бестанин частично уменьшал его хемотаксическую активность. Эти результаты указывают, что CD13/аминопептидаза N ответственна, по крайней мере частично, за хемотаксическую активность лимфоцитов ЖБАЛ у пациентов с саркоидозом. Хотя различные хемотаксические факторы, включая IL-8, IL-15 и MIP-1 альфа и бета являются хемоаттрактантами для лимфоцитов (22), это исследование говорит, что CD13/аминопептидаза N может играть значительную роль в участии T-лимфоцитов как хемоаттрактантов при легочном саркоидозе.

Активизированные макрофаги имеют важную роль в инициировании и усилении иммунологических и воспалительных ответов при различных воспалительных болезнях легкого, включая саркоидоз (10, 29). При саркоидозе, Т-лимфоциты и макрофаги играют стержневую роль в организации воспалительного процесса. Было показано, что экспрессия CD13/ аминопептидазы N у макрофагов является маркером их зрелости или активации (4). В этом исследовании, CD13/аминопептидаза N была обнаружена у шести из семи пациентов с саркоидозом, чей ЖБАЛ имел высокую активность аминопептидазы, указывая, что альвеолярные макрофаги могут быть ответствены, по крайней мере частично, за активность аминопептидазы, обнаруженной в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом. Однако, в дальнейших исследованиях необходимо разъяснить механизм освобождения CD13/аминопептидазы N из клеточной мембраны при легочном саркоидозе.

Серологический уровень аминопептидазы у пациентов с саркоидозом не был повышен по сравнению с группой контроля. Семейство аминопептидаз главным образом состоит из лейцин аминопептидазы (E.C.3.4.11.1), CD13/аминопептидазы N (E.C.3.4.11.2) и цистил аминопептидазы (E.C.3.4.11.3) (30). L-лейцин-AMC, которая использовалась в этом исследовании как субстрат, чтобы обнаружить активность аминопептидазы, могла быть расщеплена всеми этими аминопептидазами (9). Недавние отчеты показали, что серологическая активность аминопептидазы главным образом может быть приписана CD13/аминопептидазе N (31). Это исследование показало, что экспрессия CD13 может быть обнаружена у АМ пациентов с саркоидозом. Эти результаты говорят, что аминопептидаза в ЖБАЛ может быть произведена в легком локально.

Было показано, что аминопептидаза и mRNA индуцируются IFN-gamma (3). IFN-gamma не был обнаружен в ЖБАЛ у пациентов с саркоидозом в этом исследовании (предел чувствительности 20 pg/ml). В другом исследовании, IFN-gamma был обнаружен в сконцентрированном в 5 или 10 раз ЖБАЛ у 12 из 21 пациента с подтвержденным саркоидозом (предел чувствительности 0.4 pg/ml) (33), предполагая, что уровень IFN-gamma может быть более низким чем предел чувствительности в нашем исследовании. Таким образом, все еще возможно, что Th1 цитокины являются ответственными за увеличение активности CD13 / аминопептидазы N в ЖБАЛ у пациентов с саркоидозом. Мы обнаружили, что ЖБАЛ, пациентов с активным легочным саркоидозом, имеет увеличенную активность CD13/аминопептидазы N на моноциты (неопубликованное наблюдение), указывая что фактор(ы), которые участвуют в экспрессии CD13/аминопептидазы N, могут присутствовать при легочном саркоидозе.

Уровни ангиотензинпревращающего фермента, который, как известно, производится эпителиоидными клетками гранулем, выше при клинически активной, чем при бездействующей болезни (34). Однако, в этом исследовании, не имелось никакого значительного увеличения серологических уровней АПФ у пациентов с паренхиматозным вовлечением, что соответствовало предыдущим отчетам, которые показали, что серологические уровни АПФ отражают степень поражения гранулемами всего организма, а не только степень вовлечения легкого, и что измерение серологических уровней АПФ более полезено при мониторинге активности болезни (35). Уровни CD13/аминопептидазы N в ЖБАЛ могут быть более специфическим маркером степени вовлечения легкого при саркоидозе чем серологический уровень АПФ.

Данные, представленные здесь дают возможность, что активность CD13/ аминопептидазы N может служить маркером активности альвеолита при саркоидозе и предполагают, что CD13/аминопептидаза N может участвовать в T-клеточном механизме развития этой болезни. Увеличенная активность аминопептидазы в ЖБАЛ наблюдается не только у пациентов с саркоидозом, но также и при других интерстициальных болезнях легкого типа идиопатического легочного фиброза, облитерирующего бронхиолита и сосудистых болезнях с интерстициальной пневмонией (неопубликованное наблюдение). Поэтому, возможно, что CD13/аминопептидаза N играет важную роль в привлечении лимфоцитов при различных интерстициальных болезнях легкого. Понимание регулирования производства и действия этого фермента может привести к новым способам контроля и лечения интерстициальных болезней легкого.