Thorax 2003;58:519-524

Увеличенная экспрессия интерлейкина-13 у пациентов с саркоидозом

H-P Hauber, D Gholami, A Meyer and A Pforte
Department of Internal Medicine, University Hospital Eppendorf, Hamburg, Germany

Реферат

Введение: саркоидоз - системная гранулематозная болезнь неизвестного происхождения. Лимфоцитарное воспаление регулируется экспрессией Th1 цитокинов, такими как фактор некроза опухоли альфа (TNF-alpha). Интерлейкин 13 (IL-13) - Th2 цитокин, который, как было показано, подавляет TNF-alpha. Мы исследовали роль IL-13 как возможного противовоспалительного цитокина при саркоидозе. Методы: экспрессия мРНК IL-13, IL-4, IL-10 и TNF-alpha у клеток бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) и мононуклеарных клетках периферической крови (PBM) у 18 пациентов с саркоидозом и 9 здоровых индивидуумов группы контроля была оценена с использованием RT-PCR. Кроме того, уровни IL-13 в супернатанте культуры клеток БАЛ 12 пациентов и группы контроля были измерены, и иммуноцитометрия IL-13 была выполнена в клетках БАЛ 8 пациентов. Уровни TNF-alpha были измерены с и без стимуляции рекомбинантным человеческим IL-13 (rhIL-13), rhIL-10 и липополисахаридом (LPS). Результаты: экспрессия мРНК IL-13 была значительно увеличена у клеток БАЛ и PBM пациентов по сравнению с группой контроля (p < 0.05). Никаких значительных различий не было обнаружено в экспрессии мРНК IL-4 или мРНК IL-10 у клеток БАЛ или PBM между этими двумя группами. Экспрессия мРНК TNF-alpha была значительно выше у клеток БАЛ пациентов, чем в группе контроля (p < 0.05). Уровни IL-13 в супернатанте культуры клеток БАЛ были слегка увеличены у половины исследованных пациентов, но только у 2 индивидуумов в группе контроля. Иммуноцитометрический анализ обнаружил IL-13 в альвеолярных макрофагах пациентов. IL-13 уменьшал уровни TNF-alpha (p < 0.05). Заключение: экспрессия IL-13 увеличена у клеток БАЛ и PBM при саркоидозе и IL-13 секретируется клетками БАЛ. Альвеолярные макрофаги могут быть клеточным источником IL-13. Эти данные говорят, что IL-13 может иметь противовоспалительный эффект, действуя на TNF-alpha.

Введение

Саркоидоз - системная гранулематозная болезнь, которая часто вовлекает легкие и внутригрудные лимфатические узлы (1). Хотя этиология этой болезни остается неизвестной, недавние исследования, дали определенное понимание ее патофизиологии. Текущая концепция состоит в том, что альвеолярные макрофаги, клетки T-хелпер (CD4+) и каскад произведенных ими цитокинов совместно производят воспалительный процесс. Было обнаружено спонтанное производство Th1 цитокинов, таких как интерферон-гамма и интерлейкин-2 T-клетками БАЛ (2, 3). Moller обнаружил более высокую экспрессию IL-12p40 мРНК в клетках БАЛ пациентов с саркоидозом чем в группе контроля (4). Этот увеличенный уровень IL-12 производит дисрегуляцию развития Th1 клеток и усиливает производство Th1 цитокинов. Альвеолярные макрофаги производят множество цитокинов, таких как фактор некроза опухоли альфа (TNF-alpha) и IL-6 (5-7). TNF-alpha, в частности, при саркоидозе имеет очень высокие уровни и может быть ответственен за хроническую усталость, часто замеченную у пациентов саркоидозом, хотя соответствующее влияние на катехины очевидно отсутствует (8). Более 80 % пациентов не страдают от серьезной болезни и клинические симптомы обычно умеренные или наблюдается спонтанная ремиссиия. Поэтому возможно, что белки, связывающие или нейтрализующие TNF-alpha или противорегулирующие цитокины, производятся одновременно. Увеличенные уровни растворимых рецепторов TNF (TNF-R), были обнаружены в плазме БАЛ пациентов с саркоидозом (10,11). Armb (12) обнаружил, что растворимые TNF-R могут ингибировать биоактивность TNF-alpha в легких пациентов с саркоидозом.

Противовоспалительные цитокины охарактеризованы плохо. Доступна лишь информация о трансформирующем фактор роста бета (TGF-beta) и IL-10. Увеличенные уровни TGF-beta были обнаружены в БАЛ пациентов с саркоидозом (13), но недавнее исследование также сообщило об увеличенных уровнях TGF-beta в БАЛ пациентов с измененной функцией легких (14). Поэтому роль TGF-beta еще окончательно не определена. Увеличенная секреция IL-10 наблюдается у альвеолярных макрофагов, но не у клеток БАЛ пациентов с саркоидозом (13,15).

IL-13 - недавно описанный цитокин, который имеет некоторые общие эффекты с IL-4 (16,17). Главным образом он производится CD4+ клетками (18,19) и было показано, что он вовлечен в патогенез бронхиальной астмы (20). Предыдущие исследования обнаружили, что IL-13 может подавлять секрецию TNF-alpha моноцитами у здоровых пациентов (21), поэтому он может иметь противовоспалительное действие и влиять на Th1 иммунную реакцию при саркоидозе.

Поскольку информация о IL-13 при саркоидозе скудна, была исследована экспрессия мРНК у клеток БАЛ и PBM у пациентов с саркоидозом и группе контроля. Экспрессия мРНК IL-4 и IL-10 также были определены, чтобы оценить, могли бы эти цитокины вносить вклад в подавление провоспалительных реакций при саркоидозе. Экспрессия мРНК TNF-alpha также была исследована. Уровни IL-13 были измерены в супернатанте культуры клеток БАЛ. Для идентификации клеточного источника IL-13 в БАЛ была выполнена иммуноцитомерия. Чтобы исследовать влияние IL-13 на секрецию TNF-alpha, культуры клеток БАЛ пациентов с саркоидозом были культивированы с рекомбинантом человеческого IL-13 (rhIL-13) или рекомбинантом человеческого IL-10 (rhIL-10).

Пациенты и группа контроля

Были исследованы 18 пациентов (10 мужчин), средний возраст 40 лет (диапазон 23-57 лет) с саркоидозом. Диагноз саркоидоз был установлен по клиническим признакам, результатам гистологического исследования и рентгенограмме легких. Отношение CD4/CD8 было определено с помощью иммуноцитохимического анализа. Средний уровень АПФ был 60.6 U/l. У 6 пациентов была стадия I, у 9 стадия II и у 3 стадия III. У 6 пациентов проводилось лечение кортикостероидами. Ни один пациент не имел клинических симптомов аллергии.

В группу контроля вошли 9 здоровых добровольцев (5 мужчин), средний возраст 27.5 лет (диапазон 21-31 лет). Они не имели клинических признаков болезни легкого или аллергии.

Была проведена спирометрия, плетизмография и оценка газообмена капиллярной крови (BodyScope, Medizin Elektronic GmbH, Германия). FEV1, VC и TLCO использовались, чтобы описать статус пациентов, FEV1 и VC были измерены в группе. TLCO был определен у 11 пациентов.

Результаты

Полный и дифференциальный индекс клеток в БАЛ и PBM, отношение CD4/CD8, FEV1, VC и TLCO

Отношение CD4/CD8 в группе пациентов было 3.8 (0.7). VC 89.1 %, в группе пациентов и 95.5 % в группе контроля; FEV1 81.6 % у пациентов и 100.3 % группе контроля; TLCO 80.8 % в группе пациентов.

Экспрессия IL-13, IL-4, IL-10 и мРНК TNF-alpha

У всех кроме 3 пациентов, была обнаружена экспрессию мРНК IL-13 у клеток БАЛ со средним отношением IL-13:бета-актин 0.44, принимая во внимание, что клетки БАЛ только 3 индивидуумов группы контроля имели экспрессию IL-13. У PBM 7 пациентов не была обнаружена экспрессия IL-13, в то время как другие пациенты имели сильную экспрессию. Среднее отношение IL-13:бета-актин было 0.45. Экспрессия IL-13 была обнаружена у PBM только 3 индивидуумов группы контроля. Различия между двумя группами у клеток БАЛ и PBM были статистически значимы (p < 0.05). Дальнейший анализ экспрессии мРНК IL-13 у клеток БАЛ пациентов был выполнен, сравнивая пациентов со стадией I и стадией II/III болезни. Экспрессия мРНК IL-13 в группе со стадией I болезни была значительно больше по сравнению с группой со стадией II/III болезни (0.76 и 0.27, соответственно; p < 0.05). Не имелось значительного различия экспрессия мРНК IL-13 у клеток БАЛ между пациентами, леченными кортикостероидами и нелеченными пациентами.

мРНК IL-4 была экспрессирована у клеток БАЛ только 3 пациентов. У других пациентов мРНК IL-4 не была обнаружена. Среднее отношение IL-4:бета-актин для всей группы было 0.04. мРНК IL-4 не была экспрессирована у клеток БАЛ у 5 индивидуумов в группе контроля, у которых это измерение проводилось. У PBM всех пациентов кроме трех, мРНК IL-4 была экспрессирована со средним отношением IL-4:бета-актин 0.75. В группе контроля IL-4 был сильно экспресссирован у PBM со средним отношением IL-4:бета-актин 0.66. Однако, различия между клетками БАЛ и PBM пациентов и группой контроля не были статистически значимы.

Экспрессия мРНК IL-10 была обнаружена у клеток БАЛ 2 пациентов с отношением IL-10:бета-актин 0.45 и 0.39. В группе контроля IL-10 также был экспрессирован у клеток БАЛ только 2 добровольцев с более низким отношением IL-10:бета-актин 0.02 и 0.09. IL-10 был экспрессирован у PBM 3 пациентов с отношением 0.12, 0.05, и 0.16. Очень слабая экспрессия IL-10 была обнаружена у PBM 6 индивидуумов группы контроля (< 0.01).

мРНК TNF-alpha была экспрессирована у клеток БАЛ всех пациентов кроме одного, со средним отношением TNF-alpha:бета-актин 0.58. В группе контроля экспрессия мРНК TNF-alpha была обнаружена у приблизительно половины клеток БАЛ со средним значением 0.14. Это различие было статистически значимым (p < 0.05). мРНК TNF-alpha была экспрессирована у PBM у 11 пациентов со средним значением 0.35. В группе контроля мРНК TNF-alpha была экспрессирована у PBM у 2 из 5 пациентов, со средним значением 0.17. Это различие не было статистически значимым.

Уровни IL-13 в супернатанте культуры клеток БАЛ

Уровни IL-13 в супернатанте культуры клеток БАЛ были немного увеличены у 6 из 12 пациентов (диапазон 6.01-27.70 pg/ml). Только двое из группы контроля имели увеличенные уровни IL-13 (12.97 pg/ml и 18.75 pg/ml).

IL-13 в клетках БАЛ пациентов

Иммуноцитохимическое исследование IL-13 в клетках БАЛ 8 пациентов показало положительное окрашивание 30.5 % альвеолярных макрофагов. Также было окрашено несколько лимфоцитов, но интенсивность была намного ниже чем у альвеолярных макрофагов.

Влияние стимуляции LPS/RHIL-13/RHIL-10 на секрецию TNF-alpha

После 18 часов инкубации с RhIL-13 или RhIL-10, уровни TNF-alpha в супернатанте культуры клеток БАЛ уменьшились по сравнению с нестимулированными клетками. Средний уровень TNF-alpha был 1068.12 pg/ml в нестимулируемых клетках, 909.43 pg/ml в клетках, стимулируемых RhIL-13 (n=12; p < 0.05) и 959.92 pg/ml в клетках стимулированных RhIL-10 (n=6; p < 0.05). Стимуляция LPS значительно увеличила уровни TNF-alpha по сравнению с нестимулированными клетками (1713.24 pg/ml; n=6; p < 0.05). Добавление RhIL-13 значительно уменьшало уровни TNF-alpha в стимулированной LPS культуре клеток БАЛ (1202.86 pg/ml; n=6; p < 0.05).

Обсуждение

Воспаление при саркоидозе главным образом производят Th1 цитокины IL-1, IL-2, IL-6, IFN-gamma и TNF-alpha, которые имеют провоспалительное действие (2-5). Так как пациенты часто имеют умеренные симптомы, было предложено существование противорегулирующих механизмов, например противовоспалительных цитокинов. Однако, информация об этих цитокинах при саркоидозе скудна. TNF-R, TGF-beta 1 и IL-10 были исследованы как возможные противовоспалительные медиаторы. Увеличенные уровни TNF-RS были замечены в плазме и БАЛ пациентов с саркоидозом (11). Armb с коллегами (12) показал, что биоактивность TNF-alpha в легких пациентов с саркоидозом уменьшается при увеличенных уровнях растворимых TNF-R. Это ингибирование может быть более сильным в стадии I болезни, чем в стадии II/III, указывая на существование гомеостатического механизма, который защищает легкое от чрезмерного производства TNF-alpha. Сообщалось об увеличенной концентрации TGF-beta 1 в супернатанте культуры клеток БАЛ (13). Экспрессия TGF-beta 1 может участвовать в регрессе саркоидных гранулем, путем инициации фиброза и атрофии эпителиоидных клеток (24). Однако, уровни TGF-beta 1 также увеличены в БАЛ пациентов с саркоидозом с измененной функцией легкого, поддерживая гипотезу, что сверхсинтез TGF-beta 1 связан с ухудшением функции легкого у этих пациентов (14). Секреция IL-10 увеличена у альвеолярных макрофагов (15), но не у клеток БАЛ пациентов с саркоидозом (13).

IL-13 удобен для исследования пациентов с саркоидозом по нескольким причинам: (1) он главным образом производится CD4+ T клетками, число которых увеличено в БАЛ пациентов с саркоидозом; (2) пациенты с саркоидозом страдают от гиперреактивности бронхов более часто, чем в среднем по популяции (23 % и 11-14 %) (25); и (3) IL-13 ингибирует производство TNF-alpha моноцитами (21).

В этом исследовании экспрессия мРНК IL-13 была значительно увеличена у клеток БАЛ и PBM пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля. Этот эффект может быть частично регулироваться IL-13, так как этот медиатор участвует патогенезе гиперреактивности бронхов (20), которая более часто происходит у пациентов с саркоидозом чем в во всей популяции (25). Воспалительная реакция в легком при астме регулируется Th2 цитокинами, IL-13 и IL-4. Никаких значительных различий в экспрессии IL-4 в клетках БАЛ и PBM не было обнаружено между пациентами и группой контроля, что говорит о том, что IL-4 не участвует в патофизиологии саркоидной реакции. Это обнаружение поддерживает данные, что IL-13 может быть главным медиатором, ведущим к увеличению реактивности бронхов у пациентов с саркоидозом. Кроме того, у этих пациентов часто обнаруживают увеличенные уровни IgE. IL-4 не вызывает увеличение уровней IgE, потому что экспрессия IL-4 не была увеличена в PBM этих пациентов. Мы также обнаружили увеличенные уровни IgE у 10 пациентов (данные не показаны) но не имелось значительной корреляции между серологическими уровнями IgE и экспрессией IL-13 (или IL-4) у PBM. Однако, это не исключает возможность, что увеличение экспрессии IL-13 у PBM может вызывать увеличение уровней IgE, таким образом косвенно способствуя увеличению реактивности броонхов при саркоидозе.

Как и ожидалось, процент лимфоцитов был выше в группе пациентов чем в группе контроля. Это могло бы вносить в увеличение экспрессии IL-13 в группе пациентов, но Prasse (26) недавно сообщил, что экспрессия IL-4 и IL-13 в БАЛ, измеренная с помощью проточной цитометрии, не была увеличена у пациентов с саркоидозом. Кроме того, в нашем исследовании экспрессия IL-13 у PBM была увеличена у пациентов, хотя процент лимфоцитов был более низким, чем в группе контроля (20 % и 57 %). Лимфоциты не являются главным источником экспрессии IL-13 при саркоидозе. Иммуноцитохимическое исследование клеток БАЛ 8 пациентов с саркоидозом показало, что приблизительно 30 % альвеолярных макрофагов положительно окрашивались для IL-13, принимая во внимание, что только несколько лимфоцитов были слабо окрашены. Так как альвеолярные макрофаги экспрессируют IL-13 при легочном фиброзе (22), они могут экспрессировать IL-13 при других интерстициальных болезнях легкого. Наши данные говорят, что альвеолярные макрофаги могут быть главным источником IL-13 при саркоидозе.

Уровни IL-13 были немного увеличены в супернатанте культуры клеток БАЛ у некоторых пациентов, но различие между пациентами и группой контроля не было статистически значимым. Это могло происходить из-за малого числа пациентов в исследуемой группе и низких уровней IL-13. Однако, у половины исследуемых пациентов увеличенные уровни IL-13 указывают, что IL-13 при саркоидозе производится клетками БАЛ.

Как и ожидалось, экспрессия мРНК TNF-alpha была значительно увеличена у клеток БАЛ пациентов по сравнению с группой контроля, в то же время никаких значительных различий не было замечено у PBM. Это согласуется с данными Steffen (5). TNF-alpha может быть ответствен за воспалительные реакции, но курс болезни при саркоидозе часто умеренный. Возможно, что другие противовоспалительные медиаторы могли бы противодействовать TNF-alpha (9). Было показано, что IL-10 подавляет TNF-alpha (27, 28), но в нашем исследовании экспрессия IL-10 не была обнаружена у большинства пациентов. Однако, в исследовании Minshall (29), увеличение числа IL-10-позитивных клеток БАЛ было замечено у пациентов с саркоидозом, у которых недавно развилось усиление кашля или одышки, системные симптомы и/или рентгенографические ненормальности, указывающие на активное состояние болезни. Zissel (13) не сообщил о спонтанном производстве IL-10 клетками БАЛ пациентов с саркоидозом. Напротив, Bingisser (15) недавно описал увеличение местной секреции IL-10 альвеолярными макрофагами при саркоидозе. Дальнейшие исследования необходимы, чтобы определить роль IL-10 в патофизиологии саркоидоза.

Чтобы исследовать влияние IL-13 на производство TNF-alpha, культуры клеток БАЛ пациентов с саркоидозом были культивированы с RhIL-13, с и без стимуляции LPS. Средняя концентрация TNF-alpha уменьшилась в супернатанте культуры клеток БАЛ в присутствии IL-13; этот эффект был даже больше в LPS-стимулированных культурах клеток БАЛ. Cosentino (21) показал, что IL-13 может уменьшать секрецию TNF-alpha в крови. Наши данные говорят, что IL-13 может ингибировать производство TNF-alpha клетками БАЛ при саркоидозе. Инкубация с RhIL-10 также значительно уменьшила уровни TNF-alpha, демонстрируя способность IL-10 редуцировать экспрессию провоспалительных цитокинов.

Сравнение пациентов со стадией I и стадией II/III болезни показало более высокую экспрессию мРНК IL-13 в клетках БАЛ пациентов со стадией I болезни. Стадия I определяется как присутствие двусторонней внутригрудной лимфаденопатии (BHL) без интерстициальных изменений; в стадии II BHL связана с узловыми затенениями; в стадии III имеется генерализованное затенение без BHL. В стадии I болезнь обычно самоограниченная, принимая во внимание, что стадии II и III могут иметь прогрессирующий курс. Эти данные говорят, что в ранней стадии воспаления IL-13 может ингибировать провоспалительные реакции, таким образом ограничивая болезнь.

Было показано, что IL-13 является многообещающей методикой лечения увеита (31) и эндотрахеальная инстилляция IL-13 имеет противовоспалительное действие в дыхательных путях (32). Из-за того, что IL-13 вызывает гиперреактивность дыхательных путей, он не может быть подходящим терапевтическим средством для лечения саркоидоза, но он может быть полезен для восстановления нарушенного баланса Th1/Th2 у этих пациентов. Другой возможностью может быть селективная стимуляция противовоспалительной активности посредством рецепторов IL-13.

Наши данные говорят, что IL-13 может быть противовоспалительным медиатором при саркоидозе, действуя на TNF-alpha. Дальнейшие исследования необходимы, чтобы определить, влияет ли IL-13 на другие медиаторы воспаления при саркоидозе и связано его действие с фиброзом, поскольку увеличение экспрессии IL-13 в животной модели приводило к субэпителиальному фиброзу (33). Исследования должны также выяснить, может ли IL-13 вносить вклад в гиперреактивность дыхательных путей при саркоидозе. Это позволило бы ясно определить, может ли IL-13 использоваться для лечения саркоидоза.