JEM Vol. 201, No. 5, March 7, 2005 755–767
Микобактериальная каталаза-пероксидаза - тканевый антиген и цель для адаптивного иммунного ответа при системном саркоидозе
Zhimin Song, Lisa Marzilli, Brian M. Greenlee, Edward S. Chen, Richard F. Silver, Frederic B. Askin, Alvin S. Teirstein, Ying Zhang, Robert J. Cotter, and David R. Moller
Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Department of Medicine, Department of Pharmacology and Molecular Sciences, Department of Pathology, and Department of Molecular Microbiology and Immunology, The Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, The Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD 21205 Department of Medicine, Case Western Reserve School of Medicine, Cleveland, OH 441063 Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Mount Sinai Medical Center, New York
Реферат
Саркоидоз - болезнь неизвестной этиологии, характеризованная формированием неказеозных эпителиоидноклеточных гранулем, олигоклональных CD4+ T-клеточных инфильтратов и иммунных комплексов. Чтобы идентифицировать антигены, уместные для иммунного гранулематозного воспаления при саркоидозе, мы использовали протеомный подход, стремясь обнаружить тканевые антигены, которые плохо растворимы в нейтральном детергенте и резистентные к протеазе, с совместимыми биохимическими свойствами с экстрактами саркоидной ткани, которые стимулируют формирование гранулем при саркоидозе. Тканевые антигены с этими характеристиками были обнаружены с помощью фрагментов IgG или F(ab')2 сыворотки пациентов с саркоидозом у 9 из 12 пациентов с саркоидозом (75 %) (150-160, 80 или 60-64 kD) но только у 3 из 22 (14 %) пациентов контрольной группы (все 62-64 kD; P=0.0006). Десорбционная ионизационная лазерная времяпролетная масс-спектрометрия позволила позволила идентифицировать каталазу-пероксидазу Mycobacterium tuberculosis (mKatG) как один из этих тканевых антигенов. Иммуноблоттинг с использованием моноклональных антител к mKatG независимо подтвердил присутствие mKatG в 5 из 9 (55 %) образцов саркоидной ткани, но в ни одном из 14 образцов ткани контрольной группы (P=0.0037). IgG к рекомбинантному mKatG были обнаружены в сыворотке 12 из 25 (48 %) пациентов с саркоидозом по сравнению с 0 из 11 (0 %) PPD- (P=0.0059) и 4 из 10 (40 %) PPD+ (P=0.7233) пациентами контрольной группы, предполагая что микобактериальная каталаза-пероксидаза - цель адаптивного иммунного ответа, ведущего к гранулематозному воспалению при саркоидозе.
Введение
Саркоидоз является иммунной гранулематозной болезнью поскольку в процессе воспаления при этой болезни участвуют активизированные CD4+ T-клетки и мононуклеарные клетки с формированием гигантских клеток (1). Этот воспалительный ответ связан со значительным смещением профиля цитокинов к Th1 с увеличением экспрессии IFN-gamma, IL-2 и TNF наряду с экспрессией Th1 регулирующих цитокинов IL-12 и IL-18 (2-4). Исследования экспрессии генов ТКР при саркоидозе показали, что на участках гранулематозного воспаления присутствует олигоклональная популяция ab+ CD4+ T-клеток, что совместимо с определяемым MHC ответом на антиген (5-7). Сопутствующее возбуждение адаптивного B-клеточного ответа при саркоидозе доказано формированием имунных комплексов у 70-100 % пациентов (8). Хотя природа саркоидного антигена остается неизвестной, в экспериментальных моделях было показано, что адаптивный Th1/ Th2 ответ является медиатором гранулематозного воспаления (9, 10).
Важным шагом в понимании этиопатогенеза саркоидоза была бы идентификация специфических антигенов, способствующих развитию адаптивного иммунного ответа, который является медиатором гранулематозного воспаления при этой болезни. Чтобы идентифицировать потенциальные антигены, специфические для адаптивного иммунного ответа при саркоидозе, мы использовали наблюдение, что при подкожном введении гомогената саркоидной ткани пациентам с саркоидозом формируются локальные очаги гранулематозного воспаления, которые гистологически неразличимы от спонтанно развивающихся саркоидных гранулем. Этот феномен известен как реакция Квейма (или реакция Квейма-Зильцбаха) (11-13). При этой реакции, характерные эпителиоидные гранулемы развиваются через 2-4 недели. Гистопатологически, этот гранулематозный ответ аналогичен реакции Мицуды на лепромин при туберкулоидной лепре (14).
В ранних исследованиях были обнаружены циркулирующие антитела направленные против реактива Квейма, что совместимо с гуморальным ответом на антигены, присутствующие в саркоидных тканях (15). Наши собственные исследования показали присутствие на участках реакции Квейма олигоклональных субпопуляций T-клеток, что совместимо с антиген-специфическим ответом на компонент реактива Квейма (16). Биохимические характеристики компонентов реактива Квейма, стимулирующих формирование гранулем, включают нерастворимость в нейтральном детергенте, относительную резистентность к высокой температуре, кислоте и протеазе и чувствительность к мощным денатурирующим средствам, что совместимо со слабо растворимыми белковыми образованиями (17, 18). В этом исследовании мы использовали протеомный подход, с иммуноблоттингом и десорбционной ионизационной лазерной времяпролетной масс-спектрометрией (MALDI-TOF), чтобы идентифицировать потенциальную антигенную цель в саркоидной ткани, которая может вносить вклад развитие гранулематозного воспаления при саркоидозе.
Пациенты
Гистологические препараты для исследования были получены из двух источников. С согласия пациентов и комитета по этике для целей исследования использовалась часть биопсийной ткани пациентов с подозреваемым саркоидозом, которые проходили диагностическое обследование, если эта часть биопсийной ткани не была необходима для клинических целей. С разрешения комитета по этике в исследовании также использовались зафиксированные в формалине и залитые парафином или замороженные образцы ткани, полученные при хирургической биопсии у пациентов с подтвержденным саркоидозом или контрольной группы в The Johns Hopkins Hospital or Mount Sinai Medical Center. Все ткани использовались для целей исследования только после клинического и патологического подтверждения диагноза. Ткани, полученные у пациентов с заключительным диагнозом саркоидоз, основанного на клинических критериях и результатах биопсии, демонстрировали типичные неказеозные эпителиоидные гранулемы без признаков бактериальных, микобактериальных или грибковых организмов при окрашивании по Гомори, красителем Kinyoun и аурамином-родамином или при культуральных исследованиях (1).
Ткани лимфатического узла контрольной группы были получены у пациентов, у которых была проведена хирургическая биопсия чтобы исключить злокачественное новообразование или оценка лимфаденопатии неизвестной причины. Во всех кроме двух случаев образцы не показали признаков злокачественного новообразования, инфекции или гранулем. Два лимфатических узла демонстрировали фолликулярную гиперплазию, совместимую с аутоиммуннной болезнью. Ткани легкого контрольной группы были получены у пациентов с подтвержденным биопсией гранулематозом Вегенера, обычной интерстициальной пневмонией или у пациентов без патологии (без свидетельств злокачественного новообразования, инфекции или гранулем) у которых биопсия была проведена, чтобы исключить злокачественное новообразование. Образцы ткани селезенки контрольной группы были получены при спленэктомии у пациентов, у которых была проведена операция по поводу абдоминального злокачественного новообразования.
Периферическая кровь была получена у пациентов с подтвержденным биопсией саркоидозом, PPD+ и PPD- пациентов контрольной группы. Диагноз саркоидоз был основан на совместимой клинической картине и результатах биопсии (1). 6 пациентов имели клинические свидетельства поражения легких, только и 19 пациентов имели клиническое свидетельства внелегочной болезни с или без поражения легких. Рентгенографические стадии были определены согласно международного соглашения (1). На основании клинических проявлений и рентгенограммы грудной клетки все пациенты имели активный саркоидоз (1).
PPD+ пациенты контрольной группы ранее были вакцинированы БЦЖ или ранее у них предполагался туберкулез. Чтобы подтвердить PPD+ статус этих пациентов была выполнена стандартная туберкулиновая кожная проба с внутрикожной инъекцией 5 U туберкулина (Tubersol; Aventis Pasteur) (47). Ответ на туберкулин был оценен по максимальному диаметру папулы через 48 часов после введения туберкулина. Папула диаметром 10 мм и более рассматривалась как положительный ответ.
Результаты
Резистентные к протеазе белки в саркоидных тканях - цель для циркулирующего IgG
Для концентрации тканевых антигенов, связанных с формированием саркоидной гранулемы мы использовали метод TX100, ранее описанный для концентрации активного реактива Квейма (17, 18). Когда не обработанные протеинкиназой K экстракты саркоидной ткани были проанализированы с помощью иммуноблоттинга, в саркоидной ткани и ткани контрольной группы с помощью саркоидного IgG или F(ab')2 были обнаружены множественные антигенные полосы, обнаруженные помощью с анти-Fc или анти-Fab реактивов. Когда те же самые гомогенаты саркоидной ткани были обработаны протеинкиназой K, мы обнаружили дискретные антигенные полосы в 6 из 9 (67 %) образцов ткани лимфатических узлов, в одном образце ткани легкого и двух образцах ткани селезенки, которые не были обнаружены при использовании только антител. В различных образцах ткани антигенные полосы варьировались, 60-, 62-64-, 80-, или 150-160-kD. В одном из этих образцов, 62-64-kD (но не другие) полосы были обнаружены при использовании саркоидной сыворотки в качестве реактива. Анализ ткани контрольной группы показал, что только в 1 из 11 (9 %) образцов ткани лимфатических узлов, 1 из 5 (20 %) ткани селезенки и 0 из 1 образцов ткани легкого были обнаружены резистентные к протеинкиназе K белки при использовании саркоидной сыворотки в качестве реактива. В обоих из этих случаев были отмечены 62- 64-kD полосы, предлагая, что эти антигены могут быть обнаружены не только в саркоидных тканях. В целом, 9 из 12 (75 %) образцов саркоидной ткани и только 2 из 17 (12 %) образцов ткани контрольной группы содержали нерастворимые в TX100, резистентные к протеинкиназе K белки, обнаруженные с помощью саркоидного IgG или F(ab')2 (P=0.0013).
Саркоидные тканевые антигены слабо растворимы в нейтральном детергенте
В дополнение к методу TX100 извлечения тканевых антигенов в саркоидных тканях, в качестве второго подхода мы использовали процедуру, разработанную для концентрации прионов (19). Были проанализированы 2 образца саркоидной ткани и семь образцов контрольной группы. Мы обнаружили множественные антигенные полосы в нерастворимой фракции (P22) и промежуточной фракции супернатанта (S215) в образцах саркоидной ткани и тканях контрольной группы используя саркоидный IgG. При анализе фракции Pe (precipitated cell pellets) двух образцов саркоидной ткани с помощью иммуноблоттинга, мы обнаружили антигенные полосы в обоих образцах. Образец ткани саркоидной селезенки демонстрировал четыре антигенных полосы, подобные обнаруженным при использовании протокола TX100. Образец ткани саркоидного легкого демонстрировал антигенные полосы (60, 62 и 160 kD) в фракции Pe. Фракция Pe 5 из 6 образцов ткани селезенки контрольной группы и один образец ткани легкого контрольной группы не демонстрировали антигенных полос при использовании саркоидного IgG или IgG контрольной группы. Один образец ткани селезенки контрольной группы демонстрировал 62-64-kD полосы при использовании в качестве реактива саркоидной сыворотки и сыворотки контрольной группы. В целом, при объединении обоих методов, мы обнаружили, что 9 из 12 (75 %) образцов саркоидной ткани против 3 из 22 (14 %) образцой ткани контрольной группы демонстрировал антигенные полосы, обнаруженные при иммуноблоттинге (P=0.0006).
Идентификация предполагаемого патогенного антигена с использованием MALDI-TOF
Чтобы идентифицировать предполагаемый тканевый антиген, два образца саркоидной ткани были проанализированы с помощью десорбционной ионизационной лазерной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF). Масс-спектрометрия в диапазоне 60- 62-kD экстракта саркоидной селезенки показала несколько пиков, которые не наблюдались в образцах ткани контрольной группы и были совместимы со смесью белков. Когда молекулярные массы этих белков были проверены по базе данных Genpept, самое высокое соответствие было найдено для каталазы-пероксидазы Mycobacterium tuberculosis (mKatG; молекулярная масса 80,625; Genpept accession no. U06265). Когда 16 белковых фрагментов, которые соответствовали mKatG были удалены из исследуемого образца и поиск был повторен, наибольшее соответствие среди оствавшихся белков было обнаружено с топоизомеразой I M. tuberculosis с 9 соответствующими пептидами (Genpept accession no U40159). Затем, мы выполнили MALDI-TOF в диапазоне 60-62-kD образцов ткани легкого пациентов с саркоидозом. Хотя ни одного сильного соответствия с базой данных Genpept при анализе этих образцов ткани не было найдено, было обнаружено соответствие 4 из 26 фрагментов белков с KatG Mycobacterium smegmatis (Genpept accession no 11255575). При анализе в других диапазонах (64, 150 и 160 kD) никаких статистически значимых соответствий получено не было. В 5 образцах ткани контрольной группы в диапазоне 60-62 kD было обнаружено несколько пиков очень низкой интенсивности, недостаточной для дальнейшего анализа.
Подтверждение присутствия mKatG в саркоидной ткани с помощью иммуноблоттинга
Чтобы независимо подтвердить результаты анализа методом фингерпринтов и проверить гипотезу, что mKatG является тканевым антигеном при саркоидозе, мы проанализировали саркоидную ткань и образцы ткани контрольной группы с помощью иммуноблоттинга и могоклональных антител IT57, реактивных к mKatG (20). Рекомбинантный mKatG подготовлен в соответствие с методикой, доступной по адресу http://www.jem.org/cgi/content/full/jem.20040429/DC1. Антитела IT57 реагировали на рекомбинантный mKatG, связывая и мономер 80-kD и гомодимер 160-kD (21, 22). Также связывались 140-, 60-, 56- и 40-kD пептиды, по данным MALDI-TOF происходящие от mKatG. IT57 сильно реагировали на 80- и 160-kD белки M. tuberculosis и M. smegmatis но не связывались с белками M. chelonei, Helicobacter pylori или Escherichia coli. Иммуноблоттинг того же самого образца саркоидной селезенки, в котором с помощью MALDI-TOF был обнаружен mKatG, показал присутствие 80- и 160-kD белков, что совместимо с мономерами и гомодимерами mKatG. Пять образцов ткани селезенки контрольной группы не показали присутствия mKatG при исследовании с помощью иммуноблоттинга. Исследование саркоидной ткани легкого, в котором было обнаружено возможное присутстивие KatG M. smegmatis на при исследовании с помощью MALDI-TOF, показал возможное присутствие 80-kD белка. Образцы ткани легкого контрольной группы не демонстрировали реакции с IT57. В 3 из 8 (38 %) саркоидных лимфатических узлах но в 0 из 8 (0 %) лимфатических узлах контрольной группы был обнаружен белок mKatG. Другие образцы ткани не могли быть повторно проанализированы из-за технических проблем или недостаточного количества биопсийной ткани. В целом, в 5 из 9 (56 %) образцов саркоидной ткани по сравнению с 0 из 14 (0 %) ткани контрольной группы был обнаружен белок mKatG с помощью иммуноблоттинга или использования моноклональных антител к mKatG (P=0.0037).
In situ гибридизация (ISH) показала наличие katG M. tuberculosis и 16S rRNA в саркоидной ткани
Чтобы изучить потенциальное значение mKatG как тканевого антигена при саркоидозе, мы исследовали биопсийные ткани на наличие ДНК mKatG. Используя ISH с усилением сигнала (TSA), ДНК mKatG была обнаружена в 7 из 18 (39 %) саркоидных и в 4 из 4 туберкулезных тканей, но 0 из 18 образцов ткани контрольной группы, которые включали 5 образцов ткани пациентов с гранулематозом Вегенера. Поиск 16S rRNA H. pylori был отрицательным во всех образцах. ISH без усиления сигнала использующая 16S rRNA M. tuberculosis подтвердила присутствие микобактериальной ДНК в 5 из 6 (83 %) mKatG+ образцов ткани и 6 из 16 (38 %) образцов саркоидной ткани по сравнению с 0 из 16 (0 %) образцов ткани контрольной группы (P=0.018).
Саркоидный IgG связывает рекомбинантный mKatG
Чтобы определить, является ли mKatG уместным кандидатом в патогенные саркоидные антигены, мы проанализировали сыворотку пациентов с саркоидозом, PPD+ и PPD- пациентов на предмет связывания рекомбинантного mKatG. Мы обнаружили циркуляцию анти-mKatG IgG в сыворотке 12 из 25 (48 %) пациентов с саркоидозом по сравнению с 0 из 11 (0 %) PPD- пациентами (P=0.0059) и 4 из 10 (40 %) PPD+ пациентами (P=0.7233; при объединении групп P=0.0034). Циркулирующий IgG пациентов с саркоидозом и PPD+ пациентов был связан с 80- или 60-kD KatG белками или с обоими. Два пациента с саркоидозом и один PPD+ пациент имели положительный результат mKatG иммуноблоттинга с титрами 1:1,000. Пациенты с саркоидозом, у которых наблюдалась циркуляция IgG к mKatG, были клинически вариабельны, с и без внелегочной болезни. Не имелось корреляции между присутствием или отсутствием анти-mKatG IgG и рентгенографической стадией пациента.
Чтобы определить, является ли реактивность к mKatG селективной для саркоидоза или связанной с реактивностью к другим микобактериальным белкам, мы проанализировали циркуляцию IgG, связанного с рекомбинантным белком Hsp65 Mycobacterium bovis (mHsp65). Мы обнаружили циркуляцию IgG связанного с mHsp65 у всех PPD+ пациентов (10 из 10), у 6 из 11 (55 %) PPD- пациентов и у 17 из 25 (68 %) пациентов с саркоидозом. В пределах группы пациентов с саркоидозом, все 12 mKatG+ пациентов также имели реактивность к mHsp65, предлагая присутствие реактивности к микобактериальным антигенам, иным чем mKatG в этой подгруппе пациентов. Частота пациентов с саркоидозом с реактивностью к mHsp65, но не mKatG (6 из 12; 50 %) не различалась от PPD- пациентов (P>0.9), предполагая специфическую реактивность не связанную с болезнью или перекрестную реактивность к mHsp65 у этих пациентов.
Обсуждение
Наше исследование показало существование небольшого количества резистентных к протеазе, слабо растворимых антигенов в саркоидных тканях, которые являются целью для адаптивного IgG-зависимого T-клеточного ответа у пациентов с саркоидозом Саркоид-специфические антигены отличались от тканевых антигенов в тканях контрольной группы при использовании двух различных методов извлечения и концентрации антигенов из саркоидных тканей. Факт, что эти методы извлечения и концентрации антигенов из гомогенизированных саркоидных тканей сохраняют in vivo гранулемогенную активность и стимулируют формирование гранулемы, увеличивает вероятность, что эти специфические тканевые антигены связаны с патогенезом болезни. Мы идентифицировали один из этих антигенных белков-кандидатов как микобактериальную каталазу-пероксидазу (mKatG). Идентификация была выполнена с помощью MALDI-TOF и затем была проверена с использованием специфических анти-mKatG моноклональных антител и иммуноблоттинга. Используюя in situ гибридизацию мы также обнаружили ДНК mKatG в некоторых образцах саркоидной ткани. Эти результаты демонстрируют, что слабо растворимые белковые депозиты, содержащие mKatG присутствуют в некоторых саркоидных тканях и являются потенциальной целью для местного адаптивного иммунного ответа.
Микобактериальная каталаза-пероксидаза, которая кодируется katG обнаружена у большинства микобактериальных разновидностей и высоко эксперссирована у M. tuberculosis и M. smegmatis (неопубликованные данные). KatG - важный фактор вирулентности, который защищает эти организмы от действия активных соединений кислорода, позволяя им выживать внутри макрофагов (23). Изониазид, антимикробактериальное средство второй линии, для проявления своего антимикробактериального эффекта нуждается в трансформации KatG к активной форме (24, 25). Полная или частичная делеция, ведущая к инактивации katG, ведет к резистентности к изониазиду (24, 26, 27). Хотя о структуре белка mKatG пока не сообщалось, имеются данные, что нативная форма mKatG является гомодимером; мутантные этого белка демострируют различия в ферментативной функции и подвижности при электрофорезе (21, 22).
Присутствие в саркоидных тканях белка KatG и его ДНК, возможно происходящих от M. tuberculosis или M. smegmatis указывает, что у некоторых пациентов с саркоидозом ранее имело место воздействие этих или родственных микобактериальных организмов. Результаты нашего исследования согласуется с предыдущими сообщениями, которые сообщили о присутствии фрагментов микобактериальных организмов в саркоидных тканях (28, 29). В одном из исследований иммуногистохимическими методами в тельцах Шауманна были обнаружены специфические антигенные детерминанты и фрагменты клеточной стенки M. tuberculosis (29). Многочисленные исследования, использующие ПЦР сообщили о частоте обнаружения микобактериальных нуклеиновых кислот в саркоидных тканях от 0 до 80 % (30-34). Drake с коллегами (35) сообщили об обнаружении микобактериальной рРНК или rpoB в 60 % саркоидной тканей, но в ни одном образце ткани контрольной группы. Мы обнаружили mKatG и 16S рРНК M. tuberculosis в саркоидных тканях с помошью in situ гибридизации. Эти данные свидетельствуют в пользу гипотезы, что воздействие микобактериальных организмов может вызывать саркоидоз в некоторой подгруппе пациентов (36).
Дополнительным подтверждение микобактериальной этиологии саркоидоза являются наши данные, что процент пациентов с саркоидозом с циркулирующими антителами к mKatG поразительно подобен проценту здоровых пациентов с циркулирующими антителами к mKatG с положительной реакцией на туберкулин (PPD+), с предшествующим воздействием M. tuberculosis дикого типа или вакцинированных БЦЖ. Этот процент был значительно выше, чем у пациентов с отрицательной реакциеций на туберкулин (PPD-), предполагая, что mKatG является специфической иммунологической целью, которая более обычна для PPD+ индивидуумов и пациентов с саркоидозом. Это предположение подтверждается тем, что все пациенты с саркоидозом с циркулирующими антителами к mKatG также имели циркулирующие антитела против mHsp65, указывая, что эти пациенты имеют также серологическую реактивность к микобактериальным антигенам, иным чем mKatG. Процент пациентов с саркоидозом с реактивностью к mHsp65, но не mKatG был подобен проценту PPD- индивидуумов, что совместимо с не связанной с болезню специфической иммунологической реактивностью или перекрестной реактивностью к mHsp65 у этих пациентов (37, 38). У PPD+ пациентов реактивность к mHsp65 была более частой, чем реактивность к mKatG, предполагая, что mHsp65 может быть доминирующей иммунологической целью по сравнению с mKatG у вакцинированных БЦЖ индивидуумов или пациентов с латентной инфекцией M. tuberculosis. Играют ли различия иммунного ответа на эти специфические микобактериальные белки роль в определении исхода болезни после воздействия микобактериальных орагнизмов остается неизвестным. Учитывая отсутствие корреляции между реактивностью к mKatG и клиническим курсом, кажется вероятным, что присутствие IgG ответа на mKatG не определяет исход саркоидоза.
Присутствие микобактериальных белков в саркоидных тканях может быть уместным для продолжительной иммунологической стимуляции, которая связана с персистированием антигена, развитием аутоиммунных процессов или с молекулярной мимикрией (39-41). Наши результаты указывают, что mKatG, который присутствует в саркоидных тканях при постановке диагноза, может быть связан с IgG ответом на этот антиген. Персистирование этого антигена производит местный адаптивный иммунный ответ, связанный с активным формированием гранулем. Поскольку не известно, является ли белок mKatG фактически резистентным к протеазе, наши результаты предполагают, что при денатурации mKatG in vivo он может находиться в комплексе со слабо растворимыми компонентами ткани, что дает относительную защиту от протеазы. Эти комплексы белок/ткань могут служить антигенным резервуаром для деградации дендритными клетками или мононуклеарными фагоцитами с последующей презентацией антигеных пептидов (42, 43). Предположение, что mKatG может быть саркоидным антигеном поддерживается нашими предварительными исследованиями, в которых mKatG в комплексе с гранулами Сефадекс стимулирует формирование гранулем в животной модели гранулематозного воспаления (10, 44, 45).
Хотя наше исследование идентифицировало mKatG как одну из целей адаптивного иммунного ответа при саркоидозе, другие слабо растворимые, резистентные к протеазе тканевые антигены пока не были идентифицированы. Поскольку mKatG был обнаружен только в одной из групп пациентов, возможно, но маловероятно, что другие микробные антигены или эндогенные белки стимулируют местный адаптивный иммунный ответ как часть патогенного гранулематозного воспаления в других группах пациентов с саркоидозом. Идентификация этих тканевых антигенов является крайне сложной из-за малого количества ткани, которую получают при стандартной процедуре биопсии, что приводит к следовым количествам белковых антигенов в смеси с другими компонентами ткани. Несмотря на эти трудности, результаты нашего исследования позволяют предположить, что имеется небольшое число тканевых антигенов, которые являются специфической целью адаптивного гуморального ответа, связанного с гранулематозным воспалением при саркоидозе.