Thorax 2002;57:157-164

Специфическая экспрессия белков семейства пероксиредоксинов при легочном саркоидозе

V L Kinnula, S Lehtonen, R Kaarteenaho-Wiik, E Lakari, P Paakko, S W Kang, S G Rhee and Y Soini
Departments of Internal Medicine and Pathology, University of Oulu and Oulu University Hospital, Finland
Laboratory of Cell Signalling, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892, USA

Реферат

Введение: недавно было показано, что 6 белков семейства пероксиредоксинов (Prx) способны расщеплять перекись водорода in vivo и in vitro. Эти белки могут иметь важную роль при защите легкого от эндогенного и экзогенного оксидантного стресса. Однако, экспрессия и распределение этих белков в здоровом легком и в вовлеченных в болезнь тканях неизвестны. Методы: специфическая экспрессия Prxs в здоровых тканях легкого у 4 некурящих индивидуумов и в паренхиматозной ткани у 10 пациентов с легочным саркоидозом, была исследована иммуногистохимическими методами. Экспрессия этих белков в культурах клеткок легкого и клеток бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) группы контроля и пациентов с саркоидозом была оценена с помощью Вестерн-блоттинга. Результаты: все 6 Prxs синтезировались культурами клеток легкого. Бронхиальный эпителий показал умеренно высокую экспрессию Prxs I, III, V и VI, альвеолярный эпителий экспрессировал главным образом Prxs V и VI, альвеолярные макрофаги экспрессировали главным образом Prxs I и III. Гранулемы пациентов с саркоидозом в основном экспрессировали Prxs I и III. БАЛ группы контроля и пациентов с саркоидозом имел подобные результаты, за исключением того, что Prxs II и III имели увеличенную иммунореактивность в саркоидных тканях. Заключение: Prxs I, III, V и VI показали специфическую экспрессию в тканях легкого. Высокая экспрессия Prxs I и III в гранулемах и у альвеолярных макрофагов саркоидной паренхимы может иметь значительный эффект на окислительные процессы и прогресс повреждений в легкогом при саркоидозе.

Введение

Легкое является уникальной тканью для исследования влияния свободных радикалов, потому что клетки легкого непосредственно подвергнуты более высоким концентрациям кислорода чем большинство других тканей. Кроме того, клетки легкого сильнее подвергаются воздействию окислительных процессов при воспалении, так как типичная особенность многих легочных болезней - активация воспалительных клеток, что ведет к генерации реактивных метаболитов кислорода. Свободные радикалы и антиоксиданты также связаны с различными сигналами, активацией или ингибированием факторов транскрипции. Кроме того, синтез факторов роста и цитокинов, таких как тромбоцитарный фактор роста (PDGF), эпидермальный фактор роста (EGF), трансформирующий фактор роста бета (TGF-beta) и фактор некроза опухоли альфа (TNF-alpha), могут находиться под влиянием свободных радикалов (1). Механизм антиоксидантной защиты, поэтому, вероятно, играет важную роль не только в предотвращении некоторых болезней легкого, но также и в модуляции прогресса этих болезней.

Наиболее важные антиоксидантные ферменты (AOEs) удаляющие перекиси, включают перекиси дисмутазы - а именно, марганцевую супероксиддисмутазу (MnSOD), медно-цинковую супероксиддисмутазу (CuZnSOD) и внеклеточную супероксиддисмутазу (ECSOD) (2, 2, 3). MnSOD слабо экспрессирована у альвеолярных макрофагов и эпителиоцитов дыхательных путей и индуцируется цитокинами при воспалительных болезнях легкого (4-6). CuZnSOD в основном экспрессирована в бронхиальном и альвеолярном эпителии (6,7), ECSOD - главным образом у альвеолярных макрофагов, в областях, содержащих большое количество волокон коллагена типа I и около легочных капилляров (8).

Наиболее хорошо исследован механизм деградации перекиси водорода, с участием каталазы и глутатионпероксидазы (3). Бронхиальные эпителиоциты, альвеолярные клетки тип II и макрофаги имеют реактивность каталазы и пероксидазы (9-11). Эпителиальная жидкость имеет уровни глутатиона более чем в 100 раз более высокие, чем в периферической крови (12,13). Кроме этих, имеются другие механизмы, которые плохо описаны, но которые могут играть важную роль в антиоксидантной защите легкого. Цистеин-содержащие малые белки, такие как тиоредоксин (Trx) и пероксиредоксин (Prxs) привлекают большой интерес. Белки семейства Trx были описаны при легочном саркоидозе (17), но никакие исследования любого из белков семейства Prx в легком человека не проводились.

Пероксиредоксины принадлежат семейству антиоксидантных белков, которые обнаружены у различных организмов, от прокариот до млекопитающих. Группа белков Prx млекопитающих была первоначально разделена на три подсемейства - Prxs I, II и III - все три были обнаружены в гомогенатах легкого крысы (18). Пероксиредоксин I также был обнаружен в некоторых злокачественных опухолях (19). С помощью Нозерн-блоттинга, мРНК Prx IV была обнаружена в гомогенатах некоторых тканей, включая легкое (20). мРНК главным образом расположена в эндоплазматической сети, но также во внеклеточном пространстве (21). Пероксиредоксин V первоначально был обнаружен в бронхоальвеолярном лаваже (22,23). Недавно было сообщено об обнаружении Prx V в митохондриальной камере клеток почки крыс (24). Интересно, что у человека ген Prx V расположен на хромосоме 11q13, которая является важным генетическим регионом для аллергии (25). Недавнее исследование сообщило о новом Prx (1-Cys Prx) у млекопитающих, который содержит, в отличие от других Prxs, только один цистеин (N-терминальный cys 47) (26). В настоящем исследовании 1-Cys Prx был назван Prx VI. Хотя почти все Prxs были обнаружены в легочных гомогенатах, распределение этих белков ранее не было исследовано в тканях легкого человека или животных. Вероятно, эти ферменты имеют индивидуальное распределение и экспрессию и могут иметь важную роль при защите клеток легкого от оксидантов при воспалительных болезнях легкого.

Чтобы лучше понять механизмы, с помощью которых клетки легкого защищаются от оксидантов, мы исследовали локализацию и экспрессию всех 6 Prxs в здоровой ткани легкого иммуногистохимическими методами и в различных клетках и БАЛ с помощью Вестерн-блоттинга. Чтобы исследовать регулирование Prxs при воспалительных состояниях in vivo, была оценена их экспрессия при легочном саркоидозе. Типичные особенности паренхиматозного саркоидоза - обширное воспаление, формирование типичных гранулем и сохранность архитектуры легкого.

Методы

Биопсия

Материалы биопсии легкого 4 некурящих пациентов, у которых была проведена хирургическая операция по поводу карциноида и 10 пациентов с саркоидозом были взяты из файлов Department of Pathology, Oulu University Hospital, и были переоценены с помощью открытой или торакоскопической биопсии. Противовоспалительное лечение не было начато ни в одном случае. Клинические данные - пол, возраст и диагноз были получены из истоорий болезни.

Бронхоальвеолярный лаваж

Бронхоскопия для проведения БАЛ выполнялась под местной анестезией с лидокаином (лигнокаином). После центрифугирования (400 g в течение 15 минут) материалы были сохранены при -70°C для более позднего анализа. Бронхоскопические экспертизы проводились как дифференциально-диагностические исследования. Протокол исследования был одобрен комитетом по этике.

Результаты

Prx I был умернно экспрессирован у альвеолярных макрофагов и бронхиальных эпителиоцитов, в 3 из 4 случаев у макрофагов и во всех 4 случаях в бронхиальном эпителии. И альвеолярные эпителиоциты и сосудистые эндотелиальные клетки были, в целом, слабопозитивными. Экспрессия Prx I от умеренной до сильной, была замечена у альвеолярных макрофагов в материалах биопсии при саркоидозе (8/10) и у саркоидных гранулем (9/10). Иммунореактивность альвеолярных пневмоцитов при саркоидозе, также была по меньшей мере умеренной в 6 из 10 случаев. Бронхиальные и альвеолярные эпителиоциты, в частности, и иногда саркоидные гранулемы и гигантские клетки, также показали Prx I реактивность.

В отличие от Prx I, большинство материалов биопсии были слабо или умеренно положительны для Prx II, ни в одном из образцов не показывая сильной реактивности. Бронхиальные эпителиоциты имели слабую реактивность во всех 4 случаях, альвеолярные макрофаги и эпителиоциты обычно были слабоположительны (2/4). Плазматические клетки, лимфоциты и эндотелиальные клетки были также слабоположительны. При саркоидозе, макрофаги показали слабую иммунореактивность в 5 из 10 случаев; гранулемы и гигантские клетки показали отрицательные результаты за исключением 2 случаев со слабой реактивностью.

Prx III, подобно Prx I, показал высокую реактивность у альвеолярных макрофагов и бронхиальных эпителиоцитов во всех 4 случаях. Альвеолярный эпителий показал умеренную иммунореактивность в 3 из 4 образцов. Prx III был также положительным в сосудистых эндотелиальных клетках. При саркоидозе, альвеолярные макрофаги и саркоидные гранулемы были положительны в большинстве случаев (7/10). Как и Prx I, экспрессия Prx III была также замечена у фибробластов в фиброзных областях, связанных с саркоидными реакциями. Эндоплазматическая иммунореактивность иногда была гранулированной, отражая митохондриальную локализацию Prx III (16,24).

Реактивность Prx IV была отрицательной или слабой в бронхиальном эпителии (2/4) и слабой (3/4) у макрофагов. Альвеолярные эпителиоциты были отрицательны, кроме позитивности, наблюдаемой у метапластических клеток. Сосудистые эндотелиальные клетки были главным образом негативны. Альвеолярные макрофаги пациентов с саркоидозом и гранулемами были слабоположительны в 7 из 10 случаев.

Бронхиальный эпителий и альвеолярные клетки тип II показали сильную реактивность Prx V во всех 4 образцах биопсии, у альвеолярных макрофагов реактивность изменялась от слабой (1/4) до сильной (1/4). Бронхиальные эпителиоциты и альвеолярные клетки тип II при саркоидозе были положительны (10/10) принимая во внимание, что макрофаги и саркоидные гранулемы были главным образом слабо положительны (8/10). Эндоплазматическая реакция была гранулированной, что является совместимым с локализацией Prx V в митохондриях (16).

Экспрессия Prx VI была подобна Prx V, показывая наиболее заметную иммунореактивность в бронхиальном эпителии и у альвеолярных клеток тип II в 3 из 4 случаев. Саркоидные гранулемы были умеренно положительны в 8 из 10 случаев, альвеолярные макрофаги в 5 из 10 случаев.

Вестерн-блоттинг показал подобную экспрессию всех Prxs в БАЛ группы контроля и пациентов с саркоидозом. Когда иммунореактивности были стандартизированы, относительная экспрессия различных Prxs в БАЛ при саркоидозе по сравнению с группой контроля была следующей: Prx I - 20 %, Prx II +62 %, Prx III +18 %, Prx IV - 6 %, Prx V - 13 % и Prx VI - 17 %.

Обсуждение

Наше исследование впервые показало, что кроме классических механизмов деградации перекиси водорода, включающих каталазу и глутатионпероксидазу, клетки легкого специфически экспрессируют все 6 членов семейства Prx и что эти белки могут также быть индуцированы в гранулемах при легочном саркоидозе.

Механизмы распада перекиси водорода могут иметь важную антиоксидантную роль в эпителии дыхательных путей. Предыдущие исследования антиоксидантных механизмов показали, что бронхиальные эпителиоциты увеличивают реактивность каталазы (7,9,10) и что мРНК гамма-глутамилцистеинсинтетазы (gamma-GCS) дисрегулирована по крайней мере у эпителиоцитов дыхательных путей у курящих пациентов (30). С другой стороны, удельная активность каталазы бронхиальных эпителиоцитов была низкой (9). Ни каталаза, ни внеклеточная глутатионпероксидаза не были индуцированы в течение острого окислительного стресса в бронхиальных эпителиальных клетках человека (9,11). Только часть способности бронхиальных эпителиоцитов ращеплять перекись водорода может замедляться ингибитором каталазы аминотриазолом или BSO (ингибитор gamma-GCS) (7). Эти результаты можно частично объяснить тем, что в большинстве случаев наблюдалась умеренная или высокая экспрессия Prxs III, V и VI . Наши неопубликованные данные также показали, что бронхиальный эпителий содержит Trx и Trx редуктазу, и что экспрессия Trx увеличена у бронхиальных эпителиоцитов пациентов с различными типами интерстициальной пневмонии. Относительная важность Prxs, Trxs и классических AOEs в дыхательных путях человека остается неясной. Относительно высокая экспрессия Prxs в нормальном бронхиальном и альвеолярном эпителии и у альвеолярных макрофагов предполагает, что эти белки составляют важную первичную систему защиты легкого.

Альвеолярный эпителий, особенно пневмоциты тип II - оксидант-резистентные клетки in vitro и in vivo (31,32). Пневмоциты типа II экспрессируют высокие уровни каталазы и разлагают экзогенную перекись водорода главным образом с помощью каталаза-зависимого механизма in vitro (10,33). С другой стороны, из-за высокого Км каталазы к перекиси водорода, другие механизмы вероятно необходимы, чтобы защитить альвеолярный эпителий в течение персистирующего оксидантного стресса in vivo. Результаты настоящего исследования говорят, что Prxs V и VI, по крайней мере частично, могут объяснять эту устойчивость. Мы показали, что альвеолярные эпителиоциты, также как и бронхиальные эпителиоциты и плевральные мезотелиальные клетки, экспрессируют всех членов семейства Prx, так что эти клетки могут использоваться, чтобы исследовать регулирование Prxs в легком человека.

Альвеолярные макрофаги более резистентны чем нейтрофилы, что может быть частично связано с внутриклеточной антиоксидантной защитой. Макрофаги и моноциты имеют различные механизмы антиоксидантной защиты; они имеют более высокое содержание глутатионпероксидазы, чем нейтрофилы (34), они разлагают перекись водорода главным образом каталаза-зависимым путем, но часть этого процесса может быть связана с иными механизмами (35,36). Мы обнаружили, что Prxs I, III и V были по крайней мере умеренно экспрессированы у альвеолярных макрофагов в большинстве случаев, что предлагает их важность в защите альвеолярных макрофагов при оксидантном стрессе.

Экспрессия Prxs I, III, V и VI у макрофагов и/или пневмоцитов тип II в материалах биопсии группы контроля предполагает, что активность этих ферментов в легком является важной. С другой стороны, по крайней мере некоторые из этих белков могут быть индуцированы оксидантами и цитокинами, управляемыми факторами транскрипции, например NF-kappaB (16). Материалы биопсии были получены у некурящих индивидуумов с нормальной гистопатологией легкого. Однако, у всех пациентов производилось обезболевание и вентиляция с повышенным уровнем кислорода, и, таким образом, индукция этих ферментов при проведении бронхоскопии не может быть полностью исключена. Индукция Prxs, таки образом, теоретически может происходить в течение бронхоскопии, что требует осторожности в интерпретации уровней различных Prxs в здоровой ткани легкого и БАЛ. Кроме того, Prxs способны к формированию гетеродимеров и гомодимеров, которые модулируют их активность (20).

Мы использовали саркоидоз как модель, чтобы исследовать регулирование Prxs в ткани легкого in vivo, так как паренхима при легочном саркоидозе содержит обширное воспаление с типичными гранулемами, но с хорошо сохраненной архитектурой легкого с хорошим прогнозом. Предыдущие исследования показали, что уровень одного из наиболее важных AOEs, MnSOD, который индуцируется воспалительными цитокинами (4), увеличен у макрофагов и в гранулемах при легочном саркоидоза (6). Недавнее исследование также показало индукцию Trx в БАЛ пациентов с саркоидозом (17). Кроме MnSOD и Trx, высокая реактивность Prxs I и III в гранулемах и альвеолярных макрофагах пациентов с саркоидозом, вместе с возможной индукцией Prx II и III в БАЛ, предполагает, что различные антиоксидантные механизмы вносят вклад в защиту легкого от оксидантного стресса при гранулематозных болезнях легкого. Остается неясным, насколько значительную роль Prxs играют в прогрессе этих болезней.

Клетки легкого специфически экспрессируют все 6 членов семейства Prxs. Экспрессия некоторых членов семейства Prx была подобной в ткани легкого группы контроля и и пациентов с саркоидозом, что предлагает важность Prxs в первичной оксидантной устойчивости легкого. Высокая экспрессия Prxs I и III в гранулемах и альвеолярных макрофагах и Prx V в бронхиальном и альвеолярном эпителии пациентов с саркоидозом также может иметь важное влияние на прогресс этой болезни. Дальнейшие исследования будут необходимы, чтобы оценить относительную важность различных антиоксидантных механизмов и недавно охарактеризованых белков при болезнях легкого.