Am. J. Respir. Crit. Care Med., Volume 164, Number 5, September 2001, 840-846

Результат поиска генов, предрасполагающих к саркоидозу

Manfred Schurmann, Philipp Reichel, Bertram Muller-Myhsok, Max Schlaak, Joachim Muller-Quernheim, and Eberhard Schwinger
Institute of Human Genetics, Lubeck University Medical School, Lubeck, Germany; Bernhard Nocht Institute, Hamburg, Germany; and Medical Hospital, Research Center Borstel, Borstel, Germany

Реферат

Саркоидоз - системная гранулематозная болезнь неизвестной этиологии. Мы использовали анализ сцепления, чтобы идентифицировать хромосомные регионы, которые вносят вклад в риск саркоидоза. На основании 225 микросателлитных маркеров, проверенных в 63 семьях сибсов (родные братья/сестры, 138 пациентов) с помощью многоточечного непараметрического анализа сцепления (NPL), мы обнаружили пик (шесть смежных маркеров, включая D6S1666; NPL score = 2.99; p = 0.001) в главном комплексе тканевой совместимости (MHC). Шесть минорных пиков (p < 0.05) были обнаружены на хромосомах 1 (D1S1665), 3 (D3S1766), 7 (D7S821 и D7S3070), 9 (D9S934) и X хромосоме (DXS6789). Субпопуляция из девяти семей с более чем двумя сибсами (30 пациентов) показала пик в MHC (D6S1666; NPL score = 0.79; p = 0.21). Наши результаты указывают на гетерогенность локуса восприимчивости к саркоидозу, с основным влиянием MHC.

Введение

Саркоидоз - системная воспалительная болезнь неизвестной этиологии, характеризованная высокой активностью макрофагов и CD4+ клеток Т-хелпер и формированием неказеозных гранулем в различных органах, преимущественно в легких. Причина саркоидоза остается неясной и интенсивные усилия пока не позволили окончательно идентифицировать агент, вызывающий формирование гранулем (1, 2).

Известно о существовании семейной группировки саркоидоза (3) и общепринято, что существует генетическая восприимчивость к саркоидозу. Данные общенациональной программы рентгенографического скрининга, указывают на риск повторения болезни у родных братьев/сестер (сибсов) пациентов с саркоидозом приблизительно 1/100, что в 20 раз выше, чем распространенность саркоидоза в Германии (8). Это исключает простой тип наследования саркоидоза, но совместимо с (1) влиянием единственного гена с очень малой пенетрантностью, (2) полигенной наследственностью, и (3) мультифакторным взаимодействием генетической предрасположенности и агентов окружающей среды.

Чтобы локализовать гены предрасположенности к саркоидозу, могут использоваться произвольные участки полиморфизма ДНК, чтобы маркировать каждую хромосому и производить проверку на косегрегацию с саркоидозом в семьях. Используются два основных статистических подхода: параметрический и непараметрический анализ сцепления. Параметрический анализ сцепления требует знания модели наследования признака и впоследствии оценивает вероятность наблюдаемой сегрегации полиморфизма с этим признаком. Отрицательный результат указывает, что полиморфизм и локус признака расположены в различных частях генома и/или выбранная модель наследования не корректна. Если принята модель с влиянием единственного гена, то необходимо принять во внимание, что наблюдаемому риску повторения саркоидоза у родственников первой степени родства соответствует очень малая пенетрантность гена.

При отсутствии любых данных относительно типа наследования саркоидоза, используется непараметрический анализ сцепления (NPL) (анализ, работающий без модели наследования). Этот анализ основан на предпосылке, что сибсы наследуют общие родительские хромосомные регионы, которые содержат вариант гена, участвующий в патогенезе саркоидоза.

Анализ сцепления может быть основан на единственном полиморфизме или на ряде полиморфизмов в хромосоме. Последний известен как многоточечный анализ сцепления и облегчает картирование, указывая на положительную связь по отношению позициям известных полиморфизмов. Компьютерная программа GENEHUNTER (9) была разработана для выполнения таких вычислений.

Геном содержит большое число коротких полиморфных мотивов (так называемые микросателлиты), которые используются, чтобы маркировать хромосомы (10). Мы использовали стратегию микросателлитного генотипирования и многоточечного анализа сцепления сибсов из 63 семей для поиска гена-кандидата предрасположенности к саркоидозу.

Методы

Ткани членов 63 Немецких семей (белые индивидуумы) с родными братьями/сестрами, страдающими от саркоидоза, были отобраны из банка ДНК пациентов с саркоидозом. Большинство семей было привлечено в исследование из Немецкой группы поддержки Deutsche Sarkoidose-Vereinigung (5). 16 семей были идентифицированы из файлов профессора К. Wurm из Hochenschwand, который много лет подчеркивал важность исследования семей при саркоидозе (3, 11). Все пациенты и их врачи интервьюировались по телефону или был проведен анкетный опрос. У 101 из 138 пациентов была проведена биопсия вовлеченных органов и в 68 случаях были доступны отчеты. Остальные пациенты имели характерные рентгенографические признаки саркоидоза в комбинации с клиническими симптомами, лабораторными исследованиями и клиническим курсом, совместимым с диагнозом саркоидоз. Родители пациентов включались в исследование, если это было возможно. В семьях, где один или оба родителя отсутствовали, родные братья/сестры без саркоидоза были привлечены в исследование, если это было возможно, чтобы восстановить родительский генотип. Всего в исследование было привлечено 95 близких родственников первой степени родства.

206 микросателлитных маркеров были выбраны из коммерчески доступного микросателлитного набора для генотипирования (MapPairs, version 8; Research Genetics, Huntsville, AL ftp://ftp.resgen.com/pub/mappairs) которые были использованы для картирования. Интервал между маркерами располагался от 6 до 29 сантиморган (эквивалент 1 рекомбинации на 100 мейозов), со средним интервалом 19.6 cM. Остальные 19 маркеров из MapPairs или из базы данных http://www.gdb.org были включены, чтобы получить более высокую плотность маркеров на коротком плече хромосом 3 и 6 и на всей хромосоме 16.

Генотипы для микросателлитных маркеров были определены с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Флуоресцирующие продукты ПЦР были разделены и идентифицированы на автоматизированном анализаторе секвенирования (12). Частоты аллелей были рассчитаны у всех генотипированных индивидуумов и Менделевский тип наследования микросателлитных аллелей проверялся с помощью программы PEDCHECK (13).

Параметрический и непараметрический анализ сцепления был выполнен с помощью программы GENEHUNTER 2.0 (9). Параметрический анализ сцепления вычисляет и сравнивает вероятность наблюдаемой сегрегации аллелей в семьях: (1) согласно гипотезе близости к гену восприимчивости на той же самой хромосоме и (2) в случае независимой сегрегации маркера и гена восприимчивости, расположенных на различных хромосомах или далеко друг от друга. Позиция гена-кандидата определялась по Genetic Location Database (LDB, http://cedar.genetics.soton.ac.uk/pub).

Результаты

Мы генотипировали 138 родных братьев/сестер и 95 близких родственников первой степени родства из 63 семей для 225 микросателлитных полиморфизмов ДНК. Число аллелей, наблюдаемых для отдельных маркеров располагалось от 4 до 24, со средним числом 8.6. Эта высокая степень вариабильности дает большое количество генной информации для конструирования гаплотипов для смежных полиморфизмов. Таким образом, могла быть определена мейотическая рекомбинация хромосом.

Наиболее заметный пик был обнаружен на коротком плече хромосомы 6 (6p21 к 6p22), с NPL score > 1.67 (p < 0.05) для шести смежных маркеров, охватывающих регион 16 cM, включая главный комплекс тканевой совместимости (MHC). Самый большой NPL score, 2.99 (p = 0.001), был получен для маркера D6S1666, который находится в MHC класса III.

Шесть других регионов показали минорные пики (p < 0.05). NPL score 2.39 (p = 0.009) был получен для D3S1766 на коротком плече хромосомы 3 (3p21), NPL score 1.87 (p = 0.03) для D1S1665 на коротком плече хромосомы 1 (1p22), NPL score 1.82 (p = 0.034) для D9S934 на длинном плече хромосомы 9 (9q33) и NPL score 1.64 (p = 0.047) для DXS6789 на длинном плече X хромосомы. Два маркера на длинном плече хромосомы 7 (D7S821 в 7q22 и D7S3070 в 7q36) показали NPL score 1.92 (p = 0.027) и 1.86 (p = 0.031), соответственно.

В подгруппе из 9 семей с более чем двумя сибсами с саркоидозом, результаты значительно отличались. Эта подгруппа показала минорный пик в MHC. Фактически, 2 из 6 маркеров из этого региона (D6S299 и D6S2439) имели отрицательный NPL score, а самый большой NPL score был 0.79 (p = 0.21), для D6S1666. Негативный NPL score был также получен для D7S3070. Самый высокий NPL score, 2.74 (p = 0.007), был получен для D15S822, на длинном плече хромосомы 15. Два смежных маркера на длинном плече хромосомы 9 (D9S2157 и D9S1838 в 9q34) показали NPL score 2.32 (p = 0.017) и 2.15 (p = 0.023), соответственно.

Параметрический анализ сцепления с моделями доминантного и рецессивного наследования не дал никаких значительных результатов.

Обсуждение

Саркоидоз может вовлекать различные органы и имеет высоко переменный курс. Однако, единообразие событий в начале патогенных процессов при саркоидозе кажется возможным (1, 2). События в этой ранней стадии включают характерное нарушение иммунного баланса в сторону стимуляции макрофагов и накоплению CD4+ T-хелперов, что ведет к формированию типичных неказеозных гранулем. Цитокины, многие из которых полиморфны, управляют иммунной реакцией и являются вероятными кандидатами на возникновение восприимчивости к саркоидозу. Проводились многочисленные исследования, чтобы коррелировать генетическую вариабильность иммунорелевантных генов с риском развития саркоидоза, но главный ген восприимчивости не был идентифицирован.

Можно предположить, что сибсы имеют общий вариант гена предрасположенности и что исследование большой группы родственных пар с саркоидозом позволить определить местоположение генов восприимчивости к саркоидозу. Однако, большое число маркеров, проверенных в нашем исследовании, дало большое число ложноположительных результатов. В нашем исследовании, при использовании 225 маркеров, было обнаружено 11 пиков (p < 0.05). Для окончательного картирования гена восприимчивости необходимо p < 0.0007 и NPL score > 3.6, что может быть расценено как доказательство сцепления.

Исследования других мультифакторных болезней указывают, что для установления сложной генетики саркоидоза наиболее вероятно потребуются комплексные исследования генома. Например, при болезни Крона, исследования распространенности и риска повторения болезни у сибсов, идентифицировали значительную связь с определенными регионами на хромосомах 1, 3, 6, 12 и 16 (15).

Поиск генов предрасположенности к саркоидозу позволил обнаружить 7 регионов (p < 0.05) с общими аллелями в 63 семьях и 5 различных локусов в подгруппе из 9 семей с больше чем двумя сибсами с саркоидозом. Наиболее заметный пик был обнаружен в MHC (6 смежных маркеров, включая D6S1666; NPL score 2.99; p = 0.001), что является совместимым с многочисленными отчетами о связи между вариантами этого гена и риском саркоидоза. Эти результаты были сообщены в нашей предыдущей публикации (18).

Следующий заметный пик, отмеченный маркером D3S1766, был обнаружен на коротком плече хромосомы 3 (3p21). В этом регионе, особенно интригуют гены рецепторов хемокинов CCR2 и CCR5, так они экспрессированы на поверхности CD4+ T-клеток и участвуют в устойчивости к вирусу иммунодефицита человека (19). Два исследования (20, 21) предположили уместность этих генов в предрасположенности к саркоидозу. Однако, интервал 8 cM между генами CCR и D3S1766 требует исследования дополнительных маркеров в регионе 3p21. Другой ген-кандидат 3p21 кодирует макрофаг-стимулирующий протеин-1 (MST1; 6 cM от D3S1766) и его рецептор (MST1R; 5 cM от D3S1766), которые вносят вклад в систему иммунной защиты бронхиального эпителия (22). Интересно, что D3S1766 расположен близко от D3S1076 (3 cM) и D3S1573 (6 cM), маркеров, которые были связаны c воспалительной болезнью кишечника (IBD) (16). Предположение об общих генетических факторах в патогенезе IBD и саркоидоза поддержано сосуществованием обоих болезней в 66 семьях из 1,026 Голландских пациентов с саркоидозом (7). В этом контексте, интересно что маркер D1S552 (цитогенетическая локализация 1p36), с NPL score 1.62 (p = 0.051) в нашем исследовании, был связан с восприимчивостью к IBD в другом исследовании (17).

Ген, кодирующий рецепторы гамма-цепи интерлейкина-2 (IL2RG), расположен между пиком DXS6789 (17 cM от IL2RG) и DXS7127 (4 cM от IL2RG). IL2RG - гамма-цепь нескольких рецепторов интерлейкина (IL-2, IL-4, IL-13, IL-15 и другие). Мутации, приводящие к потере функции гена, причиняют серьезную комбинированную иммунную недостаточность (SCID) (23). Кажется возможным, что менее серьезные вариации IL2RG также участвуют в измененных иммунных реакциях. Известна связь между серологическими уровнями IL-2R и прогнозом саркоидоза (24). Наследование X хромосомы, независимо от доминирования и пенетрантности, исключает передачу отец-сын IL2RG. Если бы вариации IL2RG наблюдались у большинства пациентов с саркоидозом, можно было бы ожидать малое число пар отец/сын. Однако, 4 пары отец /сын и ни одной пары отец/дочь были обнаружены при анкетном опросе пациентов с саркоидозом (5). Наш банк ДНК включал 8 пар отец/сын и 5 пар отец/дочь.

Из остальных минорных пиков, длинное плечо хромосомы 9 привлекает внимание из-за трех смежных маркеров во всех семьях (D9S934) или в подгруппе из 9 семей (D9D2157 и D9S1838) (p < 0.05). Возможные гены-кандидаты этого региона кодируют оросомукоиды (ORM1 и ORM2, 3 cM от D9S934) и бета-рецепторы трансформирующего фактора роста бета 1 (TGFBR1, 4 cM от D9S934). Хотя предполагалось, что аллель ORM1 может увеличивать риск саркоидоза (25), об исследованиях связи TGFBR1 и саркоидоза пока не сообщалось. Локус группы крови, близко расположенный (1 cM) к D9S1838, был проанализирован как генетический маркер в одном из первых исследований (10), и показал преобладание группы крови А в группе из 518 пациентов с саркоидозом.

С другой стороны, несколько предложенных генов-кандидатов восприимчивости к саркоидозу не показали общих аллелей у сибсов. Ген ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) расположен на длинном плече хромосомы 17 (17q23) и имеет полиморфный участок в интроне 16, в зависимости от присутствия или отсутствия делеции 287 пары оснований. Было предположено, что делеция связана с увеличенным риском саркоидоза (26). Однако, маркеры D17S2193 (1 cM от АПФ) и D17S1301 (19 cM от АПФ) не показали сцепления, с NPL score -0.71 (p = 0.76) и -0.67 (p = 0.75).

Другой кандидат - центромерный фрагмент хромосомы 16. IL-4R, ген восприимчивости к IBD (15) и ген, причиняющий синдром Блау (29), были картированы в этом регионе. Синдром Блау - мультиорганная гранулематозная воспалительная болезнь, которая часто начинается в детстве и походит на саркоидоз в многих аспектах (30). Он вызывается единственным геном. Мы не обнаружили никаких доказательств связи маркеров D16S769 (6 cM от BLAU) и D16S753 (1 cM от BLAU), ни для 14 других микросателлитных полиморфизмов на хромосоме 16. Результаты параметрического анализа сцепления связи исключили вклад гена Блау в генетическую предрасположенность к саркоидозу.

Клональность популяций T-клеток при саркоидозе была обнаружена при анализе рецепторов T-клеток (TCR), и могла быть связана с клиническими проявлениями и прогнозом (32, 33). Кластеры TCRA и TCRD расположены на хромосоме 14q11, TCRB в 7q35 и TCRG в 7p15. Из этого локуса, TCRB наиболее близко расположен (6 cM) к D7S3070, с NPL score 1.86 (p = 0.031) во всей группе, но NPL score был - 0.34 в подгруппе из 9 семей. Клональность популяций T-клеток - последствие контакта антигена и HLA, скорее чем независимый результат генетической вариабильности генов кластера TCR. Никакой связи с саркоидозом не было обнаружено в исследовании чернокожих пациентов для 14p11, но TCRB не был проверен (34). В любом случае, значительное различие наших результатов во всех семьях и для подгруппы из 9 семей для 7q35 и MHC локуса, не поддерживает гипотезу, что наследственное нарушение режима селекции T-клеток играет роль в последнем случае.

Варианты гена естественного, связанный с резистентностью человеческого белка макрофагов (NRAMP1) связаны с риском туберкулеза (35) и также могут влиять на риск саркоидоза (36). NRAMP1 расположен на длинном плече хромосомы 2 (2q35), между маркерами D2S1384 (15 cM от NRAMP1) и D2S1363 (14 cM от NRAMP1). Маркеры слишком далеки от NRAMP1, чтобы влиять на минорный эффект этого гена. То же самое справедливо для гена IL-1alpha (IL1A) на той же самой хромосоме (2q13). В исследовании чернокожих пациентов с саркоидозом была обнаружена низкая частота аллеля IL1A (34), но ген расположен в середине 19 cM интервала, между D2S2972 и D2S1328, и минорный эффект поэтому мог остаться необнаруженным.

Мы использовали 206 равномерно распределенных маркеров для начального скрининга всех неполовых хромосом и X хромосомы. Средний интервал 19.6 cM между маркерами слишком большой, чтобы гарантировать обнаружение всех участков с общими аллелями. Действительно, мы пропустили бы пик в регионе MHC при использовании только основного набора маркеров, включая D6S2439 (NPL score= 1.43, p = 0.075) и D6S1017 (NPLscore = 1.55, p = 0.06) в регионе MHC. Дополнительный анализ соседних маркеров на хромосоме 3 увеличил NPL score с 2.19 (p = 0.014) до 2.39 (p = 0.009).

Однако, обнаружение генов предрасположенности не гарантируется даже при намного более высокой плотности маркеров. В зависимости от числа генов, вовлеченных в предрасположенность к саркоидозу, и от степени этиологической гетерогенности болезни, должно быть проверено намного больше маркеров. Генетические компоненты с минорными эффектами требуют исследования намного большего числа родственных пар с саркоидозом. Существенное различие между нашими результатами для полной группы семей и для подгруппы из 9 семей, может быть индикатором гетерогенности генетического вклада в саркоидоз. Однако, поскольку число семей в подгруппе со сложным паттерном наследования было 9, исследование не имело статистической мощности для обнаружения сцепления или гетерогенности.

С другой стороны, очень близкие маркеры не дают намного больше информацию о сцеплении, вследствие недостатка рекомбинации между маркерами в пределах малых семей. Однако, неустойчивость связи между маркерами и гаплотипом, дает сильное основание для тонкого картирования генов восприимчивости в изолированных популяциях или в больших семьях, как это было сделано в северных районах Швеции (4).

Микросателлитное генотипирование и картирование предполагаемого локуса гена предрасположенности - только первый шаг к раскрытию сложной генетики саркоидоза. Следующим шагом должна быть идентификация генов-кандидатов в регионах хромосомы со значительной связью с саркоидозом, используя дополнительные методы исследования. Когда гены предрасположенности будут идентифицированы, может быть сделана попытка оценить влияние отдельных генов предрасположенности и триггеров окружающей среды. Однако, в отсутствии знания патогенетических эпитопов, эта задача может быть усложнена ограниченным числом пациентов и трудностями в подборе соответствующей группы контроля. На ранней стадии исследования, может быть полезен другой метод исследования семей (38). Дизайн этого исследования включает сибсов без болезни, классифицированных согласно числу вариантов гена предрасположенности, общими с их братьями/сестрами с саркоидозом. Тщательное сравнение этих групп с учетом воздействий окружающей среды, может помочь разрешить тайну саркоидоза.