The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences 62:1199-1203 (2007)

Анализ длины теломеры при саркоидозе

Jing Zhi Guan, Toyoki Maeda, Masahiro Sugano, Jun-ichi Oyama, Yoshihiro Higuchi, Tomokazu Suzuki and Naoki Makino
Division of Molecular and Clinical Gerontology, Department of Molecular and Cellular Biology and Division of Clinical Genetics, Department of Molecular and Clinical Genetics, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, Oita, Japan.

Реферат

Мы исследовали длину теломеры (терминальный фрагмент рестрикции TRF) у 111 пациентов с саркоидозом относительно средней длины TRF и распределения длины теломеры. Наблюдалось существенное уменьшение средней длины TRF у пациентов с саркоидозом по сравнению с согласованной по возрасту контрольной группой, принимая во внимание, что уменьшенние длины теломеры было связано только с возрастом у мужчин. Среднее укорочение TRF было ускорено у мужчин в третьем и пятом десятилетии жизни и у женщин в четвертом и пятом десятилетии жизни. Мы также обнаружили существенное возрастное уменьшение длины теломеры 9.4-6.6 kb у мужчин и у женщин во втором десятилетии жизни и увеличении длины теломеры 4.4-2.3 kb у мужчин и у женщин во втором десятилетии жизни и у мужчин в пятом десятилетии жизни у пациентов с саркоидозом по сравнению с контрольной группой. Эти результаты предполагают возникновение возрастных изменений длины теломеры у пациентов с саркоидозом, независимо от возраста пациента в начале саркоидоза.

Введение

Саркоидоз - системная гранулематозная болезнь неизвестной этиологии, которая поражает легкие, глаза, печень и другие органы. Диагноз основан на рентгенографических и клинических данных и обнаружении неказеозных эпителиоидноклеточных гранулем в биопсийной ткани. Причина саркоидоза остается неизвестной. Многочисленные исследования показали, что в патогенезе саркоидоза важную роль играют воспалительные процессы (1,2). Это первичная причина использования противовоспалительных средств и иммунодепрессантов для лечения саркоидоза.

Теломера, концевой участок хромосомы, играет важную роль в сохранении целостности хромосомы при делении клетки. Теломера подвергается укорачиванию при каждом делении клетки и служит маркером репликационной истории клетки. Воспаление, которое усиличивает пролиферацию клеток и окислительный стресс, который увеличивает скорость эрозии теломеры при репликации, ведет к укорочению длины теломеры (3). Теломеры, как структуры содержащие триплет G, являются высоко чувствительными к повреждению окисидантами (4). Окислительный стресс ускоряет укорочение теломеры, принимая во внимание, что антиоксиданты замедляют этот процесс (3).

Окислительный стресс вызывает атеросклеротические изменения в сосудистом эндотелии (5). Недавно было обнаружено, что атеросклеротические процессы сопровождаются укорочением теломеры не только в сосудистом эндотелии, но и у периферических лейкоцитов, таким образом предполагая, что персистирующий системный окислительный стресс влияет на укорочение теломеры у клеток периферической крови (6). Поэтому, иммунные и воспалительные процессы при саркоидозе могут быть связаны с усилением системного окислительного стресса и пролиферации клеток, таким образом ведя к укорочению теломеры.

Несколько недавних исследований показали, что потеря нескольких сотен пар оснований коротких теломер могла играть важную роль в старении клетки, но что такая потеря не может быть обнаружена при помощи традиционного анализа длины терминального фрагмента рестрикции (TRF) (7). В настоящем исследовании мы оценили изменение длины теломеры при саркоидозе, используя традиционный анализ средней длины TRF и анализ распределения длины теломеры в нескольких молекулярных регионах у клеток периферической крови, чтобы ответить на следующие вопросы: (а) существует ли различие в длине теломеры между пациентами с саркоидозом и контрольной группой; (b) как длина теломеры изменяется при саркоидозе.

Пациенты

Образцы ДНК были получены из клеток периферической клеток 111 пациентов с недавно диагностированным саркоидозом. Диагноз был установлен в соответствии с критериями Japan Sarcoidosis Society Brain Bank. В исследовании были включены 47 мужчин и 64 женщины, возраст от 20 до 56 лет, средний возраст 41.67±1.10 лет. Образцы крови были получены до начала лечения у всех пациентов. Пациенты были стратифицированы в возрастные группы с различием по возрасту 10 лет. Группы были подобны по статусу курения, семейного дохода, уровня физической активности, пола и социально-экономического статуса. В контрольную группу было включено 126 здоровых индивидуумов (63 мужчины и 63 женщины, средний возраст 44.34±0.88 лет), согласованую по возрасту, полу и образу жизни. Исследование было одобрено комитетом по этике Kyushu University.

Результаты

Сравнение двух методов анализа длины теломеры

Мы оценили изменение длины теломеры, используя традиционный анализ средней длины TRF и анализ распределения длины теломеры в нескольких молекулярных регионах. Оба метода были необходимыми и важными инструментами для обнаружения изменения длины теломеры в нашем исследовании. Например, мы не смогли найти различия в средней длине TRF между пациентами и контрольной групой в возрасте 20-29 лет, принимая во внимание, что существенное уменьшение длины более длинных теломер размером 23.1-9.4 kb или 9.4-6.6 kb и увеличение длины самых коротких теломер, размером 2.3-4.4 kb у пациентов с саркоидозом против контролльной группы было обнаружено с помощью анализа распределения длины теломеры. Комбинация из этих двух методов помогла нам проанализировать изменение длины теломеры более точно.

Скорость изменения средней длины теломеры у пациентов с саркоидозом и контрольной группы

Средняя длина TRF у всех пациентов с саркоидозом была 8.57 ± 0.20 kb, в контрольной группе 10.15±2.88 kb. Различие между ними было статистически значимым (p <0.001). Анализ распределения длины теломеры также показал статистически значимое различие между средней длиной TRF у пациентов с саркоидозом и контрольной группой в возрасте 20-29 лет. Скорость изменения длины теломеры оказалась почти одинаковой (-77 bp/год против -72 bp/год). Эти результаты предполагают возникновение изменений длины теломеры с возрастом. Кроме того, мужчины имели более высокую скорость изменения средней длины теломеры чем женщины в контрольной группе (-99 bp/y против -50 bp/y) и у пациентов с саркоидозом (-116 bp/год против -36 bp/год), хотя различие не было статистически значимым.

Возрастные изменения средней длины TRF

Длина теломеры уменьшалась с возрастом у мужчин (p < 0.001), особенно в возрасте 40-49 лет и 50-59 лет по сравнению с мужчинами в возрасте 30-39 лет (9.25±0.45, 8.67±0.51 против 11.87±0.68 kb, p < 0.025, p < 0.005, соответственно) в контрольной группе и у пациентов с саркоидозом в возрасте 20-29 лет по сравнению с пациентами в возрасте 50-59 лет (10.29±0.55 против 7.01±0.60 kb, p < 0.001). Никаких существенных различий длины теломеры с возрастом не наблюдалось у женщин. Кроме того, длина теломеры у пациентов с саркоидозом была значительно короче, чем в контрольной группе, особенно мужчин в возрасте 30-39 лет (9.03±0.71 против 11.87±0.68 kb, p = 0.005) и в возрасте 50-59 лет (7.01±0.60 против 8.67±0.51 kb, p < 0.025) и для женщин в возрасте 40-49 лет (8.20±0.53 против 11.65±0.56 kb, p < 0.001) и в возрасте 50-59 лет (8.16±0.52 против 9.64±0.49 kb, p < 0.05).

Различия изменений длины теломер различных молекулярных размеров

Мы обнаружили существенное уменьшение длины теломеры 23.1-9.4 kb с возрастом у мужчин с саркоидозом, особенно в возрасте 20-29 лет против 50-59 лет (36.08±2.68 против 24.29±3.0, p < 0.025), принимая во внимание, что никаких различий не наблюдалось у мужчин в контрольной группе. Кроме того, умеренное, но статистически значимое увеличение было обнаружено у мужчин с саркоидозом против мужчин контрольной группы в возрасте 50-59 лет (p < 0.05). Никаких возрастных различий не было отмечено для женщин с саркоидозом и женщин контрольной группы.

Наблюдалось значительное уменьшение длины теломеры 9.4-6.6 kb у пациентов с саркоидозом против контрольной группы в возрасте 20-29 лет для мужчин (26.17±1.23 против 34.76±1.92, p < 0.005) и для женщин (24.40±2.23 против 32.35±1.76, p < 0.01). Кроме того, наблюдалось уменьшение длины теломеры с возрастом в контрольной группе в возрасте 30-39, 40-49 и 50-59 против 20-29 лет (26.89±1.53, 24.79±1.02 и 24.24±1.13 против 34.76±1.92, p < 0.05, p < 0.001, p < 0.001, соответственно). Никаких возрастных изменений не было найдено для женщин, среди пациентов или в контрольной группе.

Никаких различие по длине теломеры 6.6-4.4 kb в зависимости от возраста не было отмечено для мужчин и женщин. Однако, для самой короткой теломеры 2.3-4.4 kb, значительно увеличение длины было обнаружено у пациентов с саркоидозом против контрольной группы, особенно для мужчин в возрасте 20-29 лет (16.75±1.91 против 8.51±2.98, p < 0.025) и 50-59 лет (25.20±2.10 против 19.54±1.76, p < 0.05) и для женщин в возрасте 20-29 лет (19.64±3.44 против 9.74±2.72, p < 0.05). Кроме того, мы обнаружили увеличение длины теломеры с возрастом у мужчин, особенно для контрольной группы в возрасте 40-49 и 50-59 лет против 20-20 лет (19.90±1.58, 19.54±1.76 против 8.51±2.98, p < 0.01, p = 0.01, соответственно) и для пациентов в возрасте 50-59 лет против 20-29 лет (25.20±2.10 против 16.75±1.91, p <0.025). Никаких возрастных изменений не наблюдалось у женщин.

Обсуждение

По нашим данным, это первое исследование изменения длины теломеры в зависимости от возраста и пола у пациентов с саркоидозом. Мы обнаружили значительное возрастное изменение длины теломер, включая среднюю длину TRF у пациентов с недавно диагностированным саркоидозом и согласованной контрольной группе. Мы обнаружили, что средняя длина TRF у клеток периферической крови была значительно меньше у пациентов с саркоидозом чем в контольной группе в возрасте 30-59 лет.

Подобные результаты были получены с помощью анализа распределения длины теломеры в нескольких молекулярных регионах. Мы наблюдали существенное укорочение более длинных теломер (9.4-6.6 kb) и увеличение самых коротких теломер (2.3-4.4 kb) у пациентов с саркоидозом против контрольной группы в возрасте 20-29 лет. Однако, по скорости укорочения теломеры эти группы практически не различались. Эти результаты предполагают, что длина теломеры у пациентов с саркоидозом претерпевает возрастные изменения, особенно у более молодых пациентов. Влияние процесса старения на длину теломер при саркоидозе, особенно у более молодых пациентов, предполагает возможность раннего постановки диагноза для этих пациентов.

Мы также проанализировали различия длины теломер при саркоидозе, связанные с полом. Мы не наблюдали статистически значимых различий в зависимости от возраста у женщин, принимая во внимание, что укорочение теломеры значительно прогрессировало с возрастом у мужчин, что совместимо с предыдущими исследованиями, показавшими, что эстрогены могут стимулировать теломеразу посредством эстроген-отвечающих элементов, которые существуют у этого фермента (12). Также мы обнаружили меньшую скорость изменения длины теломеры у женщин против мужчин и у пациентов с саркоидозом против контрольной группы. Хотя эти различия не были статистически значимы, такая тенденция наблюдалась.

Большое количество данных указывает, что укорочение теломеры ускоряется окислительным стрессом. Более короткая длина теломеры у мужчин с возрастными болезнями возможно связана с окислительным стрессом и хроническим воспалением (13). Предположение, что хроническое воспаление при саркоидозе вызывает непрерывный окислительный стресс, возможно, может объяснить более высокую скорость уменьшения длины теломеры у клеток периферической крови.

Причина саркоидоза остается неизвестной. Многие наблюдения совместимы с инфекционной или инфекционной этиологией (14-17). Уровень АПФ полезен для контроля активности болезни (18) и этот серологический маркер является единственный, рекомендованным WASOG (19). Хотя пока не сообщалось о связи между средней длиной TRF и уровнем ангиотензина II, можно предположить, что нарушение регуляции системы ренин-ангиотензин может приводить к индукции сосудистого окислительного стресса. Предполагается, что ангиотензин II усиливает воспалительный процесс (20) посредством индукции некоторых цитокинов (21). Серологический уровень АПФ при постановки диагноза в нашем исследовании не коррелировал со средней длиной TRF у пациентов с саркоидозом. Однако, уровень АПФ и ангиотензина II в течение всей болезни могут быть связаны со средней длиной TRF. Для выяснения связи между серологическим уровнем АПФ и уменьшением длины теломеры необходимы дальнейшие исследования.

Известно, что саркоидоз немного чаще просходит у женщин, чем у мужчин (22). Предыдущее исследование показало, что эстрогены вызывают экспрессию сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) (23) и увеличение уровня VEGF было связано с воспалением и окислительным стрессом. Однако, эстрогены также могут стимулировать теломеразу при уменьшении окислительного стресса (12,24). Мы обнаружили существенное укорочение теломер у женщин с саркоидозом против женщин контрольной группы, хотя никаких изменений длины теломеры с возрастом не наблюдалось, таким образом предполагая, что протективная функция эстрогенов не играет важной роли при саркоидозе. Дальнейшие исследования должны объяснить различные механизмы действия эстрогенов у женщин с саркоидозом и контрольной группы.