Eur Respir J 2003; 21:421-428

Альвеолярные макрофаги - главный источник фактора некроза опухоли альфа у пациентов с саркоидозом

H. Fehrenbach, G. Zissel, T. Goldmann, T. Tschernig, E. Vollmer, R. Pabst and J. Muller-Quernheim
Dept of Internal Medicine (Respiratory Medicine), Philipps-University, Marburg, Dept of Pneumology, Medical University Hospital, Freiburg, Dept of Clinical and Experimental Pathology, Medical Hospital, Research Centre, Borstel, and Dept of Functional and Applied Anatomy, Hannover Medical School, Hannover, Germany

Реферат

Фактор некроза опухоли альфа (TNF-alpha), как известно, играет главную роль в формировании неказеозной гранулемы, признака саркоидоза. Главный клеточный источник TNF-alpha in situ неизвестен. Изучались материалы трансбронхиальной биопсии 14 пациентов с саркоидозом и 12 пациентов без саркоидоза, используя иммуногистохимический анализ для исследования TNF-alpha, T-клеток (CD3), макрофагов (CD68) и эпителиальных клеток (MNF116). Было измерено спонтанное производство TNF-alpha (sr-TNF-alpha) у недавно изолированных клеток бронхоальвеолярного лаважа, культивированных в течение 24 часов, используя иммуносорбентный анализ с применением фиксированных ферментов (ELISA). Иммуногистохимический анализ показал локализацию TNF-alpha только у CD68 клеток. Ткань с увеличенной иммунореактивностью показала более высокие уровни sr-TNF-alpha (1,667±504 pg/mL против 211±60 pg/mL). Группа пациентов с саркоидозом могла быть идентифицирована по присутствию скоплений альвеолярных макрофагов. Уровни sr-TNF-alpha были самыми высокими в этой группе (2,700±769 pg/mL) по сравнению с пациентами с нормальной гистологией (221±61 pg/mL) или с пациентами с уже сформированными гранулемами (460±137 pg/mL), принимая во внимание, что по большинству клинических параметров, эта подгруппа была промежуточной.

Результаты этого исследования подтверждают предположение, что альвеолярные макрофаги - главный источник фактора некроза опухоли альфа в начальной стадии саркоидоза. Авторы считают, что у исследованых пациентов, скопления альвеолярных макрофагов могут быть предшественниками гранулем, если не самими гранулемами in statu nascendi (в самом начале, в момент образования).

Реферат

Саркоидоз - системная гранулематозная болезнь неизвестной этиологии, характеризованная наличием неказеозных гранулем (1-5). Поскольку легкие и внутригрудные лимфатические узлы вовлекаются почти всегда, большинство пациентов сообщает об острых или постепенно развившихся респираторных проблемах. Формирование гранулемы характеризовано скоплением, пролиферацией и спонтанной активностью макрофагов и T-лимфоцитов на участках воспаления. Как только мононуклеарные клетки накапливаются в легком, макрофаги дифференцируются в эпителиоидные и многоядерные гигантские клетки.

Среди медиатотров, производимых клетками бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), фактор некроза опухоли альфа играет главную роль в привлечении воспалительных клеток и формировании гранулемы (6). Иммунные клетки, например альвеолярные макрофаги, являются главными источниками TNF-alpha в легком (7). Спонтанное производство TNF-alpha (8), интерлейкина-1 (9) и IL-2 (10) активизированными макрофагами и T-клетками считается основным фактором, ведущим к формированию иммунных гранулем. Активизированные T-клетки также могут вносить вклад в производство провоспалительных цитокинов (11- 13). Кроме того, эпителиальные клетки, которые способны дополнительно активизировать T-клетки (14), при некоторых обстоятельствах также могут производить TNF-alpha (15-17). Кроме того, пул биоактивного TNF-alpha дополнительно регулируется производством растворимых рецепторов TNF (18). Большинство этих данных было получено при исследовании изолированных клеток или при анализе клеток БАЛ. Однако, меньше известно относительно ситуации in situ.

В настоящем исследовании авторы стемились определить, какой тип клеток может рассматриваться как главный источник TNF-alpha in situ у пациентов с легочным саркоидозом. Авторы сначала измерили уровни спонтанного производства TNF-alpha (sr-TNF-alpha) у недавно изолированных клеток БАЛ у пациентов с саркоидозом по сравнению с пациентами без саркоидоза, используя иммуносорбентный анализ с применением фиксированных ферментов (ELISA) как было описано в предыдущем исследовании (8). Уровни sr-TNF-alpha коррелировали с присутствием TNF-alpha иммунореактивных клеток в материале трансбронхиальной биопсии. Затем материалы трансбронхиальных биопсий были проанализированы с помощью иммуногистохимического анализа для локализаци TNF-alpha с маркерами макрофагов (CD68), T-клеток (CD3) и эпителиальных клеток (цитокератин MNF116), соответственно, чтобы показать, какой тип клеток является главным источником TNF-alpha in situ.

Материалы и методы

Дизайн исследования

Недавно изолированные клетки БАЛ 14 пациентов с саркоидозом и 12 пациентов без саркоидоза были культивированы без любых стимулов в течение 24 часов. Уровни sr-TNF-alpha в супернатанте были измерены с помощью ELISA (8, 19). Материалы трансбронхиальных биопсий, полученных при прооведении диагностической бронхоскопии, были проанализированы с помощью стандартного иммуногистохимического анализа для TNF-alpha (20, 21). Определялась корреляция паттерна окрашивания с паттерном иммуногистохимического анализа для маркеров T-клеток (CD3), макрофагов (CD68) и эпителиальных клеток (цитокератин MNF116).

Характеристики пациентов

Диагноз легочного саркоидоза был установлен у 14 индивидуумов, с использованием специфических критериев, включая трансбронхиальную биопсию (3). Пациенты были разделены на две группы - ''клинически активный саркоидоз'' или ''клинически бездействующий саркоидоз''. Использовались следующие критерии: возникновение новых или прогрессирование существующих легочных симптомов, например кашель и одышка, недавнее развитие новых или прогрессирование существующих рентгенографических ненормальностей, и/или системные симптомы, согласно рекомендациям WASOG (22). Группа контроля состояла из 12 пациентов, у которых проводилась диагностическая бронхоскопия в ходе клинического исследования и ретроспективно у них не было найдено любой воспалительной болезни легкого. Только пациенты с доказанным отсутствием любой болезни легкого, которая могла бы исказить результаты иммунологических тестов, были включены в группу контроля. БАЛ был выполнен в ходе клинически показанной бронхоскопии для постановки диагноза или для новой оценки воспалительной активности. Ни один из пациентов не получал противовоспалительную терапию во время проведения БАЛ.

Результаты

Иммуногистохимический анализ показал преобладание клеток, иммунореактивных для TNF-alpha в альвеолярных пространствах и в центре неказеозных гранулем. Не имелось соответствия паттерна окрашивания для TNF-alpha, CD3 или MNF116. CD3 иммунореактивные клетки в основном были локализованы в корковой зоне гранулем, отдельные клетки были обнаружены вблизи центра гранулемы, принимая во внимание, что MNF116 иммунореактивные клетки всегда находились на периметре гранулемы.

Пациенты с саркоидозом имели значительно более высокие уровни TNF-alpha (1,226±404 pg/mL) чем пациенты в группе контроля (239±76 pg/mL; p=0.029). Случаи, которые имели более высокую иммунореактивность ткани для TNF-alpha, как было оценено с помощью иммуногистохимического анализа, характеризовались более высокими уровнями спонтанного производства TNF-alpha иммунными клетками БАЛ (1,667±504 pg/mL) по сравнению со случаями с небольшой иммунореактивностью ткани (211±60 pg/mL; p=0.002). Соответственно, не имелось никаких существенных различий в уровнях sr-TNF-alpha при сравнении подгрупп со слабой против сильной иммунореактивностью для CD3 (p=0.437) и с умеренной против сильной иммунореактивностью для MNF116 (p=0.308), соответственно.

Хотя различия в уровнях sr-TNF-alpha между подгруппами, характеризованных слабым (189±72 pg/mL), умеренным (374±118 pg/mL) или сильным окрашиванием для CD68 (1,242±439 pg/mL), не были статистически значимы, имелось очевидное преобладание высоких уровней TNF-alpha в подгруппе случаев с сильной иммунореактивностью для CD68, то есть с высокой плотностью CD68 иммунореактивных клеток.

Чтобы точнее охарактеризовать подгруппу пациентов с высокими уровнями sr-TNF-alpha, соответствующие материалы трансбронхиальной биопсии были проанализированы дополнительно для поиска гистологических особенностей. С помошью этого подхода, была идентифицирована подгруппа из 5 пациентов, с присутствием характерных скоплений альвеолярных макрофагов, скорее чем с хорошо сформированными гранулемами. Интересно, что эта подгруппа включала 4 пациентов с самыми высокими уровнями TNF-alpha (> 1,500 pg/mL). Эта подгруппа имела значительные различия по уровню sr-TNF-alpha (2,700±769 pg/mL) от подгруппы с нормальной гистологией (221±61 pg/mL; p < 0.05). Подгруппа, характеризованная присутствием хорошо сформированных гранулем имела промежуточный уровень TNF-alpha (460±137 pg/mL).

БАЛ группы пациентов, у которых были обнаружены скопления альвеолярных макрофагов, характеризовался промежуточной численностью альвеолярных макрофагов, лимфоцитов и субпопуляций лимфоцитов между случаями с нормальной гистологией и пациентами с гранулемами. Не имелось никакой корреляции к активностью болезни. Однако, пациенты, с присутствием скоплений альвеолярных макрофагов в материалах биопсии имели самую низкую жизненную емкость (78.9±10.2 %) и общую емкость легких (73.8±10.4 %) по сравнению с другими группами.

Обсуждение

Критерий саркоидоза - формирование неказеозной гранулемы, которая характеризована накоплением, пролиферацией и спонтанной активностью макрофагов и T-лимфоцитов на участках воспаления (1, 4, 5). Среди медиаторов, вовлеченных в формирование гранулемы, TNF-alpha играет главную роль (2, 6). В настоящем исследовании было показано, что альвеолярные макрофаги являются основным источником производства TNF-alpha in situ в патогенезе саркоидоза. Самые высокие уровни биоактивного TNF-alpha, спонтанно производимые изолированными клетками БАЛ, были связаны с присутствием совокупностей альвеолярных макрофагов, которые могут быть предшественниками гранулем, если не самими гранулемами in statu nascendi (в самом начале, в момент образования). Ранее авторы продемонстрировали, что увеличенное производство TNF-alpha связано с увеличенным риском прогресса болезни (19). Результаты настоящего исследования подтверждают важную роль альвеолярных макрофагов и TNF-alpha в начальной стадии саркоидоза.

Альвеолярные макрофаги - основные действующие лица в патогенезе саркоидоза. Было показано, что альвеолярные макрофаги пациентов с саркоидозом спонтанно производят высокие уровни TNF-alpha (8, 23, 24) и IL-1 (9), что указывает, что эти клетки активизированы in vivo. Эти результаты были поддержаны исследованием кинетики экспрессии гена TNF-alpha (8). Кроме того, был предложен аутокринный механизм, посредством которого альвеолярные макрофаги регулируют пул биоактивного TNF-alpha посредством производства растворимых рецепторов TNF (18). Обнаружение сильной связи иммунореактивности ткани для TNF-alpha с уровнями биоактивного TNF-alpha, спонтанно произведенного иммунными клетками БАЛ, настоятельно поддерживают предположение, что результаты исследования клеток БАЛ действительно отражают состав клеточной среды, в который развиваются гранулемы (5). Результаты нашего исследования внутриклеточной иммунореактивности TNF-alpha в скоплениях альвеолярных макрофагов указывают, что альвеолярные макрофаги, вероятно, играют важную роль на ранней стадии формирования гранулемы.

Более высокие уровни производства TNF-alpha, наблюдаемого у пациентов, характеризованных наличием скоплений альвеолярных макрофагов, по сравнению с пациентами с хорошо развитыми гранулемами, поддерживает предположение, что TNF-alpha является важным в начальной стадии формирования гранулемы (1, 5). Недавние данные указывают, что субпопуляции альвеолярных макрофагов ответствены за секрецию TNF-alpha у пациентов с легочным саркоидозом (24). Пациенты, характеризованные этой (исследовательской, но не диагностической) гистопатологической особенностью, имели клинические параметры, которые были промежуточными между пациентами с нормальной гистологией и пациентами с гранулемами. Поэтому, скопления макрофагов могут быть предшественниками гранулем, если не самими гранулемами in statu nascendi (в самом начале, в момент образования).

Альвеолярные макрофаги пациентов с саркоидозом имеют множественные секреторные функции, они производят другие цитокины, IL-15, факторы роста, MCP-1, RANTES и MIP-1alpha и MIP-1beta (2, 26, 27). Таким образом, альвеолярные макрофаги могут влиять на привлечение и ответ T-клеток (28). В свою очередь, T-клетки, как известно, спонтанно производят увеличенные уровни некоторых цитокинов и хемокинов, например IL-2 и интерферона альфа (29-31). Хотя никакой существенной иммунореактивности T-клеток для TNF-alpha не наблюдалась, недавнее исследование сообщило, что в БАЛ но не в периферической крови пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля наблюдалось увеличенное число T-клеток, которые экспрессировали TNF-alpha (11). Однако, в исследовании (13) существенной разницы обнаружено не было.

Альвеолярные эпителиальные клетки - другой тип клеток паренхимы легкого, которые могут вносить вклад в производство TNF-alpha. McRitchie с коллегами (17) продемонстрировали, что липополисахарид (LPS) может стимулировать производство TNF-alpha в первичных культурах альвеолярных эпителиальных клеток тип II (17). LPS-индуцированное производство TNF-alpha эпителиальных клеток регулируется прежде всего на транскрипционном уровне, в отличие от макрофагов и нейтрофилов. Было обнаружено, что первичные культуры бронхиолярно-альвеолярных эпителиальных клеток, состоящие из альвеолярных эпителиальных клеток тип II и клеток Клара, синтезировали TNF-alpha (33). Кроме того, иммунореактивность для TNF-alpha была обнаружена у альвеолярных эпителиальных клеток тип II при остром респираторном дистресс-синдроме и идиопатическом легочном фиброзе (15, 16, 34). В настоящем исследовании, не имелось никаких признаков эпителиальной локализации секреции TNF-alpha ни у пациентов с саркоидозом, ни в группе контроля.

По данным этого исследования, авторы не могут утверждать, что T-клетки или эпителиальные клетки при саркоидозе производят низкие уровни фактора некроза опухоли альфа. Однако, полученные данные указывают, что альвеолярные макрофаги - главный источник производства фактора некроза опухоли альфа у пациентов с саркоидозом.