Arch Dermatol. 2005;141:57-59

Отсутствие рибосомной РНК Mycobacterium tuberculosis Complex при саркоидозе

Joaquim Marcoval, MD; Miguel A. Benitez, MD; Fernando Alcaide, MD; Juan Mana, MD
Departments of Dermatology, Microbiology and Internal Medicine, Hospital de Bellvitge, University of Barcelona, Barcelona, Spain

Реферат

Цель: определить, присутствует ли рибосомная РНК (рРНК) Mycobacterium tuberculosis Complex в гистологических препаратах пациентов с саркоидозом. Дизайн: проспективное исследование. Место проведения: университетская клиника. Пациенты: 35 пациентов с саркоидозом, диагностированных в университетской клинике Bellvitge, Барселона, Испания. Образцы ткани с гранулематозным воспалением были изучены в период между 1997 и 2001 г. у всех пациентов. Для каждого образца саркоидной ткани, был исследован по крайне мере один образец ткани в отрицательной группе контроля. Методы: обнаружение рРНК Mycobacterium tuberculosis Complex производилось с использованием изотермической ферментативной системы амплификации рРНК Mycobacterium tuberculosis Complex. Также производился поиск кислотоупорных организмов с помощью окрашиания и культуральных исследований. Результаты: 78 экземпляров биопсии (кожа - 57, лимфатические узлы -10, слезная железа - 3, селезенка - 2, легкое - 2, мышцы 2, кость -1, нерв - 1) были получены у 74 пациентов (35 пациентов с саркоидозом и 39 пациентов в группе контроля). Окрашиванение для поиска кислотоупорных организмов и культуральные иследования было отрицательным во всех случаях. рРНК Mycobacterium tuberculosis не была обнаружена в экземплярах биопсии всех пациентов с саркоидозом и у пациентов группы контроля, у которых культуральные исследования были отрицательны для Mycobacterium tuberculosis. рРНК была обнаружена в 6 гистологических препаратах положительной группы контроля, у которых культуральные исследования показали рост Mycobacterium tuberculosis. Заключение: хотя предыдущие исследования сообщили, что микобактериальные антигены могут играть роль в формировании гранулемы у некоторых пациентах с саркоидозом, наши результаты говорят, что Mycobacterium tuberculosis не может рассматриваться как этиологический агент болезни.

Введение

Саркоидоз - мультисистемная болезнь, которая характеризуется формированием неказеозных гранулем в различных органах. Хотя этиология саркоидоза остается неизвестной (1), существование кластеров болезни и сезонных вариаций заболеваемости говорит, что инфекционные агенты окружающей среды могут играть роль в развитии саркоидоза (2-3). Кроме того, определенное подобие клинических, патологических и иммунологических ненормальностей у пациентов с саркоидозом и туберкулезом, позволяют предположить, что микобактериальная инфекция может быть связана с патогенезом саркоидоза (2).

В последние годы, в нескольких исследованиях была сделана попытка обнаружить микобактериальную ДНК у пациентов с саркоидозом с помощью ПЦР. В некоторых исследованиях, микобактериальная ДНК была найдена приблизительно в половине образцов, в то время как в других исследованиях она вообще не была обнаружена. Большинство этих исследований было ретроспективными и было выполнено на тканях, сохраненных в парафине. Только в одном исследовании проводился поиск специфической микобактериальной рРНК в недавно полученных образцах тканей у небольшого числа пациентов с саркоидозом (n=5) (25).

Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы проспективно определить присутствие жизнеспособных организмов M. tuberculosis в недавно полученных образцах ткани пациентов с саркоидозом.

Пациенты и группа контроля

Образцы тканей пациентов с саркоидозом были получены в период 1997 - 2001 г. в университетской клинике Bellvitge, Барселона, Испания. Диагноз системного саркоидоза был установдлен согласно критериям ATS/ERS/WASOG (1). Половина полученной при биопсии ткани у каждого пациента была зафиксирована в 10 % формальдегиде и обработана для гистологического исследования для определения наличия гранулем в образцах.

По крайней мере один образец ткани в качестве отрицательной группы контроля был включен в исследование для каждого образца ткани пациента. Образцы отрицательной группы контроля были получены из нормальной ткани, полученной у пациентов без свидетельств саркоидоза или туберкулеза и были проанализированы по той же самой метотодике, как и образцы пациентов с саркоидозом. Большинство образцов кожи были получены при небольших хирургических операциях.

Результаты

Были изучены 78 образцов ткани, полученных у 74 пациентов (35 пациентов с саркоидозом и 39 в группе контроля). 37 образцов ткани, полученных из специфических гранулематозных повреждений у 35 пациентов с саркоидозом включали: кожу (n = 28), лимфатический узел (n = 5), мышцу (n = 2), легкое (n = 1) и слезную железу (n = 1). 41 образец ткани, полученный у 39 пациентов группы контроля, включал кожу (n = 29), лимфатический узел (n = 5), селезенку (n = 2), слезную железу (n = 2), легкое (n = 1), кость (n = 1) и нерв (n = 1).

Все образцы ткани, включенные в исследование были отрицательные для кислотостоупорных организмов. Аналогично, культуральные исследования были отрицательными для Mycobacterium tuberculosis по крайней мере через 6 недель инкубации.

Все образцы ткани, включенные в исследование были отрицательны для рРНК Mycobacterium tuberculosis. Однако, рРНК Mycobacterium tuberculosis была обнаружена в 6 гистологических препаратах положительной группы контроля, культуральные исследования для которых показали присутствие Mycobacterium tuberculosis.

Комментарий

В настоящем исследовании мы не обнаружили присутствие рРНК Mycobacterium tuberculosis в недавно полученных образцах ткани гранулематозных повреждений, полученных у пациентов с системным саркоидозом. Окрашиваение и культуральные исследования также были отрицательны для Mycobacterium tuberculosis.

Клиническое и патологическое подобие легочному туберкулезу, позволяют предположить возможную роль микобактерий в этиологии саркоидоза. Гистопатологические особенности гранулем и редкое присутствие казеозного некроза, также указывают на возможность микобактериального патогенеза саркоидоза. Однако, отсутствие казеоза в большинстве случаев, отрицательные культуральные исследования и отсутствие ответа на противотуберкулезную терапию - факты, которые противоречат этой теории. Также, в то время как в течение прошлого столетия наблюдалось существенное уменьшение заболеваемости туберкулезом, заболеваемость для саркоидоза не уменьшилась (2).

В течение последнего десятилетия, несколько исследований использовали ПЦР для обнаружения микобактериальной ДНК в экземплярах биопсии пациентов с саркоидозом. Результаты этих исследований были весьма противоречивы, с положительными результатами в пределах от 0 до 80 % (4-24). Удивительную вариабельность этих данных можно объяснить несколькими техническими факторами, включая выбор целевой последовательности для амплификации и вариабельности репарации ДНК, в зависимости техники которая используется в исследовании (2). Альтернативное объяснение этих результатов - загрязнение исследуемых образцов (14). Интересно, что исследования, обнаружившие самый высокий процент положительных результатов в тканях пациентов с саркоидозом, также сообщили об относительно высоком проценте положительных результатов для образцов группы контроля (14). Кроме того, в большинстве исследований, обнаружение микобактериальной ДНК с помощью ПЦР было выполнено в зафиксированных в формалине и залитых в парафине тканях, полученных в отделениях патологии. В таких исследованиях имеется большая возможность загрязнения образцов и большая степень фрагментации ДНК. Наше исследование было проспективным и использовалась только недавно полученная ткань. Для каждого пациента, половина полученной при биопсии ткани была обработана для обычной гистологической оценки, чтобы подтвердить присутствие гранулем в образцах, включенных в исследование. Использование недавно полученной ткани позволило нам применять технику амплификации рРНК, которая имеет несколько преимуществ. Это более чувствительный метод, чем амплификация ДНК, так как в одной молекуле ДНК имеется более 2000 копий рРНК (26). Другим преимуществом метода является низкий уровень перекрестного загрязнения. Единственное исследование, в котором определялось присутствие микобактериальной рРНК в недавно полученных саркоидных тканях, включало только 5 пациентов и использовало методику (гибридизация из жидкой фазы), в которой образцы могли быть легко подвергнуты экзогенному загрязнению (25).

Чтобы подтвердить, что инфекционный агент является причиной болезни, необходимо провести изоляцию инфекционного агента и определить механизм развития болезни, когда этот агент присутствует в организме. Эти критерии никогда не были выполнены (1-2). ПЦР при обнаружении микобактериальной ДНК при саркоидозе не позволяет определить, являются ли обнаруженные микобактерии жизнеспособными и восприимчивыми к противотуберкулезной терапии или являются нежизнеспособными фрагментами, указывающими на предшествующую микобактериальную колонизацию (27). Присутствие микобактериальной ДНК в тканях, пораженных саркоидозом лишь говорит, что фрагменты микобактериальных организмов могут присутствовать в некоторых повреждениях у некоторого процента пациентов. Однако, отсутствие микобактериальной рРНК, несмотря на более высокую чувствительность по сравнению с обнаружением ДНК, при отрицательных культуральных исследованиях, исключает присутствие жизнеспособных микобактерий в саркоидных повреждениях.

Мы считаем, что остатки микобактерий могут действовать как стимул для формирования гранулемы у некоторых пациентов, у которых развивается саркоидоз, аналогично тому, как гранулемы могут развиваться в ответ на инородные включения в коже (28-31). Эта гипотеза может объяснять, почему микобактерии никогда не были выращены из саркоидной ткани, почему противотуберкулезная терапия при саркоидозе не бывает успешной и почему реактивация туберкулеза очень редко происходит при саркоидозе, несмотря на использование кортикостероидов и других иммуносупрессоров. Хотя микобактериальные антигены могут быть ответствены за формирование гранулем у некоторых пациентов, наши результаты говорят, что Mycobacterium tuberculosis не может рассматриваться как этиологический агент саркоидоза.