Am. J. Respir. Crit. Care Med., Volume 164, Number 2, July 2001, 197-201
I/D полиморфизм гена ангиотензинпревращающего фермента и серьезность легочного саркоидоза
DEIRDRE S. McGRATH, PATRICK J. FOLEY, MARTIN PETREK, LYDIE IZAKOVICOVA-HOLLA, VITEZSLAV DOLEK, SRIHARI VEERARAGHAVAN, PENELOPE A. LYMPANY, PANAGIOTIS PANTELIDIS, ANNA VASKU, ATHOL U. WELLS, KENNETH I. WELSH, and ROLAND M. DU BOIS
Interstitial Lung Disease Unit, Department of Occupational and Environmental Medicine, National Heart and Lung Institute, Imperial College of Science, Technology, and Medicine, London, England; Department of Immunology, Medical Faculty of Palacky University, and Department of Respiratory Medicine, University Hospital, Olomouc; and Institute of Pathological Physiology, Medical Faculty, Masaryk University, Brno, Czech Republic
РЕЗЮМЕ
Предыдущие исследования I/D полиморфизма гена ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) при саркоидозе показали как этническую гетерогенность I/D частот так и противоречия в ассоциации между полиморфизмом и серьезностью болезни. Целью этого исследования было внесение ясности в роль АПФ I/D полиморфизма (1) в восприимчивость к болезни, (2) серьезность легочной болезни (с особым вниманием к легочному фиброзу) и (3) прогресс легочной болезни в двух различных Европейских популяциях. Стандартное рентгенографическое стадирование было выполнено у 118 Английских и у 56 Чешских белых пациентов с саркоидозом в течение 2 лет после постановки диагноза. Была проанализирована легочная функция и пациенты были категоризированы согласно серьезности болезни. PCR-SSP использовалась чтобы определить I/D генотип каждого пациента. I/D частоты аллелей этих пациентов сравнивались с частотами в этнически согласованной группе контроля из Великобритании (n = 386) и Чехии (n = 179). Никаких существенных различий не было замечено в распределении АПФ I/D генотипов, частот аллелей или частот фенотипов. Кроме того, никакой ассоциации не было найдено между АПФ I/D полиморфизмом и серьезностью легочной болезни, фиброзом и прогрессом болезни. Мы заключаем, что АПФ I/D полиморфизм не влияет на восприимчивость к саркоидозу у Европейских белых и что это не регулирующий фактор болезни.
ВВЕДЕНИЕ
Увеличенный серологический уровень ангиотензинпревращающего фермента наблюдается приблизительно у 60 % пациентов с саркоидозом (1). Хотя первоначальная мысль, что это может быть полезным инструментом для контроля клинического курса болезни, в настоящее время мнения о роли увеличенных уровней АПФ при саркоидозе расходятся (2).
Ген, кодирующий уровни АПФ (дипептидил карбоксилпептидаза 1 - DCP1) расположен на хромосоме 17q35 и состоит из 26 экзонов. Вариант делеции связан с более высокими серологическими уровнями фермента. Таким образом, серологические уровни АПФ соответствуют АПФ I/D генотипам в следующем порядке: I < ID < DD. Этот I/D полиморфизм объясняет 47 % фенотипических разновидностей серологических уровней АПФ (3).
Открытие влияния I/D полиморфизма на серологические уровни АПФ привело к проведению нескольких исследований с целью определить, влияет ли этот полиморфизм на восприимчивость к болезни или на результат болезни. Два главных вывода, которые могут быть сделаны по результатам этих исследований: (1) популяции существенно отличаются по I/D частотам (например, у Японцев, I аллель более обычна чем у белых); (2) неясно, имеется ли ассоциация между АПФ I/D полиморфизмом и серьезностью саркоидоза (3, 9, 12, 13).
Хотя некоторые исследования не находили связи между АПФ I/D полиморфизмом и серьезностью саркоидоза (3, 9), исследование Финских пациентов (13) показало наличие связи между вариантом делеции (D) и прогрессом болезни. В этом исследовании прогресс болезни был определен как персистирующие рентгенографические изменения и/или наличие внелегочной болезни спустя 5 лет после постановки диагноза. Ассоциация была идентифицирована только после того, как ID и DD генотипы были сгруппированы вместе. Чернокожие пациенты с вариантом I имели втрое больший риск рентгенографического прогресса болезни после группировки ID и DD генотипов. Эта ассоциация не была обнаружена у белого населения США (12).
В животной модели индуцированного радиацией легочного фиброза (4), степень фиброза была обратно пропорциональна внутрилегочной активности активатора плазминогена (PLA) и АПФ, поддерживая выбор гена АПФ как причинного гена развития фиброза при саркоидозе. Однако, предыдущие исследования относительно клинического значения АПФ I/D полиморфизма давали противоречивые результаты. Наше исследование, поэтому, стремилось установить, связан ли АПФ I/D полиморфизм с: (1) восприимчивостью к саркоидозу; (2) серьезностью легочной болезни, особенно фиброза через 2 и 4 года после постановки диагноза; (3) прогрессом легочной болезни через 2 и 4 года после постановки диагноза. Мы исследовали две различных Европейских популяции, чтобы обнаружить, является ли эффект полиморфизма, если таковой вообще имеется, независимым от географических и этнических факторов.
МЕТОДЫ
Пациенты
Английские (n = 184) и Чешские случаи (n = 56) саркоидоза были взяты из клиник Royal Brompton Hospital, London и Olomouc Hospital. Информированное согласие пациентов для генетического анализа было получено до венотомии. Все пациенты имели (1) клинические особенности легочного саркоидоза, (2) диагноз, подтвержденный при трансбронхиальной биопсии, тесте Квейма или биопсии лимфатического узла (3) и получали соответствующе лечение.
Английская группа контроля включала белых индивидуумов (n = 386) английского происхождения из трех центров: Лондон, Кардифф и Белфаст. Чешская группа контроля состояла из случайно подобранных по возрасту и полу индивидуумов и этнически соответствовала группе белых доноров крови (n = 179) из региона Olomouc.
Хотя этническая однородность (определенная как ''однородность людей с общим культурным наследием, которое отличает их от других'' MeSH browser, Pubmed, National Library of Medicine) как мы считали, имела место в пределах каждой изучаемой группы, Английская и Чешская популяция этнически отличались друг от друга. Проект был одобрен местными комитетами по этике в каждом из центров.
Оценка серьезности легочного саркоидоза
Рентгенограммы
Чтобы определить курс болезни, был исследован рентгенографический ряд для каждого пациента. Когда это было возможно, включались рентгенограммы, сделанные при поступлении в больницу и рентгенограммы через 2 и 4 года. Рентгенограммы каждого пациента были проанализированы пульмонологом, с использованием стандартного рентгенографического стадирования для саркоидоза: Стадия 0 - норма; Стадия I - двусторонняя грудная лимфаденопатия (BHL); Стадия II - двусторонняя грудная лимфаденопатия и паренхиматозные инфильтраты; Стадия III - паренхиматозные инфильтраты с ранними признаками фиброза; Стадия IV - необратимый фиброз с потерей объема легкого. Улучшение было определено как изменение рентгенографической стадии от более высокой к более низкой, прогресс был определен как изменение изменение рентгенографической стадии от более низкой к более высокой за эти два временных интервала. В остальных случаях рентгенографические проявления классифицировались как неизменные. Для контроля, другой пульмонолог выполнял слепую оценку рентгенограмм. Сравнение стадирования рентгенограмм при двух независимых оценках показало различие результатов < 5 %.
Первоначальные рентгенографические данные была доступны только у 129 из 184 Английских пациентов с саркоидозом. Рентгенограммы, сделанные по крайней через 2 года после постановки диагноза, были доступны только у 118 пациентов (через 4 года - 101 пациент). Это объясняется тем, что у многих пациентов диагноз был установлен при проведении настоящего исследования. Эти пациенты удовлетворяли диагностическим критериям для включения в исследование, но так как постановка диагноза была произведена недавно, они не оценивались для 4-летнего периода.
Хотя полный рентгенографический ряд не был доступен для Чешских пациентов, рентгенограммы, сделанные через 2 года после постановки диагноза были доступны у 56 пациентов. Серьезность легочной болезни, поэтому, для Английской и Чешской популяции была оценена за 2 года после постановки диагноза.
В отсутствии полного рентгенографического ряда для Чешской группы, генотип АПФ и прогресс рентгенографических проявлений (через 4 года) были проанализированы только в Английской группе. Пациенты со Стадией IV болезни (n = 18), которые по определению не могут иметь рентгенологическое улучшение или ухудшение, были исключены из анализа.
Тест легочной функции
Были зарегистрированы следующие параметры: FEV1 и FVC и DLCO.
Идентификация полиморфизма
Для определения АПФ I/D генотипа каждого пациента использовалась полимеразная цепная реакция. Прямая и обратная последовательность состояли из 5'-CTGGAGACCACTCCCATCCTTT-3 ' и 5 '-GATGTGGCCATCACATTCGT, соответственно. Из 184 Английских пациентов, 180 были успешно генотипированы (98 %). Все 56 Чешских пациентов саркоида были генотипированы.
РЕЗУЛЬТАТЫ
АПФ I/D полиморфизм и восприимчивость к саркоидозу в Английской и Чешской группах
Никаких существенный различий не было замечено в распределении АПФ I/D генотипов между пациентами и группой контроля для аллелей, генотипа и частот фенотипов.
Серьезность легочной болезни
Рентгенология
Для 101 Английского пациента с полным 4-летнем рентгенографическим рядом, при постановке диагноза пропорция пациентов в каждой из четырех категорий серьезности болезни была следующей: Стадия 0 - 0 %, Стадия I - 22.8 %, Стадия II - 33.7%, Стадия III - 20.8 % и Стадия IV - 22.7 %. В 2-летний и 4-летний период количество пациентов со стадией II и III сильно уменьшилось, принимая во внимание, что количество пациентов со стадиями I и IV увеличилось.
У пациентов, включенных в Чешскую группу, были представлены все стадии серьезности болезни, от нормальной рентгенограммы до постоянных фиброзных изменений. Не было идентифицировано ассоциации между АПФ I/D генотипом, аллелями или частотами фенотипов в каждой рентгенографической группе.
Распределение групп серьезности для 2-летнего интервала (Стадия 0 = 0-1.8 %, Стадия I = 50 %, Стадия II = 33.9 %, Стадия III = 14.3 % и Стадия IV = 0 %) в Чешской группе отличалось от распределения в Английской группе (Стадия 0 = 0-11.9 %, Стадия I = 21.2 %, Стадия II = 30.5 %, Стадия III = 11.9 % и Стадия IV = 24.6 %). Клиническое значение этого факта установить трудно.
Тест функции легкого
Измеренные параметры легочной функции были следующие: FEV1 91 (от 26 до 136) %; FVC = 98 (от 33 до 146) %; DLCO = 77 (от 20 до 145) %. При анализе для АПФ I/D генотипов FEV1, FVC и DLCO были подобны для всех трех подгрупп: II (FEV1= 85.7 ± 23.7 %, FVC = 96.5 ± 22.7 %, DLCO = 70.4 ± 18.7), ID (FEV1= 83.1 ± 23.0 %, FVC = 96.1 ± 15.2, DLCO = 74.6 ± 14.9) и DD (FEV1= 87.5 ± 22.1, FVC = 96.0 ± 21.4 %, DLCO = 75.3 ± 23.4). Аналогично, никаких различий не демонстрировалось между фенотипом, частотами аллелей и серьезностью болезни, определенной при испытании легочной функции.
АПФ I/D полиморфизм и легочный фиброз
Анализ АПФ I/D генотипа относительно легочного фиброза не показал никаких существенных результатов для Английской (p = 0.9) и Чешской (p = 0.7) группы.
АПФ I/D полиморфизм и прогресс легочной болезни
Рентгенология
Тридцать восемь пациентов (46 %) не показали рентгенологического улучшения, 26 (31 %) имели прогресс болезни и 19 (23 %) никаких изменений. Не было идентифицировано связи между частотой генотипа и рентгенографическим прогрессом болезни через 2 и 4 года. Также, не было обнаружено ассоциации с частотой фенотипа или аллели. Генотипы были сгруппированы (II + ID по сравнению с DD и ID + DD по сравнению с II), методом, аналогичным предыдущим исследованиям (12, 13). Этот подход показал ассоциацию между I аллелью (II + ID по сравнению с DD) и прогрессом болезни (p = 0.02).
При анализе рентгенологических данных было замечено, что через какое-то время, распределение пациентов имело тенденцию сходиться к двум крайностям, то есть к норме (Стадия 0) или серьезной болезни (Стадия IV). Поскольку самые большие изменения в распределении были замечены у пациентов со Стадиями II и III, они были проанализированы более тщательно, чтобы определить, имелась ли ассоциация между АПФ I/D генотипом и прогрессом от Стадии II/III к Стадиям I или IV. Никаких ассоциаций не было обнаружено.
Тест функции легкого
Не было обнаружено никаких существенных различий и никаких предельных тенденций в результатах FEV1, FVC или DLCO в течение 4-летнего периода. Точно так же, никаких ассоциаций не было идентифицировано между функциональными тестами легких и частотами АПФ I/D аллелей или фенотипом. В отличие от рентгенологического прогресса болезни, группировка по генотипу не показала никаких различий в прогрессе легочной болезни, определенных при испытании функции легкого.
ОБСУЖДЕНИЕ
Целью этого исследования было внесение ясности в вопрос о роли АПФ I/D полиморфизма в серьезности и прогрессе легочного саркоидоза. Чтобы устранить предубеждение по географическим или этническим различиям, изучались Английские белые и Славянские (Чешские) белые группы пациентов. Мы не нашли никакой ассоциации между генотипом или частотами аллелей и серьезностью или прогрессом болезни в этих группах.
Большое количество предыдущих исследований, изучавших АПФ I/D полиморфизм, отражают интерес к роли этого гена при саркоидозе. АПФ I/D полиморфизм влияет на серологические уровни АПФ (3). Однако, противоречия окружают не только роль серологических уровней АПФ при саркоидозе но также и роль АПФ I/D полиморфизма в восприимчивости к саркоидозу и в прогрессе болезни. Это исследование стремилось разъяснить роль и отношения между полиморфизмом и легочным фиброзом. Исследование не установило роль АПФ I/D полиморфизма в восприимчивости к саркоидозу у белых пациентов в Великобритании и Чехии. Эти результаты согласуются с данными Maliarik с коллегами (12) по белой популяции в Соединенных Штатах, но отличается от чернокожей популяции, которая имеет увеличенный риск саркоидоза, связанный с ID гетерозиготами (RR = 1.3; 95 % CI = 0.72 - 2.36) и DD гомозиготами (RR = 3.17; 95 % CI = 1.5 - 6.71). Кроме того, прогресс болезни, как это ни парадоксально, в чернокожей популяции был связан с II вариантом. Различие в результатах между белыми и чернокожими говорит, что роль I/D полиморфизма зависит от популяции. Это совместимо с сообщениями о расовых различиях в серологических уровнях АПФ и I/D полиморфизме (16).
Наше исследование не продемонстрировало никакой ассоциации между АПФ I/D генотипом или частотами аллелей и серьезностью легочного саркоидоза или прогрессом болезни в двух различных белых Европейских популяциях. Эти результаты согласуются с данными Papadopoulos с коллегами (17), которые не нашли никакой ассоциации между изолированными случаями саркоидоза и серьезностью болезни несмотря на существенно более частое наличие DD генотипа у пациентов с сосуществованием аутоиммуннных болезней и саркоидоза и рентгенографической стадией III. Генотип-группирующий анализ (II + ID по сравнению с DD и DD + ID по сравнению с II) в этом исследовании показал ассоциацию между вариантом II + ID и рентгенографическим прогрессом болезни. Однако, физиологическая оценка прогресса болезни не показала никакой ассоциации. Эти результаты отличаются от данных Финского исследования белых индивидуумов, в которых была найдена ассоциация между прогрессом болезни и вариантом делеции. Хотя исследование чернокожих в Соединенных Штатах показало подобную ассоциацию между вариантом I и рентгенологическим прогрессом болезни, использование рентгенологических данных, как единственного критерия прогресса саркоидоза является некорректным. Кроме того, поскольку функциональная роль гомозигот и гетерозигот в АПФ I/D полиморфизме остается неизвестной, ясные заключения не могут быть получены из группировки генотипов. Анализ частот аллелей может быть более информативен.
Мы не обнаружили никакой ассоциации между АПФ I/D полиморфизмом и легочным фиброзом в изучаемых группах. Приблизительно у 20 % пациентов с саркоидозом развивается фиброз (18). Хотя данные в Чешской группе в этом исследовании находились в соответствии с этим числом (14 %), группа из Великобритании имела значительно более высокий процент пациентов с фиброзом (47 %). Главная причина этого - то, что эти пациенты попали в исследование из специализированной клиники, где бессимптомные пациенты наблюдаются менее вероятно. Кроме того, поскольку пациенты с более серьезной болезнью сопровождаются в таких клиниках более часто и в течение более продолжительного периода времени, вероятность попадания таких пациентов в исследование была выше.
Одним из недостатков данного исследования является то, что данные Английской контрольной группы были разрознены по возрасту и полу, что может объяснять отсутствие ассоциации между АПФ I/D генотипом и восприимчивостью к саркоидозу, серьезностью легочной болезни или прогрессом болезни. Однако, так как не имелось существенного различия в распределении АПФ I/D генотипов между этой разрозненной группой контроля и данными группы контроля другого исследования (6, 7), мы полагаем, что наши результаты приемлемы. Кроме того, поскольку частота генотипов и у Английских и Чешских пациентов подобна данным двух исследований белых пациентов в Великобритании и вышеупомянутым данным группы белых пациентов из Соединенных Штатов (12), результаты нашего исследования не смещены этническими или географическими факторами.
Мы стремились установить роль АПФ I/D полиморфизма в восприимчивости к саркоидозу, серьезности легочной болезни, фиброзу и прогрессу болезни. Мы заключаем, что I/D полиморфизм не играет никакой роли в восприимчивости к саркоидозу у Европейских белых индивидуумов и что это - не регулирующий фактор этой болезни. Мы полагаем, что дополнительный функциональный вариант, возможно связанный с I/D полиморфизмом, существует в пределах гена АПФ. Этот вариант может иметь регулирующий регион, который содержит элемент ответа или к причинному агенту саркоидоза или к посреднику, который этот агент производит. Эта теория поддержана работой Rigat с коллегами (19) и Tiret и коллегами (20), которые продемонстрировали, что I/D полиморфизм объясняет только 47/28 % фенотипической разницы в серологических уровнях АПФ, соответственно. Недавний анализ разновидностей последовательности DCP1 гена и его фланкирующего региона, показал 78 полиморфизмов в пределах гена АПФ которые могут быть сгруппированы в три основных гаплотипа (21, 22). Из этих 78 полиморфизмов, пять приводят к изменениям аминокислоты. В дальнейших генетических исследованиях необходимо выяснить, какие из этих полиморфизмов влияют на функциональнй базис гена АПФ. Эти данные позволят нам определить точный вклад этого гена в саркоидоз.