Acta Med Okayama 2010, vol 64, №2, p. 75-83

Экспериментальные легочные гранулемы, индуцированные Propionibacterium acnes у мышей, походящие на саркоидоз

Kouji Iio, Tomoe Ueno Iio, Yuhei Okui, Hirohisa Ichikawa, Yasushi Tanimolo, Nobuaki Mijahara, Arihiko Kanehiro, Milsune Tanimolo, Yasunari Nakaia and Mikio Kataoka

Реферат

После того как Propionibacterium acnes были изолированы из пораженной саркоидозом ткани, эта бактерия стала считаться потенциальным этиологическим агентом саркоидоза. Мы разработали мышиную модель формирования легочных гранулем с использованием P. acnes. Мыши были сенсибилизированы инактивированными высокой температурой P. acnes и полным адъювантом Фрейнда и затем им подкожно вводились инактивированными высокой температурой P. acnes через 2-недельный интервал. У этих мышей развились эпителиоидноклеточные гранулемы в легких. Эти мыши демонстрировали легочный иммунный ответ, характеризованный увеличением числа T-лимфоцитов, особенно CD4+ клеток и увеличенным отношением CD4+/CD8+ в ЖБАЛ. Кроме того, наблюдалось существенное увеличение уровня АПФ в сыворотоке и титра антител к P. acnes. У мышей, сенсибилизированых P. acnes без полного адъюванта Фрейнда также развились легочные гранулемы, которые вероятно были индуцированы врожденными P. acnes. Геном P. acnes был найден в легких, клетках ЖБАЛ, внутригрудных лимфатических узлах, печени и селезенке у не сенсибилизированых P. acnes мышей, которые, как предполагалось, не были инфицированы P. acnes. Эти результаты говорят, что иммунный ответ против врожденных P. acnes может играть важную роль в патогенезе формирования гранулем в мышиной модели.

Введение

Саркоидоз - системная болезнь, характеризованная формированием неказеозных эпителиоидноклеточных гранулем и обычно поражающая легкие, глаза, лимфатические узлы и кожу. Хотя патогенез саркоидоза был интенсивно исследован, его этиология остается неизвестной [1-3]. Неказеозные гранулемы - типичная гистологическая особенность саркоидоза. Известно, что некоторые типы бактерий, грибов, химические и другие неиммунологические стимулы могут производить формирование гранулем. Фактически, процесс формирования гранулемы является физиологическим шагом в иммунном ответе, который предотвращает распространение инфекции [4].

В 1978 г. Homma с колегами [5, 6] сообщили о частой изоляции Propionibacterium acnes из саркоидных лимфатических узлов. Недавно P. acnes были изолированы из пораженных саркоидозом тканей, используя бактериологические, иммуногистохимические и молекулярные подходы [7-11], что указывает на возможное участие этих бактерий в этиологии саркоидоза. Мы разработали мышиную модель формирования легочных гранулем с использованием P. acnes и исследовали иммунный ответ на P. acnes у мышей.

Материалы и методы

Все эксперимены были выполнены в соответствии с Institutional Animal Care and Use Committee of Okayama University. До эксперимента C57BL/6J мыши (самки возраста 6-8 недель) содержались в стерильных условиях в Advanced Science Research Center of Okayama University.

P. acnes (ATCC 6919) были культувированы на питательной среде thioglycollate medium II (Dainippon Pharmaceutical, Tokyo, Japan) с L-цистеином в анаэробной камере. Затем P. acnes были инактивированы высокой температурой (30 мин при 65°C). Мыши были разделены на 4 группы (n = 10 в каждой группе). У мышей группы 1 (контроль) сенсибилизация производилась подкожным введением 0.2 мл солевого раствора в лапу и через 14 и 28 дней в дорсальный регион. В группе 2 сенсибилизация проводилась подкожным введением смеси 0.2 мл полного адъюванта Фрейнда и P. acnes (2 mg/ml) в лапу и затем 0.2 мл инактивированных P. acnes (2 mg/ml) в дорсальный регион через 14 и 28 дней. В группе 3 сенсибилизация проводилась подкожным введением смеси 0.2 мл полного адъюванта Фрейнда и P. acnes (0.2ml и 2 mg/ml) в лапу и затем 0.2 мл инактивированных P. acnes (2 mg/ml) в дорсальный регион через 14, 28 и 42 дня. В группе 4 сенсибилизация проводилась подкожным введением инактивированных P. acnes (0.2 ml в 2 mg/ml) через 1, 14 и 28 дней в дорсальный регион. В группах 1, 2 и 4, ткани для исследования были получены через 6 недель после сенсибилизации; в группе 3 через 8 недель.

Результаты

Анализ ЖБАЛ

После инстилляции 2 мл фосфатного буфера в легкие была собрана ЖБАЛ. Полный индекс клеток в группах 1. 2, 3 и 4 в мл был 3.7 ± 0.8 x 10⁴, 6.3 ± 0.7 x 10⁴, от 6.8 ± 0.6 x 10⁴ и 6.1 ± 0.9 x 10⁴, соответственно. Полный индекс клеток в группе 3 был значительно выше чем в группе 1 (p < 0.05). Индекс клеток в группах 2 и 4 был увеличен, но различия между этими группами и группой 1 не были статистически значимы. Между группами не имелось существенных различий по плотности макрофагов. Плотность лимфоцитов в группе 3 была значительно выше чем в группе 1 (p < 0.01). Плотность лимфоцитов в ЖБАЛ в группах 2 и 4 была выше чем остальных 2 группах, но различие с группой 1 не было статистически значимым. Проточная цитометрия показала, что между группами не имелось существенных различий по проценту CD3+ клеток, хотя процент CD4+ клеток в группе 3 был значительно выше, чем в группе 1 (p < 0.05) и процент CD8+ клеток в группе 3 (p < 0.05) был значительно ниже, чем в группе 1. Что касается плотности лимфоцитов в ЖБАЛ, плотность CD3+ клеток в группе 3 было значительно выше, чем в группе 1 и плотность CD4+ клеток была выше в группах 2, 3 и 4, чем в группе 1, различие между группами 3 и 1 было статистически значимым (p < 0.01). Плотность CD8+ клеток в группах 2 и 3 была значительно выше, чем в группе 1 (p < 0.01). Отношение CD4+/CD8+ в группах 2 (p < 0.05) и 3 (p < 0.01) было значительно выше, чем в группе 1.

Гистологические результаты

Никаких патологий, включая гранулематозные изменения в легких мышей группы 1 отмечено не было. Формирование эпителиоидноклеточных гранулем и лимфоцитарных инфильтратов в стенках альвеол было отмечено в группе 2. Эти гранулематозные повреждения были незрелыми. В группе 3 наблюдалось формирование эпителиоидноклеточных гранулем и гигантских клеток в легких. Стенки альвеол были утолщены вследствие инфильтрации макрофагами и лимфоцитами. В группе 4 были отмечены лимфоцитарные инфильтраты и скопления мононуклеарных клеток на стенках альвеол и отдельные гранулемы в легких.

АПФ в сыворотке

Уровень АПФ в группе 1 был 250±40 IU / l / 37°C. Во всх остальных группах уровень АПФ был значительно выше, чем в группе 1. Группа 2 310 ± 25 IU / l / 37°C, p < 0.05; группа 3, 301± 30 IU / l / 37°C, p < 0.01; группа ,4 330 ± 26 IU / l / 37°C, p < 0.01.

Антитела к P. acnes в сыворотке

Уровень антител, произведенных в ответ на P. acnes через 5 мин после начала реакции был следующим: 60.0±10.0 в группе 1, 110.0 ± 4.0 в группе 2, 190.0 ± 90.0 в группе 3 и от 100.0 ± 20.0 в группе 4. Увеличение уровней антител к P. acnes было статистически значимым в группе 2 (p < 0.05) и 3 (p < 0.01) по сравнению с группой 1.

Количественная ПЦР

Число геномов P. acnes в 500 ng ткани легких составило 14.2 ± 5.2 х10³ в 500 ng в группе 1, 21.1 ± 10.1 х10³ в группе 2, 18.3 ± 6.3 х10³ в группе 3 и 19.0 ± 3.8 х10³ в группе 4. ДНК P. acnes была обнаружена в легких всех групп; однако, статистически значимых различий между группами не наблюдалось. Геномы P. acnes были обнаружены в ткани легкого мышей группы 1. Также было исследовано число геномов P. acnes в каждом органе мышей группы 1, которое составило 14.9 ± 3.5 х10³ в легком, 9.1 ± 3.1 х10³ в клетках ЖБАЛ, 7.0 ± 8.0 х10³ в лимфатических узлах, 5.2 ± 1.9 х10³ в печени и 3.2 ± 3.7 х10³ в селезенке. Число геномов P. acnes было выше в легких, клетках ЖБАЛ и лимфатических узлах, чем в печени и селезенке. Кроме того, различие числа геномов в легких, по сравнению с печенью и селезенкой, было статистически значимым, p < 0.05 и p < 0.01, соответственно.

Обсуждение

Саркоидоз - системная болезнь, характеризованная формированием неказеозных эпителиоидноклеточных гранулем, наиболее часто поражающая легкие, глаза, лимфатические узлы и кожу. Считается, что саркоидоз развивается при воздействии агентов окружающей среды на наследственно восприимчивых индивидуумов, однако его этиология остается неизвестной. Предполагается, что причинный агент саркоидоза активизирует альвеолярные лимфоциты, что ведет к альвеолиту и развитию эпителиоидноклеточных гранулем [13]. Этот процесс приводит к увеличению числа T-лимфоцитов, увеличению отношения CD4+/CD8+ в ЖБАЛ и секрециии различных цитокинов [14]. Хотя было исследовано множество предполагаемых причинных агентов саркоидоза, причина саркоидоза не была идентифицирована [1-3]. P. acnes, анаэробные грамм-положительные бактерии, являются единственными организмами, которые были изолированы в биопсийной ткани пациентов с саркоидозом [5].

Мы исследовали экспериментальную мышную модель формирования легочных гранулем с использованием P. acnes, некоторые особенности которой сходны с саркоидозом. Мыши были иммунизированы инактивированными высокой температурой P. acnes и полным адъювантом Фрейнда. Затем один раз в 2 недели подкожно вводились инактивированные высокой температурой P. acnes. Формирование эпителиоидноклеточных гранулем произошло после второй инъекции. Кроме того, в группе, которая получила 3 инъекции, были обнаружены ''плотные'' эпителиоидные гранулемы с гигантскими клетками.

В ЖБАЛ было обнаружено увеличение общего числа клеток и индекса лимфоцитов. Число CD3+ и CD4+ лимфоцитов и отношение CD4+/CD8 + было выше, чем в контрольной группе. Самые высокие уровни этих маркеров наблюдались в группе 3. Уровень АПФ был значительно увеличен в сенсибилизированных группах. Кроме того, активность антител против P. acnes в сыворотке был значительно увеличен в группах 2 и 3. На основании этих результатов мы сделали вывод, что сенсибилизация P. acnes может производить экспериментальное гранулематозное воспаление в легких мышей. Кроме того, эта модель имеет сходные клинические особенности с саркоидозом у людей.

Ejiri с коллегами [15] сообщили, что экспериментальные гранулемы у морских свинок могут быть индуцированы при эндотрахеальном введении P. acnes; однако, никаких детальных исследований (в том числе анализ ЖБАЛ) выполнено не было. Известно, что P. acnes является мощным иимуностимулятором, способным производить гранулематозное воспаление в печени у экспериментальных животных при внутривенном введении этих бактерий, инактивированных высокой температурой [16]. Хотя механизм формирования гранулем в печени в ответ на P. acnes были исследованы, относительно легочного иммунного ответа на эту анаэробную бактерию известно мало [17, 18].

Хотя сенсибилизация и стимуляция производились на внелегочных участках, формирование гранулем произошло в легких. На основании наших наблюдений, мы предположили, что антиген для стимулирования гранулематозного воспаления мог уже находиться в легких. Поэтому, мы попытались обнаружить ДНК P. acnes в тканях легкого. С помощью ПЦР мы подтвердили, что ДНК P. acnes находилась в легких всех групп. Кроме того, ДНК P. acnes были обнаружены в легких, клетках ЖБАЛ, внутригрудных лимфатических узлах, печени и селезенке мышей контрольной группы. Кроме того, формирование гранулем было обнаружено в группе 4, в которой сенсибилизация была выполнена с использованием только P. acnes, без полного адъюванта Фрейнда. Возможно, эти гранулемы были индуцированы P. acnes, ранее находившихся легких в нормальных мышей.

McCaskill с коллегами [19] собщили о формировании легочных гранулем у C57BL/6 мышей с использованием интраперитонеальной сенсибилизации и эндотрахеальной стимуляции инактивированными высокой температурой P. acnes. Хотя в этом исследовании участки сенсибилизации и стимуляции отличались от нашего, наши результаты совпадают. В группе 4 мыши были сенсибилизированы используя инактивированные высокой температурой P. acnes, без сенсибилизации смесью полного адъюванта Фрейнда и P. acnes. Результаты указывают, что P. acnes в легких мышей, которые, как предполагалось, не содержали этой бактерии, вызывали развитие легочных гранулем.

Nishiwaki с коллегами [20] обнаружили, что внелегочная сенсибилизация Propionibacterium acnes, вызвает развитие легочных Th1 гранулем главным образом в субплевральных и прибронховаскулярных регионах, что часто наблюдается при саркоидозе. Они считают, что гранулемы индуцированы природными P. acnes, которые находятся в нормальном легком и притоком сенсибилизированных P. acnes CD4+ T-клеток из периферического кровообращения. Уже известно, что P. acnes - комменсал кожи, дыхательных путей и кишечника людей [21].

Мы исследовали легкие, внутригрудные лимфатические узлы, печень и селезенку, но гранулемы были обнаружены только в легких, где число геномов P. acnes было самым высоким среди всех исследованных органов. Поскольку плотность гранулем увеличивалась пропорционально времени от проведения стимуляции и поскольку уровни антител были относительно высокими в областях формирования гранулем, врожденные P. acnes является важными для формирования гранулемы в этой модели саркоидоза. Однако, должно быть отмечено, что патогенез саркоидоза у человека также зависит от генетических факторов [13], поэтому этиологические механизмы этой болезни пока остаются неясными.