American Journal of Pathology. 2004;165:631-639.

Роль природной легочной инфекции Propionibacterium acnes в развитии саркоид-подобного легочного гранулематоза у мышей

Tetsu Nishiwaki, Hiroyuki Yoneyama, Yoshinobu Eishi, Naoki Matsuo, Koichiro Tatsumi, Hiroshi Kimura, Takayuki Kuriyama and Kouji Matsushima
From the Department of Molecular Preventive Medicine and Solution Oriented Research for Science and Technology, The University of Tokyo School of Medicine, Tokyo; the Department of Respirology, Chiba University School of Medicine, Chiba; the Department of Human Pathology, School of Medicine, Tokyo Medical and Dental University, Tokyo; and the Second Department of Internal Medicine, Nara Medical University of Medicine, Nara, Japan

Реферат

Хотя многие случаи саркоидоза имеют самоограниченный курс со спонтанной ремиссией, у небольшого числа пациентов происходит прогрессирование легочного гранулематоза с фиброзом и серьезным ухудшением легочной функции. Из-за недостаточной эффективности кортикостероидов, индивидуумы с хроническим легочным саркоидозом часто нуждаются в альтернативной терапии. Хотя многие исследования рассматривали инфекцию как возможный триггер саркоидоза, механизмы, посредством которых микроорганизмы стимулируют развитие болезни остаются неясными. Мы обнаружили, что внелегочная сенсибилизация Propionibacterium acnes, вызвает развитие легочных Th1 гранулем главным образом в субплевральных и приброонховаскулярных регионах, что часто наблюдается при саркоидозе. Возможно, эти гранулемы индуцированы природными P. acnes, ранее существовавшими в нижних дыхательных путях нормального легкого, которое, как предполагается, не содержит микроорганизмов, и притоком сенсибилизированных P. acnes CD4+ T-клеток из периферического кровообращения. Эрадикация природных P. acnes антибиотиками улучшает гранулематозную болезнь легкого. Это первое сообщение, в котором получены свидетельства вклада природной легочной инфекции в формирование гранулематозных повреждений в легком. Мы предполагаем, что терапия, направленная на эрадикацию природных P. acnes в легком может быть эфффективной при лечении легочного саркоидоза.

Введение

Саркоидоз - одна из системных гранулематозных болезней; однако, несмотря на множество интенсивных исследований, его этиология остается неизвестной в течение более 100 лет (1). Легкое - орган, который при саркоидозе поражается наиболее часто. Хотя прогрессирующая легочная болезнь происходит у меньшинства пациентов, эти индивидуумы имеют опасность развития необратимого фиброза легкого и имеют плохой прогноз вследствие значительного нарушения газообмена. Поскольку легкое несет большую антигенную нагрузку, многие исследователи рассматривали инфекцию как триггер саркоидоза и пытались идентифицировать возможные причинные агенты и их вклад в механизм формирования легочных саркоидных гранулем (2,3).

Из-за клинического и иммунопатологического подобия предполагалось, что наиболее обычная микобактериальная инфекция, Mycobacterium tuberculosis, могла бы быть связана с саркоидозом. Однако, несмотря на использование культуральных методов, гистохимических и ПЦР исследований, связь между M. tuberculosis и саркоидозом остается спорной (4-6). Сообщалось, что Propionibacterium acnes, анаэробные, грамположительные, неподвижные, не образующие спор палочковидные бактерии, которые являются коммменсалами кожи и слизистых (7), могут быть одним из причинных антигенов саркоидоза (8). Некоторые исследования с помощью ПЦР показали заметно более высокие уровни геномов P. acnes в средостенных или поверхностных лимфатических узлах пациентов с саркоидозом, чем в контрольной группе, предполагая, что у пациентов с саркоидозом имеется природная инфекция P. acnes (9-11).

Предполагается, что процесс формирования легочных гранулем, начинается с фиксации воздушнокапельных или переносимых кровью антигенов в легком; затем антигенпрезентирующие клетки, такие как макрофаги или дендритные клетки (12), накапливаются в легком и окружают скопления антигена для его фагоцитоза и презентации (13). На основании такого сценария, было предложено несколько животных моделей легочного гранулематоза, например мышиного шистосомоза, с эмболизацией антигена, чтобы задержать антигены в легком (14,15). Однако, из-за продолжительного накопления антигена в легочном интерстиции эта модель не подходит для клинических исследований и маловероятно, что переносимые кровью антигены ответственны за все случаи развития легочных гранулем.

Мы наблюдали, что иммунный ответ против природных P. acnes существует в нормальном легком, которое, как предполагается, не содержит микроорганизмов. Мы показали, что увеличение рециркуляции чувствительных к P. acnes клеток при внелегочной сенсибилизации, может вызывать гранулематозные изменения в легком, имеющие определенные подобия с легочным саркоидозом, даже в отсутствии фиксации воздушнокапельных или переносимых кровью антигенов в легком. Кроме того, антибиотикотерапия, с целью эрадикации природных P. acnes существенно уменьшала поражение легких. На основании этих наблюдений мы предлагаем новое видение патогенеза легочного саркоидоза, а также потенциально эффективную терапию этого состояния с помощью антибиотиков.

Результаты

Присутствие P. acnes в альвеолярных пространствах легкого здоровых мышей

Если имеется ранее существововаший иммунный ответ на P. acnes, эту бактерию можно обнаружить в здоровом легком. Мы выполнили иммуногистохимическое исследование для поиска P. acnes в свежезамороженных препаратах легкого C57BL/6 мышей. Мы наблюдали положительное окрашивание, группами от двух до пяти круглых гранулам. Все они были фагоцитированы [иммунными] клетками легкого, большинство из которых были расположены смежно с альвеолярными пространствами. Двойное иммуноокрашивание показало, что P. acnes-положительные клетки экспрессировали F4/80, который является маркером макрофагов. Маркеры дендритных клеток CD11c и DEC205 (21,22) экспрессированы не были. Кроме того, ПЦР ткани нормальных легких с удаленной трахей и главными бронхами, показала различное распределение геномов P. acnes в этих тканях. Геномы M. tuberculosis и P. granulosum, которые являются комменсалами слизистых оболочек, подобно P. acnes, не были обнаружены в нормальных легких.

P. acnes-специфический иммунный ответ лимфоцитов региональных лимфатических узлов

Периферические антиген-презентирующие клетки транспортируют антигены к дренирующим лимфатическим узлам для презентации (22,23). Мы обнаружили, что P. acnes исконно существуют в альвеолярных пространствах, также известно, что они являются комменсалами кожи и слизистых полости рта и кишечника (7). Чтобы обнаружить P. acnes-специфический иммунный ответ в лимфатических узлах нормального легого, сначала мы установили присутствие геномов P. acnes в нормальных легочных лимфатических узлах с помощью ПЦР. Этот результат указал на транспорт P. acnes с периферии к региональным лимфатическим узлам легкого. Затем мы проверили наличие специфического иммунного ответа на P. acnes в этих лимфатических узлах. Как и ожидалось, мы обнаружили, что нормальные перибронхиальные лимфоциты, специфически пролиферируют в ответ на P. acnes, также как и клетки паховых, печеночных и панкреатических лимфатических узлов.

Гранулемы в легком и печени индуцированы миграцией праймированных P. acnes T-клеток у нативных мышей

Взаимодействия между несущими антиген антиген-презентирующими клетками и Th клетками необходимы для развития гранулемы. Этот процесс усиливается притоком цирулирующих прймированных антигеном T-клеток (13,24). Мы исследовали, могут ли праймированные P. acnes T-клетки приводить к формированию гранулемы в нормальном легком. Мы получили сенсибилизированые P. acnes CD4+ T-клетки из дренирующих лиматических узлов мышей, неоднократно иммунизированых P. acnes с использованием полного адъюванта Фрейнда и ввели их в хвост нормальных мышей. Через 2 недели после введения 2 x 10⁶ T клеток мы наблюдали гранулематозные изменения в форме скоплений эпителиоидных и мононуклеарных клеток в легком и печени, принимая во внимание, что введение праймированных только полным адъювантом Фрейнда T-клеток не произвело никаких эффектов. Кроме того, мыши, которым вводились праймированные P. acnes T-клетки демонстрировали большее число CD4+ T-клеток в ЖБАЛ и перибронхиальных лимфатических узлах по сравнению с контрольной группой.

Повторная иммунизация P. acnes стимулирует легочный гранулематоз

В качестве практического применения этой модели для инициирования хронического легочного гранулематоза, мы выполнили непрерывную внелегочную экспансию праймированных P. acnes T-клеток с помощью повторной иммунизации P. acnes с полным адъювантом Фрейнда в лапу мышей. У иммунизированных таким образом мышей сформировались гранулемы, преобладающе в субплевральных и периброховаскулярных регионах. Иммуногистохимические исследования показали, что типичные гранулемы состояли из антиген-презентирующих клеток в центре и CD4+ T-клеток на периферии (12,13). Кроме того, CD4+ клетки экспрессировали IFN-gamma, но не интерлейкин -4, указывая, что гранулемы имели Th1 фенотип.

Мы также оценили степень гранулематозных повреждений, подсчитывая клетки в ЖБАЛ. Общее число клеток и число лимфоцитов увеличивалось пропорционально количеству иммунизаций. Эти результаты были совместимы с гистологическими результатами даже при том, что процент CD4/8 клеток был самым большим в группе, иммунизированной дважды, легкие которой демонстрировали признаки начала формирования гранулем. Кроме того, увеличение числа клеток ЖБАЛ было намного выше чем, наблюдаемое в группе, которая была иммунизирована только адъювантом Фрейнда.

Поскольку результаты, полученные в этой экспериментальной модели соответствовали характеристикам пациентов с легочным саркоидозом, мы также исследовали серологическое подобие, оценивая уровни кальция и АПФ в сыворотке, даже при том, что они не специфичны для саркоидоза, но являются индикаторами гранулематозного ответа (1,8,25). Кальций в сыворотке увеличился только в группе, которая была иммунизирована дважды, принимая во внимание, что уровень АПФ был выше в группе, которая была иммунизирована более чем дважды. Иммуногистохимический анализ печени и селезенки, которые часто поражаются при саркоидозе, показал многочисленные гранулемы в печени и патологические скопления CD4+ T-клеток в красной пульпе селезенки у мышей, иммунизированых более чем дважды.

Большее число природных P. acnes в легком усиливает формирование легочных гранулем

Если присутствие природных P. acnes в здоровом легком ведет к формированию легочных гранулем, их число должно влиять на степень повреждений. Чтобы проверить эту гипотезу, мы ввели P. acnes в легкие здоровых мышей перед иммунизацией. Чтобы исключить возможность, что эндотрахеальное введение P. acnes само по себе индуцирует гранулемы, мы установили, что легочные гранулемы в контрольной группе неиммунизированных мышей не формировались ни в начале, ни в конце эксперимента. Индекс клеток в ЖБАЛ, которая была собрана после трех иммунизаций, зависел от количества введенных P. acnes; результат гистологической экспертизы повреждений был совместим с этим наблюдением. При этом увеличения числа клеток ЖБАЛ в контрольной группе при использовании L. gasseri вместо P. acnes не наблюдалось.

Терапия антибиотиками улучшает легочные нарушения, индуцированные внелегочной иммунизацией P. acnes

Чтобы оценить важность присутствия природных P. acnes, мы уменьшили их число до иммунизации антимикробными препаратами, минциклином и клиндамицином, оба из которых эффективны против acnes vulgaris, индуцированных P. acnes (26,27). Гентамицин, который эфективен против M. tuberculosis, но не против P. acnes, использовался как отрицательный контроль. Через две недели после третьей иммунизации, у леченных минциклином и клиндамицином мышей и у кратковременно леченных клиндамицином мышей, было обнаружено значительное уменьшение индекса клеток ЖБАЛ: индекс CD4+ клеток в ЖБАЛ в этих трех группах уменьшилось на 53.5 %, 42.1 % и 74.2 %, соответственно. Этот эффект не наблюдался у мышей, леченных гентамицином. Кроме того, количество геномов P. acnes изменялось в зависимости от антимикробных эффектов. Гистологическая экспертиза также показала улучшение гранулематозных повреждений у мышей, леченных антибиотиками. Хотя ранее были описаны иммуномодулирующие свойства антибиотиков, особенно минциклина (28), тесты на аллергию задемедленного типа не показали никаких неспецифических иммунных эффектов, по крайней мере в нашей экспериментальной модели с использованием C57BL/6 мышей.

Обсуждение

Хотя организм непрерывно подвергается воздействию антигенов, достаточно давно предполагалось, что нижние дыхательные пути легкого свободны от антигенов и что легочные болезни вызывает проникновение патогенов в легкое. На основании этой гипотезы, животные модели легочных болезней были основаны на форсированном введении антигенов через трахею, носовую полость или в эмболизированный легочный сосуд (14,15,20,29). Однако, клиницисты часто сталкиваются с криптогенными легочными состояниями, прежде всего интерстициальными болезнями легкого, например легочным саркоидозом, где очевидного воздействия патогенов не наблюдается. Поэтому мы предположили, что в здоровом легком имеется врожденный патоген, который становится патогенным лишь при некоторых обстоятельствах. Из-за нахождения на коже и слизистых здоровых индивидуумов, участия в патогенезе acnes vulgaris (27) и в формировании гранулем в экспериментальных моделях (16,24) P. acnes является одним из вероятных кандидатов. Действительно, раннее сообщалось о возможной связи P. acnes и развития саркоидоза (9-11).

В этом исследовании мы идентифицировали P. acnes в нормальных альвеолярных клетках мышей при иммуноокрашивании. Несущие P. acnes клетки экспрессировали F4/80, а не CD11C или DEC205, что совместимо с известной способностью макрофагов к фагоцитозу и презентации антигенов дендритным клеткам в легком (30,31). Первым барьером защиты от многочисленных воздействий окружающей среды являются слизистые оболочки дыхательных путей, клетки, секретирующие слизь, реснитчатый эпителий и другие образования (32). Однако, небольшое число P. acnes могут избегать действия этой системы и проживать на альвеолярных поверхностях. Существование в здоровом легком антигенпрезентирующих клеток, несущих P. acnes, побудило нас исследовать, имеется ли иммунный ответ против P. acnes в легочных лимфатических узлах нормальных мышей. Действительно, геномы P. acnes были обнаружены в нормальном легком и легочных лимфатических узлах. Лимфоциты легочных лимфатических узлов демонстрировали P. acnes-специфическую пролиферацию, предполагая, что эти клетки уже знакомы с P. acnes и имеют фенотип памяти. Кроме того, эти результаты показывают, что P. acnes непрерывно транспортируются в легочные региональные лимфатические узлы. Из-за постоянной поставки антигена в легочные лимфатические узлы в течение длительного периода, небольшое число природных P. acnes в нормальном легком является достаточным для специфического иммунного ответа, но не для формирования гранулемы. Хотя микобактерии, атипичные микобактерии и другие пропионовые бактерии были потенциальными кандидатами в эндогенные микроорганизмы, вызывающие формирование легочных гранулем, геномные исследования показали отсутствие этих организмов в легких C57BL/6 мышей.

Это показывает, что приток чувствительных к P. acnes T-лимфоцитов может вызывать воспаление в легком даже без прямого воздействия антигена. Миграция чувствительных к P. acnes CD4+ T-клеток у нативных мышей привело к развитию гранулематозных изменений в легком. Это указывает, что внелегочные CD4+ T клетки праймированные P. acnes, через кровообращение могут взаимодействовать с резидентными легочными клетками и стимулировать формирование гранулем в нормальном легком. Мы выдвинули гипотезу, что непрерывная миграция чувствительных к P. acnes T-клеток ведет к формированию легочных гранулем. Для проверки этой гипотезы мы проводили непрерывную продолжительную сенсибилизацию нормальных мышей P. acnes. У этих мышей в субплевральных, перибронхиальных и периваскулярных регионах развились легочные гранулемы с типичным клеточным строением (13) и экспрессией Th1 цитокинов. Эти особенности характерны для легочного саркоидоза у человека (1,3,25). Кроме того, большее отношение CD4/CD8 в ЖБАЛ наблюдалось в группе, которая была иммунизированы дважды и сопровождалось увеличенными серологическими уровнями кальция. Это наблюдение совместимо с известным влиянием активизированных макрофагов на метаболизм кальция (34) и корреляцией между уровнем кальция в сыворотке и увеличенным отношением CD4/CD8 в ЖБАЛ у пациентов с саркоидом (35). Кроме того, мы обнаружили внелегочные повреждения в печени и селезенке, которые также наблюдаются при саркоидозе (1,8,25). Таким образом, предложенная модель иммунизации P. acnes без прямого воздействия антигена на легкое, имеет значительные подобия с саркоидозом у человека.

Поскольку приток чувствительных к P. acnes T-клеток в легкое может вызывать формирование гранулем, мы предположили, что взаимодействие между природными P. acnes, антигенпрезентирующими клетками и T-клетками необходимы для развития гранулемы. Чтобы подтвердить это предположение, мы исследовали влияние числа P. acnes в легком на формирование легочных гранулем. Как и ожидалось, эндотрахеальное введение P. acnes усиливало легочные повреждения, принимая во внимание, что эрадикация P. acnes с помощью антимикробной терапии уменьшала легочные повреждения. Эти результаты предполагают не только важную роль легочных P. acnes и внелегочной сенсибилизации P.acnes в формировании легочных гранулем, но и клиническую полноценность эрадикации легочных P. acnes для лечения легочного гранулематоза, индуцированного подобным патогеном.

Этиология саркоидоза остается неизвестной. Иммуносупрессия, главным образом с использованием кортикостероидов, использовалась в течение более 50 лет для лечения этого состояния. Необходимость продолжительной стероидной терапии хронического легочного саркоидоза все еще дискутируется (8), но высокая частота рецидива и побочные эффекты часто являются серьезной клинической проблемой (36). Успешное лечение кожного саркоидоза миноциклином (37), выдвигает на первый план полноценность такой альтернативной терапии.

В этом исследовании мы сообщаем о новой мышиной модели легочного саркоидоза. Очевидно, что патогенез саркоидоза нельзя объяснить с помощью одной экспериментальной модели. Однако, поскольку P. acnes также могут существовать в нормальном легком человека, у людей с уникальным генетическим фенотипом легочные повреждения могут формироваться после сенсибилизации P. acnes даже на внелегочных участках, например при acnes vulgaris. Мы считаем, что это новое направление изучение легочного саркоидоза заслуживает дальнейших исследований.