Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., Volume 25, Number 2, August 2001 141-149

Саркодные, но не нормальные альвеолярные макрофаги и T-клетки, являются чувствительными к аденовирусной инфекции, что позволяет провести анализ передачи сигнала NF-kappaB

Matthew Conron, Jan Bondeson, Panagiotis Pantelidis, Huw L. C. Beynon, Marc Feldmann, Roland M. duBois, and Brian M. J. Foxwell
Kennedy Institute of Rheumatology, London; Interstitial Lung Disease Unit, Royal Brompton Hospital, London; and Department of Medicine, Royal Free Hospital, London, United Kingdom

Реферат

Аденовирус (Adv) позволяет производить эффективное перемещение необходимого гена в целевые клетки. Цель исследования состояла в том, чтобы установить, являются ли альвеолярные макрофаги и T-клетки пациентов с саркоидозом чувствительными к аденовирусным векторам и может ли эта возможность использоваться, чтобы исследовать регулирование генов цитокинов. Клетки ЖБАЛ из саркоидного и нормального легкого, инфицированные аденовирусными векторами, экспрессирующими бета-галактозидазу или зеленый флуоресцирующий белок (GFP), были проанализированы с помощью сортировки клеток по флюоресцентным меткам (FACS) и прямой иммунофлюоресценции, соответственно. Экспрессия поверхностных антигенов, связанных с аденовирусной инфекцией, CAR (рецептор коксаки/аденовируса), alpha vbeta 3 и alpha vbeta 5 интегринов, также была оценена, используя FACS. Было обнаружено, что саркоидные альвеолярные макрофаги и T-клетки эффективно экспрессировали аденовирусные трансгены, в отличие от альвеолярных макрофагов, моноцитов и Т- клеток периферической крови, полученных у здоровых добровольцев. Клетки, чувствительные к аденовирусной инфекции, экспрессировали CAR и интегрины alpha vbeta 5 (а также alpha vbeta 3 интегрины для альвеолярных макрофагов). Эти данные указывают, что увеличение экспрессии аденовирусных рецепторов и способность аденовирусных векторов инфицировать саркоидные альвеолярные макрофаги и Т-клетки, связано с воспалительной окружающей средой в пределах легкого. Эти особенности были использованы для исследования необходимости ядерного фактора NF-kappaB для регулирования экспрессии генов цитокинов при легочном саркоидозе. Высокая экспрессия Ikappa Balpha в саркоидном ЖБАЛ указывала, что производство TNF-alpha и IL-6 альвеолярными макрофагами и IFN-gamma Т-клетками является зависимым от NF-kappaB, принимая во внимание, что производство IL-4 Т-клетками не зависило от NF-kappaB. Результаты этого исследования имеют большое значение для будущих исследований молекулярных механизмов воспалительных болезней легкого.

Введение

Саркоидоз - мультисистемная болезнь неизвестной этиологии, характеризованная инфильтрацией пораженных органов мононуклеарными фагоцитами и T-клетками с формированием гранулем (1). Легкое поражается наиболее часто и анализ бронхоальвеолярного лаважа внес значительный вклад в наше понимание этой болезни. Активизированные альвеолярные макрофаги и T-клетки являются главными эффекторными клетками, ведущими к прогрессу болезни (2). Текущая модель патогенеза саркоидоза предусматривает, что неизвестный антиген, связанный с главным комплексом тканевой совместимости класса II, опознается T-клеточным рецептором (6), после чего Т-клетки производят Th1 лимфокины IL-2 и IFN -gamma (7, 8). Альвеолярные макрофаги также активизированы в течение этого процесса, производя цитокины (TNF-alpha, IL-1beta и IL-6) и хемокины, которые усиливают воспалительный процесс и привлекают моноциты с периферии (9). Высокие уровни TNF-alpha у пациентов с саркоидозом, которые имеют прогрессирующий фиброз легкого указывают, что этот цитокин является важным в патогенезе саркоидоза (10, 14). Так как мыши с удаленным геном IFN-gamma не способны формировать гранулемы после воздействия микобактерий, роль IFN-gamma в развитии гранулематозного воспаления является чрезвычайно важной (15).

Важность TNF-alpha и IFN-gamma в гранулематозном воспалении делает изучение молекулярных механизмов, управляющих экспрессией этих цитокинов важным шагом в понимании патогенеза болезни. До настоящего времени, относительно молекулярного регулирования этих цитокинов известно мало (16). Недавние исследования показали, что регулирование генов цитокинов на трансформированных линиях клеток не может быть применимо к реальной болезни (16, неопубликованные наблюдения). Сложность регулирования генов цитокинов выдвинута на первый план исследованиями, показавшими, что у различных типов клеток (например, макрофаги против T-клеток) экспрессию гена TNF-alpha может регулировать NF-kappaB или NF-AT (17, 21). Даже в пределах одного типа клеток, каким из вышеуказанных способов будет регулироваться производство цитокинов, может определяться механизмом активации клеток. Недавно мы продемонстрировали, что липополисахарид (LPS) стимулирует производство TNF-alpha первичными человеческими моноцитами путем активации NF-kappa B, принимая во внимание, что производство TNF-alpha после лигирования с CD45 и стимуляции зимосаном, является независимой от фосфатидил-инозитол-3-киназы и NF-kappaB (16, 18). Участки сцепления других факторов транскрипции, включая NF-IL-6, также были идентифицированы в регионе промотора гена TNF-alpha и могут быть важны при других формах активации клеток (22). Молекулярное регулирование IFN-gamma также является комплексным, со свидетельствами, что NF-AT и NF-kappaB участвуют в производстве этого цитокина (19). Хотя важность NF-AT в транскрипции гена IFN-gamma хорошо известна, роль NF-kappaB менее очевидна, поскольку специфические участки сцепления пока не идентифицированы в регионе промотора гена IFN-gamma.

На основании этих наблюдений, факторы, влияющие на производство провоспалительных цитокинов при болезнях, где характер возбуждения клеток неизвестен, наиболее вероятно могут быть идентифицированы при прямом исследовании первичных клеток, участвующих в патологическом процессе. Недавно, мы сообщили о успешном использовании аденовирусных векторов для исследования молекулярных механизмов регулирования генов цитокинов у первичных человеческих макрофагов. Используя аденовирусные векторы, кодирующие IkappaBalpha (AdvIkappaBalpha), мы продемонстрировали важность NF-kappaB в производстве TNF-alpha синовиальными макрофагами при ревматоидном артрите (17, 25). Несмотря на данные, что альвеолярные макрофаги здоровых добровольцев рефрактерны к аденовирусной инфекции (26), мы решили определить, действительно ли саркоидные альвеолярные макрофаги столь же трудно инфицировать аденовирусом. Мы подтвердили, что альвеолярные макрофаги здоровых добровольцев были резистентны аденовирусной инфекции, но саркоидные альвеолярные макрофаги и Т-клетки могут быть эффективно инфицированы аденовирусом. У саркоидных альвеолярных макрофагов и Т-клеток, относительно нормальных альвеолярных макрофагов и T-клеток периферической крови, наблюдалось увеличение экспресиии коксакивирусных/аденовирусных рецепторов (CAR) и интегринов alpha vbeta 3 и alpha vbeta 5 (27, 28). Хотя ранее мы продемонстрировали инфицирование синовиальных T-клеток аденовирусом при ревматоидном артрите (25), общепринято, что первичные T-клетки рефрактерны к инфекции (29, 30).

Поскольку саркоидные альвеолярные макрофаги и Т-клетки могут быть эффективно инфицированы аденовирусом, мы использовали вектор AdvIkappaBalpha, чтобы исследовать роль NF-kappaB в регулировании генов провоспалительных цитокинов, важных в патогенезе саркоидоза (10, 14, 15). Мы обнаружили, что производство TNF-alpha и IL-6 альвеолярными макрофагами и IFN-gamma Т-клетками является зависимым от NF-kappaB, принимая во внимание, что производство IL-4 Т-клетками не зависило от NF-kappaB.

Аденовирусные векторы

Рекомбинантные аденовирусные векторы, кодирующие бета-галактозидазу Escherichia coli (Advbeta gal), IkappaBalpha с промотором вируса цитомегалии и ядерной последовательностью (AdvIkappaBalpha), зеленым флуоресцентным белком (GFP) с промотором вируса цитомегалии (AdvGFP) и вектор без вставки (Adv0), были любезно предоставлены доктором Wood и Byne (Oxford, UK), de Martin (Vienna, Austria) и доктором Т. Mahon (Kennedy Institute, London, UK), соответственно.

Результаты

Пациенты

БАЛ был выполнен до трансбронхиальной биопсии. Диагноз легочного саркоидоза был верифицирован при трансбронхиальной биопсии, демонстрируя наличие неказеозных гранулем. Клеточный анализ каждого экземпляра ЖБАЛ показал < 5 % эпителиальных клеток. Дифференциальный индекс клеток был рассчитан для каждого экземпляра ЖБАЛ (> 300 клеток которые содержали от 55 до 72 % альвеолярных макрофагов и от 28 до 45 % Т-клеток). Образцы ЖБАЛ здоровых добровольцев содержали > 94 % альвеолярных макрофагов.

Инфицирование аденовирусом альвеолярных макрофагов и Т-клеток

Предыдущие исследования показали, что нормальные альвеолярные макрофаги и Т-клетки являются рефрактерными к аденовирусной инфекции (26). Используя аденовирусные векторы, мы проверили это результат и определили, являются ли саркоидные альвеолярные макрофаги и Т-клеток рефрактерными к инфекции. Мы наблюдали, что саркоидные клетки, но не нормальные клетки БАЛ, легко инфицировались Advbeta gal при оптимальном MOI 150:1, причем > 95 % клеток экспрессировали бета-галактозидазу. Анализ поверхностных маркеров (CD3 для Т-клеток и CD14 для альвеолярных макрофагов) показал, что саркоидные альвеолярные макрофаги и Т-клетки инфицировались одинаково. AdvGFP также эффективно инфицировал саркоидные альвеолярные макрофаги и Т-клетки. Экспрессия GFP не была обнаружена у клеток здоровых добровольцев, подтверждая результаты Kaner (26). Поскольку ЖБАЛ здоровых добровольцев не содержал существенного числа Т-клеток (< 5 %), мы проанализировали T-клетки периферической крови и моноциты пациентов с саркоидозом, чтобы определить, является увеличенная восприимчивость к аденовирусной инфекции особенностью всех гемопоэтических клеток при саркоидозе. Мы наблюдали, что T-клетки периферической крови и моноциты пациентов с саркоидом были рефрактерны к аденовирусной инфекции. Эти наблюдения соответствуют результатам предыдущих исследований, которые показали, что моноциты периферической крови и T-клетки здоровых индивидуумов не могли быть инфицированы аденовирусом (17, 29). Эти данные предполагают, что увеличенная восприимчивость к аденовирусной инфекции - особенность T-клеток и альвеолярных макрофагов на участках воспаления.

Эффективная инфекция саркоидных альвеолярных макрофагов и Т-клеток связана с увеличением экспрессии CAR, alpha vbeta 3 и alpha vbeta 5 интегринов

Инфицирование аденовирусом было связано с экспрессией CAR, alpha vbeta 3 и alpha vbeta 5 интегринов (27, 28). Мы наблюдали низкие или невыявляемые уровни CAR, alpha vbeta 3 и alpha vbeta 5 интегринов на поверхности нормальных альвеолярных макрофагов и Т-клеток периферической крови, которые были рефрактерны к инфекции. Кроме того, эти рецепторы также не были выявлены на поверхности моноцитов периферической крови здоровых добровольцев и пациентов с саркоидозом. Напротив, саркоидные альвеолярные макрофаги, инфицированные аденовирусной инфекцией, экспрессировали все три этих поверхностных антигена и саркоидные Т-клетки экспрессировали CAR и alpha vbeta 5 интегрины, но не alpha vbeta 3 интегрины. Эти результаты указывают, что увеличенная восприимчивость к аденовирусной инфекции коррелирует с увеличением экспресиии CAR, alpha vbeta 3 и alpha vbeta 5 интегринов.

М-CSF уменьшает экспресиию CAR, alpha vbeta 3 и alpha vbeta 5 интегринов у саркоидных альвеолярных макрофагов и Т-клеток и предотвращает инфицирование аденовирусом

Ранее мы продемонстрировали, что культивирование первичных моноцитов в присутствии М-CSF в течение 48 часов увеличивает экспрессию alpha vbeta 3 и alpha vbeta 5 интегринов и увеличивает эффективность аденовирусной инфекции (17). Однако, дальнейше культивирование моноцитов с М-CSF в течение 5 дней ведет к парадоксальному уменьшению экспресиии alpha vbeta 3 и alpha vbeta 5 интегринов и уменьшению восприимчивости к аденовирусной инфекции (доктор А. Foey, личная переписка). Мы решили проверить, действительно ли недавно подготовленные саркоидные альвеолярные макрофаги и Т-клетки были подобны моноцитам, культивированных с M-CSF в течение 2 дней и приводит ли дальнейшее воздействие М-CSF к уменьшению эффективности аденовирусной инфекции. Мы обнраужили, что М-CSF вызывал уменьшение экспресиии CAR, alpha vbeta 3 и alpha vbeta 5 интегринов и значительное уменьшение экспрессии трансгенов аденовирусных векторов. Саркоидные альвеолярные макрофаги, не культивироанные с М-CSF, не демонстрировали никакого изменения экспрессии поверхностных антигенов или эффективности аденовирусной инфекции через 48 часов in vitro.

Вектор AdvIkappaBalpha приводит к сверхэкспрессии Ikappa Balpha у клеток саркоидного ЖБАЛ

Обнаружив эффективное инфицирование саркоидных альвеолярных макрофагов и Т-клеток, мы исследовали, могли ли бы аденовирусные трансгены использоваться для изменения внутриклеточных путей передачи сигналов. Сверхэкспрессия Ikappa Balpha наблюдалась у саркоидных клеток ЖБАЛ, инфицированных AdvIkappa Balpha, но не пустым аденовирусным вектором (Adv0). Дополнительное исследование с антителами p42/44 MAPK, подтвердило, что каждый из образцов содержал эквивалентное количество белка. Анализ активности NF-kappaB был выполнен на соответствующих ядерных экстрактах инфицированных Adv0 и AdvIkappa Balpha клеток. Существенная конститутивная активность NF-kappa B была обнаружена у саркоидных клеток ЖБАЛ, инфицированных Adv0.

Как ожидалось, стимуляция LPS привела к цитосолической деградации Ikappa Balpha у клеток, инфицированных Adv0. Имелось соответствующее увеличение активности NF-kappaB в ядерных экстрактах стимулированных LPS клеток, инфицированных Adv0. Напротив, в четырех последовательных экспериментах не имелось существенного уменьшения экспрессии Ikappa Balpha в цитосолических экстрактах инфицированных AdvIkappa Balpha клеток после активации LPS. Инфицированные AdvIkappa Balpha клетки сверхэксперссировали Ikappa Balpha, имелось существенное уменьшение активности NF-kappaB по сравнению с клетками, инфицированными Adv0. Кроме того, имелось значительное уменьшение индуцированного LPS увеличения активности NF-kappaB в ядерных экстрактах клеток, инфицированных AdvIkappa Balpha по сравнению с клетками, инфицированными Adv0.

Сверхэкспрессия Ikappa Balpha ингибирует производство TNF-alpha и IL-6 альвеолярными макрофагами и IFN-gamma Тклетками, но не производство IL-4 Т-клетками

Мы исследовали, влияет ли сверхэкспрессия Ikappa Balpha на производство провоспалительных цитокинов, которое зависит от NF-kappaB. Из-за вариаций между пациентами, результаты приведены как процент относительно неинфицированных клеток того же самого экземпляра ЖБАЛ. Через 24 часа, конститутивное производство TNF-alpha клетками, инфицированными AdvIkappa Balpha, уменьшилось на 25.9 ± 11.6 % (p < 0.001, n = 7) и производство IL-6 на 31.3 ± 9.7 % (pP < 0.002, n = 7). Увеличенное производство TNF-alpha и IL-6 после стимуляции LPS, также ингибировались сверхэкспрессией Ikappa Balpha, производство TNF-alpha клетками, инфицированными AdvIkappa Balpha, уменьшилось на 11.4 ± 3.9 % (p < 0.0001, n = 7) и производство IL-6 на 7.5 ± 2.8 % (p < 0.0002, n = 7). Наши результаты указывают, что и конститутивное и стимулированное LPS производство TNF-alpha и IL-6 саркоидными альвеолярными макрофагами требует транслокации NF-kappaB. Мы также исследовали влияние инфекции AdvIkappa Balpha на производство IFN-gamma саркоидными Т-клетками. Конститутивное производство IFN-gamma Т-клетками, инфицированными AdvIkappa Balpha, уменьшилось на 27.9 ± 9.1 % (p < 0.0002, n = 7). Напротив, производство IL-4 Т-клетками, инфицированными AdvIkappa Balpha было 91.89 ± 10.1 % и значительно не отличалось от не инфицированных клеток (p = 0.65, n = 5). Не имелось существенных различий в производстве цитокинов неинфицированным клетками по сравнению с инфицированными Adv0 клетками, указывая, что этот вектор per se не влиял на регулирование генов цитокинов. Производство цитокинов клетками, инфицированными Adv0 относительно неинфицированных было 106.8 ± 25.0, 114.4 ± 17.1, 97.6 ± 12.3 и 104.6 ± 13.9 % для конститутивного и стимулированного LPS производства TNF-alpha и конститутивного и стимулированного LPS производства IL-6, соответственно. Аналогично, производства IFN-gamma и IL-4 инифцированными Adv0 Т-клетками относительно неинфицированных Т-клеток было 126.3 ± 28.0 и 95.2 ± 21.7 %, соответственно.

Ингибирование производства IFN-gamma происходит вследствие прямого ингибирования активности NF-kappaB у саркоидных Т-клеток

Предположив, что взаимная активация альвеолярных макрофагов и Т-клеток является ответственной за производство цитокинов при саркоидозе, ингибирование производства IFN-gamma вследствие инфицирования AdvIkappa Balpha альвеолярных макрофагов, приведет к уменьшению активации Т-клеток. Чтобы проверить, является уменьшение производства IFN-gamma прямым результатом ингибирования NF-kappaB у саркоидных Т-клеток, саркоидные Т-клетки были изолированы, независимо инфицированы AdvIkappa Balpha и затем добавлены к неинфицированным альвеолярным макрофагам. При этих условиях, производство IFN-gamma инфицированными AdvIkappa Balpha Т-клетками через 24 часа уменьшилось на 46.2 ± 7.7 % (p < 0.006, n = 4). Процент производства IFN-gamma инфицированными Adv0 Т-клетками относительно неинфицированных Т-клеток был 109.0 ± 27.8 %. Ингибирование производства IFN-gamma составляло приблизительно 2/3, когда и альвеолярные макрофаги и Т-клетки были инфицированы AdvIkappa Balpha. Эти данные говорят, что в экспериментах с коинфекцией альвеолярных макрофагов и Т-клеток, уменьшение активности NF-kappaB является главной причиной ингибирования производства IFN-gamma, но, вероятно, уменьшение активации саркоидных альвеолярных макрофагов также вносит вклад в уменьшение производства IFN-gamma.

Обсуждение

Наше исследование показало, что аденовирусные векторы - эффективный путь исследования регулирования генов цитокинов у саркоидных альвеолярных макрофагов и Т-клеток. Кроме того, что альвеолярные макрофаги и Т-клетки пациентов с легочным саркоидозом эффективно экспрессируют аденовирусные трансгены, мы подтвердили данные, что нормальные альвеолярные макрофаги рефрактерны к аденовирусной инфекции (26). Мы наблюдали, что саркоидные альвеолярные макрофаги и Т-клетки, в отличие от нормальных альвеолярных макрофагов и Т-клеток периферической крови, были чувствительны к аденовирусной инфекции и экспрессировали CAR, alpha vbeta 3 и alpha vbeta 5 интегрины, что поддерживает ранние сообщения, что эти поверхностные антигены участвуют в чувствительности к аденовирусной инфекции у человеческих макрофагов и T-клеток (17, 26, 29). Инфицируя клетки ЖБАЛ пациентов с саркоидозом AdvIkappa Balpha, мы установили, что передача сигнала NF-kappaB необходима для производства TNF-alpha и IL-6 альвеолярными макрофагами и производства IFN-gamma Т-клетками. Производство IL-4 не ингибировалось экспрессией Ikappa Balpha, указывая, что NF-kappaB не требуется для экспрессии этого цитокина.

Хотя гемопоэтические клетки обычно не являются целевыми для аденовирусов, при некоторых условиях, могут быть достигнуты существенные уровни инфекции. Предыдущие исследования показали, что частичное дифференцирование моноцитов в присутствии М-CSF в течение 48 часов увеличивает экспресиию alpha vbeta 3 и alpha vbeta 5 интегринов и увеличивает эффективность аденовирусной инфекции (17, 29). Кроме того, мы также наблюдали, что макрофаги, выделенные из суставной жидкости при ревматоидном артрите, также могут быть эффективно инфицированы аденовирусом, без предварительной обработки факторами роста (25). Интересно, что длительное дифференцирование моноцитов периферической крови в присутствии М-CSF (7d), приводит к парадоксальному уменьшению инфекции и уменьшению экспрессии интегринов alpha vbeta 3 и alpha vbeta 5 (А. Foey, личная переписка). До сих пор не было ясно, отражают ли эти различия различную восприимчивость к аденовирусной инфекции, отражаемую дифференцированием моноцитов в макрофаги или связаны с длительным контактом с воспалительной окружающей средой. Наши результаты говорят, что верно последнеее предположение, поскольку нормальные альвеолярные макрофаги не экспрессируют CAR, интегрины alpha vbeta 3 и vbeta 5 и не могут быть инфицированы адновирусом. Дальнейшая информация относительно механизмов, которые управляют аденовирусной инфекцией моноцитарных клеток, были получены в экспериментах с саркоидными альвеолярными макрофагами и M-CSF. Саркоидные альвеолярные макрофаги, подобно моноцитам периферической крови, культивированных в присутствии гранулоцито-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) или макрофагального колониестимулирующего фактора (М-CSF) в течение 2 дней, эффективно инфицируются аденовирусом и эксперссируют интегрины alpha vbeta 3 и alpha vbeta 5 (17). Напротив, нормальные альвеолярные макрофаги, рефрактерные к аденовирусной инфекции, не экспрессируют CAR, интегрины alpha vbeta 3 или alpha vbeta 5 и в этом отношении походят на саркоидные альвеолярные макрофаги, культивированныке в течение 48 дней с М-CSF и моноциты периферической крови, культивированные в присутствии М-CSF в течение 7 дней. Эти данные говорят, что саркоидные альвеолярные макрофаги изначально являются незрелыми и поскольку постепенно они обретают фенотип зрелых макрофагов, они станоявятся рефрактерными к аденовирусной инфекции. Данные, что саркоидные альвеолярные макрофаги, экспрессирующие особые моноцитарные поверхностные маркеры, не были обнаружены у здоровых добровольцев, поддерживают гипотезу, что саркоидные альвеолярные макрофаги являются генотипически незрелыми (40). Возможно, восприимчивость к аденовирусной инфекции является не только особенностью незрелых макрофагов, но также отражает провоспалительный фенотип клеток. Мы, подобно другим исследователям, наблюдали, что саркоидные альвеолярные макрофаги спонтанно производят не только множество провоспалительных цитокинов, включая TNF-alpha, IL-1beta и IL-6, но и небольшое количество иммунорегуляторного цитокина IL-10 (9, 10, 41, 42). Это коррелирует с предыдущими результатами, полученными в нашей лаборатории, которые показали, что отношение производства TNF-alpha к производству IL-10 у моноцитов в присутствии М-CSF больше через 2 дня, чем через 7 дней (А. Foey, личная переписка). Возможно, что дальнейшее дифференцирование саркоидных альвеолярных макрофагов, также может изменять баланс производства цитокинов в сторону противовоспалительного профиля.

Недавно подготовленные Т-клетки периферической крови столь же резистентны к аденовирусной инфекции, как и моноциты (29, 30). Однако, в отличие от моноцитов, не имеется простой in vitro стратегии (например, кльтивирование с GM-CSF), которая эффективно приводит к аденовирусной инфекции. Даже тропизм вирусов был лишь умеренно успешным для проникновения аденовирусов в T-клетки (30). Факторы окружающей среды, приводящие к эффективной аденовирусной инфекции саркоидных Т-клеток не ясны. Подобие с синовиальными T-клетками при ревматоидном артрите говорит, что инфекция может находиться под влиянием воздействия воспалительной окружающей среды, хотя попытки копировать эти условия ex vivo с помощью факторов роста и антигенного возбуждения были неудачны (29, 30). В ситуации, аналогичной с моноцитами, CAR и alpha vbeta 5 интегрины также экспрессированы на саркоидных Т-клетках, но не на Т-клетках периферической крови. Эти данные говорят, что эти поверхностные антигены участвуют в инфицировании T-клеток адновирусом.

Главная цель нашего исследования состояла в том, чтобы установить, могут ли аденовирусные векторы использоваться для исследования специфической роли NF-kappaB в регулировании генов цитокинов при легочном саркоидозе. Хотя ранее было показано, что активность NF-kappaB увелична при воспалительных болезнях легкого (43), прямой корреляции с производством TNF-alpha, IL-6 или IFN-gamma ранее установлено не было. Мы наблюдали, что производство TNF-alpha и IL-6 саркоидными альвеолярными макрофагами и производство IFN-gamma саркоидыми Т-клетками зависит от NF-kappaB, но производство IL-4 альвеолярными макрофагами не зависит NF-kappaB. Ингибирование производства IFN-gamma наблюдалось, когда изолированные саркоидные Т-клетки были инфицированы AdvIkappa Balpha и затем были повторно добавлены к неинфицированным саркоидным альвеолярным макрофагами, что является сильным свидетельством, что регулированиегена IFN-gamma у альвеолярных макрофагов яаляется NF-kappaB-зависимым. Ингибирование IFN-gamma было более сильным, когда и альвеолярные макрофаги и Т-летки были инфицированы AdvIkappa Balpha, предполагая, что активность NF-kappaB у альвеолярных макрофагов косвенно вносит вклад в производство IFN-gamma альвеолярными макрофагами. NF-kappaB-зависимые функции макрофагов, которые могут влиять на производство IFN-gamma, включают производство TNF-alpha и презентацию антигена (46).

Необходимость NF-kappaB для производства TNF-alpha и IL-6 ранее была обнаружена у синовиальных макрофагов при ревматоидном артрите и у стимулированных LPS моноцитов периферической крови (17, 25). Однако, эти данные не могут быть применимы к саркоидозу, где механизм активации клеток неизвестен, поскольку ранее мы показали, что необходимость NF-kappaB для экспрессии гена TNF-alpha и IL-6 зависит от механизма возбуждения клеток (16). Хотя известна роль сигнала NF-AT в транскрипции гена IFN-gamma (47, 48), важность других факторов транскрипции, включая NF-kappaB, менее известна. Несмотря на неудачу идентификации канонического участка сцепления NF-kappaB в пределах промотора гена IFN-gamma, ранее сообщалось, что он участвует в транскрипции этого гена, возможно связываясь с участком, который также связывает NF-AT (19, 20). Наше исследование получило самые сильные до настоящего времени свидетельства, что NF-kappaB необходим для экспрессии гена IFN-gamma, но не смогло продемонстрировать прямое сцепление фактора транскрипции с промотором гена. Возможно, NF-kappaB является промежуточным белком, который необходим для производства другого фактора транскрипции, который регулирует экспрессию гена IFN-gamma. Ответ на этот вопрос требует построение гена IFN-gamma с отсутствующим предполагаемым участком сцепления NF-kappaB в области промотора. Хотя легочный саркоидоз является Th1 болезнью, Т-клетки сохраняют способность производить Th2 лимфокины, например IL-4. Наблюдение, что производство IL-4 не ингибировалось AdvIkappa Balpha, совместимо с предыдущими сообщениями, что транскрипция гена этого цитокина требует NF-AT, но не NF-kappa B (48).

В этом исследовании мы установили необходимость NF-kappaB для регулирования важных провоспалительных цитокинов при легочном саркоидозе. Наши данные говорят, что CAR, интегрины alpha vbeta 3 и alpha vbeta 5 необходимы для аденовирусной инфекции альвеолярных макрофагов и Т-клеток, хотя in vivo, факторы, влияющие на экспрессию этих поверхностных антигенов, полностью не изучены. Кроме того, что аденовирусы являются полезным инструментом для исследований регулирования генов цитокинов in vitro, эти данные также говорят, что аденовирусные векторы in vivo могут использоваться как транспорт для доставки трансгенов в гемопоэтические клетки, участвующие в воспалительной болезни легкого. Способность аденовирусов выборочно инфицировать саркоидные, но не нормальные альвеолярные макрофаги, может делать генную терапию возможной терапией этих состояний в будущем.