Journal of physiology and pharmacology 2007, 58, suppl 5, 753-766

Модуляционный эффект сыворотки пациентов с саркоидозом на ангиогенез, индуцированный мононуклеарными клетками

T.M. Zelonka, U. Demkow, B. Bialas, M. Filewska, K. Zycinska, E. Radzikowska, J. Szopinski, E. Skopinska-Rozewska
Department of Family Medicine, Warsaw Medical University; Institute of Tuberculosis and Lung Diseases; Department of Laboratory Diagnostics and Clinical Immunology of the Developmental Age, Warsaw Medical University; Department of Pathology, Biostructure Center, Warsaw Medical University, Warsaw, Poland

Реферат

Саркоидоз - системная гранулематозная воспалительная болезнь, характеризованная привлечением к участкам активности болезни и активацией мононуклеарных клеток периферической крови. Неоваскуляризация - основной сосудистый ответ при хроническом воспалении и гипоксии. Цель исследования состояла в том, чтобы оценить влияние сыворотки пациентов с саркоидозом на ангиогенную способность различных субпопуляций нормальных мононуклеарных клеток периферической крови человека (MNC), связи серологических уровней IL-6 и IL-8 с рентгенографической стадией болезни и с присутствием внелегочной болезни. Были исследованы образцы сыворотки, полученные у 42 пациентов с саркоидозом. 12 пациентов имели стадию I, 16 пациентов стадию II и 14 стадию III саркоидоза. Для определения параметров ангиогенеза использовался метод Sidky и Auerbach. Уровни IL-6 и IL-8 в сыворотке пациентов с саркоидозом были оценены с помощью ELISA. Сыворотка пациентов с саркоидозом имела увеличенную ангиогенную активность по отношению к MNC чем сыворотка здоровых доноров (P < 0.001). Ангиогенная активность сыворотки при саркоидозе зависела от стадии болезни и была наиболее явной в стадии II (P < 0.05). Сыворотка пациентов с внелегочной болезнью имела более сильное влияние на ангиогенез, чем сыворотка пациентов только с внутригрудной болезнью (P < 0.001). Хотя серологические уровни IL-6 и IL-8 коррелировали друг с другом, корреляции не было найдено между серологическими уровнями IL-6 и IL-8 и ангиогенной активностью сыворотки. Удаление моноцитов из MNC аннулировало влияние сыворотки пациентов с саркоидозом на ангиогенез (P < 0.001). Сыворотка пациентов с саркоидозом и здоровых индивидуумов является основным источником медиаторов, участвующих в ангиогенезе. В сыворотке пациентов с саркоидозом главным источником проангиогенных факторов являются моноциты.

Введение

Ангиогенез - процесс формирования новых сосудов из существующей сосудистой сети. Этот процесс происходит при многих патологических состояниях, особенно при росте опухолей, метастазировании (1), хроническом воспалении (ревматоидный артрит, болезнь Крона, псориаз) и при интерстициальном легочном фиброзе (2-6). Саркоидоз - системная гранулематозная воспалительная болезнь, характеризованная привлечением и активацией мононуклеарных клеток периферической крови на участке активности болезни (7). Хотя ангиогенез и воспаление близко связаны (8), роль неоваскуляризации в патогенезе саркоидоза остается неясной. Увеличение способности активизированных альвеолярных макрофагов стимулировать ангиогенез, было обнаружено в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом в 1989 г. (9, 10). Были обнаружены изменения капилляров в экземплярах биопсии легкого пациентов с саркоидозом (11). Также наблюдалась неоваскуляризация сетчатки при саркоидозе глаз (12).

Саркоидоз характеризуется воспалением, пролиферацией клеток, депозитами внеклеточного матрикса и экспрессией нескольких цитокинов, участвующих в процессе ангиогенеза (13). Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) - необходимый фактор, регулирующий процесс нормального и патологического ангиогенеза (14). VEGF - митоген, специфический для сосудистых эндотелиальных клеток, который стимулирует деградацию внеклеточного матрикса. В саркоидных гранулемах и у альвеолярных макрофагов была обнаружена увеличенная экспрессия VEGF (15).

Большинство факторов, произведенных в процессе саркоидного воспаления, IL-1, IL-6, IL-8, базовый фактор роста фибробласта (bFGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF) и фактор некроза опухоли альфа (TNF-alpha), также имеют проангиогенные свойства и участвуют в патогенезе саркоидоза (8, 16). Однако, многочисленные антиангиогенные факторы, IL-10, IL-12, INF-alpha, INF-gamma и трансформирующий фактор роста бета (TGF-beta) ингибируют воспаление (8, 17). Процесс ангиогенеза зависит от баланса между стимуляторами (часто провоспалительными медиаторами) и ингибиторами (противовоспалительными факторами) (13, 18, 19).

Цель исследования состояла в том, чтобы оценить влияние сыворотки пациентов с саркоидозом на ангиогенную способность различных субпопуляций нормальных мононуклеарных клеток периферической крови человека (MNC), связи серологических уровней IL-6 и IL-8 с рентгенографической стадией болезни и с присутствием внелегочной болезни.

Пациенты

В исследование было включено 42 пациента с саркоидозом в возрасте 22-68 лет (средний возраст 38.7±11.4 лет), 16 женщин и 26 мужчин. 30 пациентов никогда не курили. Диагноз саркоидоз был основан на критериях ATS/ERS/WASOG (7). Согласно классификации ATS/ERS/WASOG, 12 пациентов имели стадию I, 16 пациентов стадию II и 14 стадию III саркоидоза. 23 пациента имели внелегочные проявления саркоидоза: увеличение селезенки (12 случаев) или печени (7 случаев), узловатая эритема (7 случаев) и увеличение внелегочных лимфатических узлов (6 случаев). У 3 пациентов наблюдалось поражение суставов и 1 пациент имел увеит.

У всех пациентов были оценены общие симптомы, включая слабость, лихорадку, артралгии и легочные симптомы, включая кашель и одышку. Для оценки одышки использовалась шкала, состоящая из 5 пунктотв: 0 - нет одышки, 1 - небольшая одышка, 2 - умеренная одышка, 3 - серьезная одышка, 4 - серьезная одышка в состоянии покоя. 50 % пациентов имели кашель и 50 % имели общие симптомы. Исследования крови были проведены после получения информированного согласия и до начала лечения кортикостероидами или цитотоксическими средствами. В группу контроля были включены 16 здоровых некурящих доноров крови (10 женщин, 6 мужчин, средний возраст 34.5±8.6 лет, диапазон 20-58 лет), не имевших никаких ненормальностей при физикальной экспертизе и патологии рентгенограммы легких.

Результаты

Сыворотка пациентов с саркоидозом значительно сильнее стимулировала ангиогенез по сравнению с сывороткой здоровых доноров (P < 0.001). Однако, сыворотка здоровых доноров также имела влияние на стимулирование ангиогенеза, по сравнению с фосфатным солевым буфером (P < 0.001). Среднее число новых сосудов, сформированных после введения MNC, инкубированных с фосфатным солевым буфером было 11.37 ±1.23; после введения MNC, инкубированных с сывороткой группы контроля было 13.08 ±1.11 и после введения MNC, инкубированных с сывороткой пациентов с саркоидозом достигло 15,73 ±1,57.

Проангиогенный эффект сыворотки пациентов с саркоидозом зависел от стадии болезни. Самый высокий индекс ангиогенности наблюдался, когда MNC были инкубированы с сывороткой пациентов с саркоидозом стадии II (1.27 ±0.14), по сравнению с сывороткой пациентов стадии I (1.17 ±0.09, P < 0.05) и стадии III (1.17 ±0.07, P < 0.02). В группе пациентов только с внутригрудным саркоидозом, индекс ангиогенности был значительно ниже (1.13 ±0.07) по сравнению с индексом ангиогенности в группе пациентов с внелегочными проявлениями (1.27 ±0.11, P < 0.001). Никакой корреляции не было найдено между индексом ангиогенности и кашлем, одышкой или общими симптомами.

Среднее число новых сосудов, образованных после введения MNC, очищенных от моноцитов, инкубированных с сывороткой 14 пациентов с саркоидозом (14.56 ±1.43) значительно уменьшилось (P < 0.001) по сравнению с числом новых сосудов после введения MNC инкубированных с той же самой сывороткой (17.2 ± 1.2) и было подобно числу новых сосудов, образованных после введения MNC очищенных от моноцитов, инкубированных с сывороткой здоровых доноров (14.75 ±1.15). Однако, введение MNC, очищенных от моноцитов, инкубированных с сывороткой здоровых доноров значительно (P=0.01) увеличило число новых сосудов по сравнениею с MNC, инкубированных с той же самой сывороткой (от 13.49 ±0.86 до 14.75 ±1.15). Подобный проангиогенный эффект наблюдался в группе контроля, когда MNC и MNC, очищенные от моноцитов, были инкубированны только с фосфатным солевым буфером без сыворотки. Наблюдалось статистичиски значимое (P=0.05) увеличение среднего числа сосудов, 12.14 ±1.06 и 13.24 ±1.43.

Индекс ангиогенеза в группе пациентов с саркоидозом значительно уменьшился, с 1.24 ±0.06 для MNC до 0.98 ±0.08 для MNC, очищенных от моноцитов (P < 0.001). Однако, после введения MNC, инкубированных с фосфатным солевым буфером, индекс ангиогенности не изменился (0.88 ±0.04), по сравнению с индексом ангиогенности после удаления моноцитов (0.88 ±0.05).

Уровень IL-6 у пациентов с саркоидозом зависел от стадии болезни. Самый высокий уровень наблюдался в стадии I болезни (38.70 ±8.80 pg/ml), был немного ниже в стадии II (31.8 ±14.5 pg/ml) и был самым низким в стадии III (24.90 ±9.80 pg/ml). Различие между стадией I и стадией III было статистически значимым (P < 0.05). Мы не обнаружили корреляции между уровнем IL-6, индексом ангиогенности или числом новых сосудов.

Самый высокий уровень IL-8 наблюдался в стадии II саркоидоза (722 ±291 pg/ml), но различия между уровнями IL-8 в стадии I (679 ±101 pg/ml) и стадии III (688 ±275 pg/ml) не были статитстически значимы. Корреляции между уровнями IL-8 и числом новых сосудов или индексом ангиогенеза не было найдено. Однако, уровни IL-6 и IL-8 коррелировали друг с другом (r=0.46, P < 0.01).

Обсуждение

Ангиогенез участвует в патогенезе идиопатической интерстициальной пневмонии (6, 23). Keane с коллегами (24) продемонстрировали увеличенную ангиогенную активность в ткани легкого при идиопатическом легочном фиброзе и экспериментальном фиброзе. Этот эффект приписывается нарушению баланса секреции проангиогенных (IL-8) и антиангиогенных хемокинов (IP-10). Agostini с коллегами (25) обнаружили увеличенную экспрессию IP-10 в саркоидных тканях и связь уровней IP-10 в ЖБАЛ со степенью T-клеточного альвеолита, предполагая важную роль IP-10 в управлении миграцией T-клеток к участкам воспаления. Недавно, Katoh с коллегами (26) сообщили об увеличенных уровнях IP-10 и MIG в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом.

Однако, в документе ATS/ERS/WASOG по саркоидозу, участие ангиогенеза в патогенезе болезни не упомянуто (7). Многие исследования говорят, что ангиогенез играет важную роль при саркоидозе (9, 10, 15, 23, 25, 27). Ранняя саркоидная реакция характеризуется накоплением активизированных макрофагов и T-клеток на участках воспаления (7). В 1977 г. Polverini с коллегами (28) продемонстрировали, что активизированные макрофаги стимулируют неоваскуляризацию. В 1986 г. Ocabe и Takaku (29) идентифицировали в культуре макрофагов и эпителиоидных клеток пациентов с саркоидозом фактор, стимулирующий пролиферацию сосудистых эндотелиальных клеток. Следовательно, возникает вопрос, участвует ли ангиогенез в процессах регенерации тканей и могут ли иммунные клетки прибывать к участкам воспаления через новую сосудистую сеть. В неказеозной гранулеме наблюдается уменьшение сети сосудов, принимая во внимание, что на периферии гранулемы, число капилляров увеличено (30). Также есть свидетельства, что неоваскуляризация при саркоидозе является особенностью альвеолита (31), но изменения также наблюдаются в сосудах бронхов, сетчатки, мышц и почек (32-34). Электронная микроскопия показывает утолщение эндотелия, сужение просвета сосудов и слоистую структуру базальной мембраны капилляров и венул в дерме. Эти результаты демонстрируют, что гранулематозный васкулит и микроангиопатия наблюдаются при кожном саркоидозе (35).

Повреждение эндотелиальных клеток характерно для синдрома респираторного дистресс-синдрома и развития хронической болезни легкого. VEGF - эндотелиальный митоген, который участвует в росте и восстановлении сосудистых эндотелиальных клеток. Высокие уровни VEGF у пациентов с саркоидозом уменьшаются вскоре после начала лечения преднизоном, вместе с улучшением отека конечностей (36).

Tolnay с коллегами (15, 37) предположили важную роль моноцитов крови в процессе неоваскуляризации и формирования саркоидных гранулем (15, 37). Они обнаружили увеличенную экспрессию мРНК VEGF у макрофагов, эпителиальных и гигантских клеток а также увеличение производства VEGF этими клетками (15). Эндотелин-1, вазоактивный бронхоконстриктивный пептид, является мощным митогеном для клеток гладких мышц и фибробластов. Он играет важную роль при воспалении. Letizia с коллегами (38) предположили, увеличенные плазменные уровни эндотелина-1 при активном саркоидозе могут отражать дисфункцию эндотелия и активацию клеток.

Наше исследование показало, что сыворотка пациентов с саркоидозом содержит агенты, стимулирующие MNC к производству проангиогенных факторов. Сыворотка здоровых добровольцев, по сравнению с фосфатным солевым буфером, также стимулирует MNC. Однако, результаты нашего исследования не позволяют определить, какие именно агенты в сыворотке ответственны за стимуляцию неоваскуляризации.

IL-6 и IL-8 - два важных цитокина, участвующих в патогенезе саркоидоза, имеют проангиогенные свойства (16, 39, 40, 42). IL-6 может усиливать иммунную реакцию, ведя к хроническому течению болезни (41). Производство IL-6 и IL-8 при саркоидозе увеличено и их уровни коррелируют друг с другом и с активностью болезни (42). Тем не менее, связь между концентрацией IL-6 и IL-8 и ангиогенной активностью сыворотки пациентов с саркоидозом не была обнаружена в нашем исследовании. Наиболее интересным результатом нашего исследования является различный проангиогенный эффект, зависящий от наличия внелегочных повреждений. В случаях внелегочного саркоидоза, уровни провоспалительных и проангиогенных факторов в сыворотке увеличены по сравнению со случаями исключительно легочного саркоидоза. Sekiya с коллегами (27) показали, что уровень VEGF у пациентов с саркоидозом позволяет предсказать развитие внелегочных повреждений. Также интереснымм являются различия ангиогенной активности сыворотки пациентов с саркоидозом, в зависимости от рентгенографической стадии. Самая высокая проангиогенная активность наблюдалась в стадии II саркоидоза, в которой увеличение лимфатических узлов сопровождается интерстициальными повреждениями в легких.

Проангиогенные факторы в сыворотке пациентов с саркоидозом модулируют неоваскуляризацию, влияя на моноциты, которые производят факторы стимуляции для эндотелиальных клеток. Удаление моноцитов из MNC приводит к уменьшению проангиогенного эффекта сыворотки пациентов с саркоидозом к уровню сыворотки здоровых доноров. Следовательно, проангиогенные агенты в сыворотке пациентов с саркоидозом стимулируют только моноциты. Meyer с коллегами (9) также указали на ключевую роль моноцитов у пациентов с саркоидозом в стимуляции неоваскуляризации. Хотя необходимы дальнейшие исследования, чтобы объяснить роль неоваскуляризации в патогенезе саркоидоза, все больше данных указывают на участие ангиогенеза в развитии болезни.