Am. J. Respir. Crit. Care Med., Volume 160, Number 1, July 1999, 283-290

Антибактериальные компоненты бронхоальвеолярного лаважа здоровых индивидуумов и пациентов с саркоидозом

BIRGITTA AGERBERTH, JOHAN GRUNEWALD, ESMERALDA CASTANOS-VELEZ, BERIT OLSSON, HANS JORNVALL, HANS WIGZELL, ANDERS EKLUND, and GUDMUNDUR H. GUDMUNDSSON
Department of Medical Biochemistry and Biophysics, and Microbiology and Tumorbiology Center, Karolinska Institutet; Department of Medicine and Immunopathology Laboratory, Karolinska Hospital, Stockholm, Sweden

Реферат

Антибактериальные пептиды и протеины - неотъемлемая часть эпителиального защитного барьера , который обеспечивает немедленную защиту против бактериальной инвазии. У человека, альфа-дефензины производятся гранулоцитами, бета-дефензины-1 синтезируется эпителиоцитами, LL-37 производится гранулоцитами, но также индуцируются кожным эпителием в течение воспаления. Чтобы исследовать важность этих эффекторов при саркоидозе, мы проанализировали бронхоальвеолярный лаваж на бактерицидную активность. Антибактериальная активность была обнаружена в ЖБАЛ здоровых индивидуумов и пациентов с саркоидозом, с большей активностью у пациентов с саркоидозом. Активность проявлялась у нескольких антибактериальных компонентов LL-37, лизоцима, альфа -дефензинов и антилейкопротеазы. Кроме того, антибактериальный пептид LL-37 был обнаружен у альвеолярных макрофагов, бронхиальных эпителиоцитов, предполагая, что они играют защитную роль в слизистой дыхательных путей. Эпителий дыхательных путей защищен сложной антибактериальной системой защиты. Она активизирована при саркоидозе, что может объяснять, почему у этих пациентов редко развиваются серьезные инфекции респираторного тракта.

Введение

Эпителиоциты составляют первый барьер защиты против бактериальных патогенов. Кроме функции физического барьера, эти клетки способны синтезировать эффекторные молекулы. Помимо уничтожения потенциальных патогенов, компоненты врожденного иммунитете взаимодействуют с высоко специфичными лимфоцитами адаптивного иммунитета, таким образом усиливая деструкцию патогенов и увеличивая потенциал механизма защиты. Таким образом, эффективная, специфическая и длительная иммунная реакция зависит от взаимодействия между эффекторными клетками и молекулами врожденных и адаптивных систем (1, 2).

Антибактериальные пептиды и протеины - эффекторные молекулы врожденного иммунитета и главные медиаторы лизиса бактерий. Они синтезируются в эпителии и их экспрессия увеличена при бактериальной инфекции, при разрушении эпителиального барьера (рана) и при воспалении (3). Антибактериальные компоненты синтезируются гранулоцитами, которые привлекаются в места воспаления или немедленно активизируются после контакта с бактериями.

Эпителий легкого охватывает большую поверхность, которая постоянно подвергается воздействию микроорганизмов. Врожденной дисбаланс иммунной системы может приводить к рекуррентным инфекциям, как при муковисцидозе (8). Инактивация антибактериального пептида бета-дефензин-1 была предложена как решающий фактор нарушения иммунного ответа при муковисцидозе (9).

Чтобы сравнить антибактериальные свойства слизистой легкого в состоянии здоровья и при болезни, мы определили антибактериальную активность БАЛ у здоровых индивидуумов и Скандинавских пациентов с легочным саркоидозом. Пациенты с этой болезнью имеют интерстициальное легочное воспаление, характеризованное специфическим Th1 ответом на неизвестный антиген (10). В этой статье мы сообщаем, что при саркоидозе антибактериальная активность увеличена и зависит от многих факторов. Мы изолировали несколько антибактериальных пептидов из БАЛ: LL-37, альфа -дефензины (HNP 1-3), лизоцим и антилейкопротеазу (ALP, также известную как SLPI), вместе с несколькими неидентифицированными компонентами. Уровни mRNA LL-37, HBD-1 и альфа-дефензинов были измерены у здоровых индивидуумов и пациентов с саркоидозом. Увеличенная антибактериальная активность при саркоидозе указывает на активацию механизма, который может оперировать на белковом уровне. Таким образом, эпителий дыхательных путей имеет сложную антибактериальную систему защиты. Увеличенная активность этой системы у пациентов с легочным саркоидозом может быть причиной низкой частоты инфекции дыхательных путей у этих пациентов.

Методы

Пациенты

В исследовании использовались образцы ЖБАЛ, полученные у 10 здоровых индивидуумов и 12 Скандинавских пациентов с саркоидозом. Диагноз саркоидоз был основан на клинических данных и рентгенографических результатах, и в пяти случаях имел гистологическое подтверждение. Ни один из пациентов не получал лечение кортикостероидами, но одному пациенту дважды проводилось интраокулярное введение кортикостероидов (кенакорт, 60 милиграмм) за 4 и 2 недели до проведения БАЛ. Индивидуумы группы контроля имели нормальную рентгенограмму и не имели никаких инфекций дыхательных путей в течение по крайней мере 3 месяцев до исследования.

Результаты

Антибактериальная активность

Образцы ЖБАЛ 10 здоровых индивидуумов и 12 пациентов с легочным саркоидозом были исследованы на антибактериальную активности против тестовой бактерии Bacillus megaterium (11). Группа контроля показала гомогенные результаты в пределах от от 6.0 до 7.2 мм, со средним значением 6.8 мм. Напротив, пациенты имели гетерогенные значения в пределах от 4.8 до 9.3 мм, со средним значением 7.2 мм. Очень низкое значение наблюдалось у одного пациента, у которого кортикостероиды использовались до начала исследования. Два пациента с бездействующей болезнью также имели низкие значения. Два максимальных значения были у пациентов с высоким содержанием нейтрофилов в ЖБАЛ. Исключая этих пациентов, значительно (p = 0.035) более высокие значения подразумевают, что антибактериальная активность была значительно выше в группе пациентов (7.65 мм) чем в группе контроля (6.8 мм).

Изоляция и исследование антибактериальных компонентов

В ЖБАЛ пациентов с саркоидозом, антибактериальную активность имели несколько фракций, с индивидуальными различиями в распределении и интенсивности. Напротив, ЖБАЛ здоровых индивидуумов содержал только одну фракцию с антибактериальной активностью, происходящей от лизоцима. Эта фракция также была обнаружена у пациентов с саркоидозом, но в разных количествах у различных пациентов. В других фракциях с антибактериальной активностью у пациентов с саркоидозом были идентифицированы альфа -дефензины (HNP1, HNP2 и HNP3), ингибитор эластазы антилейкопротеаза (ALP) и LL-37.

Клеточная локализация

Для определения клеточной локализации LL-37, было выполнено центрифугирование и иммунологический анализ БАЛ здоровых индивидуумов и пациентов с саркоидозом. Сильное иммуноокрашивание наблюдалось у альвеолярных макрофагах (AM), но не наблюдалось у лимфоцитов. Положительные сигналы для LL-37 наблюдались у эпителиоцитов и AM.

Обсуждение

Врожденный и адаптивный иммунитет переплетены в сложную сеть. Результат иммунной реакции зависит от путей их активации (2). Цитокины - известные регуляторы иммунной системы, однако недавно было обнаружено, что молекулы C3d и альфа-дефензины также влияют на адаптивный иммунитет (19, 20). Таким образом, кроме прямого уничтожения патогена, эффекторные молекулы врожденного иммунитета оказывают стимулирующее воздействие на адаптивный иммунитет.

Антибактериальные пептиды и протеины - эффекторные молекулы врожденного иммунитета и являются неотъемлемой частью поверхностной обороноспособности (4, 7).

Для поддержания нормальной легочной функции, жизненно необходимо обуздать потенциальную патогенную инвазию. Для изучения эффекторных молекул легкого, мы выбрали материал, полученный из легких пациентов с саркоидозом и сравнили его со здоровыми индивидуумами. Ранее, были зарегистрированы экспрессия лизоцима, ALP, бета -дефензинов и LL-37 (21). Присутствие высоких уровней альфа-дефензинов было обнаружено в ЖБАЛ пациентов с диффузным панбронхиолитом (25), низкие уровни были найдены у пациентов без признаков инфекции или воспаления (26). Кроме того, активация факторов комплемента в пределах легкого происходит при некоторых легочных болезнях, таких как саркоидоз (27). Саркоидоз - системная гранулематозная болезнь неизвестной этиологии. У Скандинавских пациентов наиболее обычно происходит вовлечение легких, где происходит накопление активизированных Т-лимфоцитов, вероятно, в ответ на неизвестный антиген (10).

Мы проанализировали ЖБАЛ здоровых индивидуумов и пациентов с саркоидозом. В здоровом легком мы идентифицировали, лизоцим и LL-37, принимая во внимание, что у пациентов с саркоидозом мы обнаружили альфа-дефензины, ALP и дополнительные неидентифицированные компоненты. Мы обнаружили, что антибактериальная активность была увеличена в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом. Таким образом, ЖБАЛ является хорошим материалом для идентификации компонентов с антибактериальной активностью. Интересно, что это увеличение может объяснять обычное клиническое наблюдение снижения частоты инфекций респираторного тракта у Скандинавских пациентов с активным саркоидозом. Ранее, мы изолировали LL-37 в гранулоцитах, стимулируемых форболмиристатацетатом (11). Кроме того, мы показали индукцию гена LL-37 в кератиноцитах при воспалении кожи (4). В клетках ЖБАЛ, мы обнаружили экспрессию mRNA LL-37 у пациентов с саркоидозом и у здоровых индивидуумов. LL-37 был идентифицирован в HPLC фракции с помощью Вестерн-блоттинга. Кроме того, мы обнаружили LL-37 у AM и бронхиальных эпителиоцитов иммуногистохимическими методами. AM, как известно, производят цитокины и другие воспалительные сущности а также синтезируют антибактериальный пептид LL-37.

Мы отметили различия между пациентами с саркоидозом как по антибактериальному профилю, так и по антибактериальной активности. Самая высокая антибактериальная активность была обнаружена в ЖБАЛ пациента с инфильтрацией гранулоцитами, которые, как известно, производят несколько антибактериальных пептидов. Интересно, что один пациент с явно меньшей антибактериальной активностью получал кортикостероиды до выполнения БАЛ. Глюкокортикоиды имеют противовоспалительное действие, которые частично проявляется их супрессивным эффектом на ядерный фактор NF-kappaB (28). Наши данные предполагают, что глюкокортикоиды уменьшают синтез нескольких антибактериальных компонентов.

Увеличенная антибактериальная активность при саркоидозе зависит от нескольких антибактериальных компонентов. Фактически, антибактериальные пептиды синтезируются как препроформы и сохраняются как инактивные пропептиды (29).

Интересно, что один из антибактериальных компонентов был идентифицирован как ALP. ALP - мощный ингибитор эластазы и имеет антибактериальные, противогрибковые и антивирусные свойства (30). Клеточная локализация ALP и LL-37 совпадает (то есть, трахеальные и бронхиолярные эпителиоциты).

Наши результаты указывают, что легкое содержит несколько антибактериальных факторов, что указывает на многокомпонентный характер системы иммунной защиты. Рассмотрение антибактериальных компонентов, вероятно, клинически уместно при различных болезнях легкого.