Chest. 2003;123:413-417.
Поиск CWDF в крови не показал различий между пациентами с саркоидозом и группой контроля
Sheldon T. Brown, MD; Ian Brett, BS; Peter L. Almenoff, MD, FCCP; Marvin Lesser, MD; Michael Terrin, MD, MPH, FCCP and Alvin S. Teirstein, MD, FCCP;
Реферат
Цель исследования: определить, можно ли вырастить микобактерии без клеточной стенки (CWDF) в культуре крови пациентов с саркоидозом. Дизайн: специальное мультицентровое исследование саркоидоза ACCESS. Пациенты и группа контроля: пациенты и группа контроля были привлечены в исследование из 10 медицинских центров в Соединенных Штатах. Группа контроля соответствовала по полу, расе и возрасту (в пределах 5 лет) группе пациентов с саркоидозом. Результаты: исследовано 347 экземпляров крови (197 случаев случаев саркоидоза, 150 группа контроля). Два исследователя были обучены распознавать CWDF микобактерии в исследуемом материале после культивирования в течение 3 недель. Структуры, которые возможно являлись CWDF, были замечены с равной частотой в случаях саркоидоза (38 %) и группе контроля (41 %). 39 % случаев саркоидоза и 37 % группы контроля были отрицательны для CWDF. Заключение: исследование не подтверждает предыдущие сообщения, что CWDF можно вырастить из крови пациентов с саркоидозом, но не в группе контроля.
Введение
Ряд результатов предположил микобактерии без клеточной стенки (CWDFs) как причинный фактор в этиологии саркоидоза. С помощью световой микроскопии, в ткани лимфатического узла пациентов с саркоидозом, исследователи обнаружили кислотостойкие организмы и вариабельные кислотостойкие веретенообразные или дрожже-подобные структуры, названые плеоморфными хромогенами (chromogens) (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7). Moscovic (7) предложил, что плеоморфные хромогены являются CWDFs (L-формами) микобактериальных организмов. В последующих исследованиях, Ang и Moscovic (8), используя антимикобактериальные поликлональные и моноклональные антитела заключили, что многослойные инклюзии в многоядерных гигантских клетках (тела Шауманна) имеют микобактериальное происхождение и что плеоморфные хромогены являются CWDFs, которые экспрессируют специфическую реактивность Mycobacterium tuberculosis (9). Cantwell (10, 11) также считает, что кислотостойкие организмы, найденные в коже, лимфатических узлах и ткани легкого пациентов с саркоидозом, являются микобактериальными CWDFs.
Judge и Mattman (12, 13, 14) вырастили организмы из крови приблизительно 80 пациентов с саркоидозом. Они заключили, что эти структуры были микобактериальными CWDFs на основании переменного размера, преобладании коккоподобных форм, больших L-форм и палочковидных кислотостойких форм. В следующем исследовании, организмы были охарактеризованы с помощью моноклональных антител с аффинностью к M. tuberculosis (15), рост организмов из крови 19 из 20 пациентов с саркоидозом и 0 из 20 индивидуумов группы контроля был идентифицирован микроскопическим обнаружением микроколоний CWDFs после окрашивания материала по Kinyoun. Все изолированные организмы положительно реагировали с моноклональными антителами, предполагая, что эти организмы были микобактериями или их близкой разновидностью. Два исследователя, оценивавших реактивность к антителам в этом исследовании, производили оценку вслепую, но метод ослепления, метод рандомизации и степень разногласия между исследователями не были описаны.
Наше исследование было выполнено как часть исследования ACCESS. Цель ACCESS состояла в том, чтобы идентифицировать причину саркоидоза посредством строгих мультицентровых, проспективных, эпидемиологических и специальных лабораторных исследований. В ACCESS было зарегистрировано 736 пациентов с недавно диагностированным саркоидозом и 706 индивидуумов в группе контроля (706 согласованных пар) между ноябрем 1996 г. и июнем 1999 г. Эпидемиологическая, иммунологическая и генетическая информация пациентов с саркоидозом была сравнена с данными группы контроля, согласованной по возрасту, полу и расе. Это сообщение описывает специальное лабораторное исследование, предназначенное, чтобы оценить связь микобактериальных CWDFs с саркоидозом. Цель исследования состояла в том, чтобы определить, можно ли идентифицировать CWDFs в культуре крови большого числа пациентов с недавно диагностированным саркоидозом по сравнено с группой контроля.
Материалы и методы
Выбор пациентов
Исследование ACCESS проводилось с 1995 по 2002 г. Диагноз саркоидоз был установлен при биопсии ткани (или при положительном результате теста Квейма-Зильцбаха у пациентов с узловатой эритемой) в пределах 6 месяцев после начала исследования. Пациенты с признаками гранулематозных болезней, иных чем саркоидоз, не включались в исследование. Группа контроля была подобрана при телефонном опросе по случайно выбранным номерам, с целью найти людей одной расы и пола с разницей в возрасте не более 5 лет с пациентами. Детали исследования ACCESS были описаны ранее.
Информированное согласие для участия в специальном лабораторном исследовании было получено у пациентов с саркоидозом и индивидуумов группы контроля. Первичный протокол исследования CWDF и все другие исследования ACCESS были рассмотрены и одобрены наблюдательными советами каждого из центров, участвующих в исследовании.
Обучение персонала
Исследования CWDFs ранее были выполнены в лаборатории доктора Dr. L. H. Mattman в Wayne State University. Перед началом ACCESS, два исследователя и ассистент посетили лабораторию доктора L. H. Mattman. Было рассмотрено большое число слайдов, подготовленных доктором Mattman, чтобы ознакомить исследователей с морфологическими характеристиками окрашенных CWDF. Неокрашенные слайды известных случаев саркоидоза и группы контроля были подготовлены согласно протокола и доктор Mattman проверила интерпретацию результатов наших исследователей. Под ее руководством одновременно были культивированы несколько образцов, полученных от нескольких случаев известного саркоидоза и группы контроля. Затем были подготовлены слайды этих культур и их интерпретация снова была проверена доктором Mattman. Исследователи сохранили окрашенные препараты, полученные в процессе обучения, чтобы использовать их как сравнительный стандарт. Неокрашенные слайды также были сохранены, для использования в качестве внутреннего контроля в будущих исследованиях.
Результаты
353 пробы крови пациентов с саркоидозом и группы контроля были оценены в научно-исследовательской лаборатории на присутствие или отсутствие CWDFs. 6 проб были исключены из-за очевидного наличия контаминантов. Затем два независимых исследователя произвели оценку 347 культур, 197 случаев саркоидоза и 150 в группе контроля. Оба исследователя согласились, что культуры 38 % пациентов с саркоидозом показали окрашенные структуры, которые походили на CWDFs и были классифицированы как положительные. В группе контроля положительным был 41 % культур. Оба исследователя определили, что 39 % проб крови пациентов с саркоидозом и 37 % группы контроля были отрицательны. Исследователи не согласились в интерпретации слайдов 23 % пациентов и 22 % группы контроля (то есть, один исследователь дал положительный результат, другой отрицательный). Полное согласие между двумя исследователями было 77 % (доверительный интервал 95 %, от 72 до 81 %). Kappa 0.54 (доверительный интервал 95 %, от 0.45 до 0.63) был совместим с умеренной степенью совпадения между исследователями.
Обсуждение
Исследователи не обнаружили различий в частоте обнаружения микобактериальных CWDFs в пробах крови пациентов с недавно диагностированным саркоидозом по сравнению группой контроля при использовании методов культивирования, благоприятных для роста CWDFs, как было показано в ранних исследованиях. Результаты контрастируют с данными предыдущего исследования, опубликованного в 1996 г. (15), что CWDF были успешно культивированы из крови 19 из 20 пациентов с саркоидозом, но не из крови 20 индивидуумов группы контроля. Результаты также контрастируют с данными других исследований, демонстрирововших присутствие CWDFS в крови большего числа пациентов с саркоидозом, но не в крови группы контроля (12, 13, 14). Одно из возможных объяснений отрицательного результата - то, что текущее исследование было выполнено в различных лабораториях различными исследователями, даже при том, что два исследователя были обучены методам культивирования и интерпретации результатов одним из авторов более ранних исследований. Кроме того, несколько наших слайдов, в которых было интерпретировано наличие CWDFs, были рассмотрены доктором Mattman и она согласилась с нашей интерпретацией. Тем не менее, возможно, что неизвестные различия в методах культивирования или интерпретации, влияли на обнаружение микроколоний CWDFS в нашем исследовании. За исключением одного сообщения из России (20), все сообщения об изоляции CWDFs из крови пациентов с саркоидозом, были получены в лаборатории доктора Mattman. Кажется маловероятным, что наши отрицательные результаты могут быть приписаны факту, что пациенты, участвующие в нашем исследовании отличались по некоторому неизвестному признаку от предыдущих исследований, так как клинические критерии, используемые для определения случаев саркоидоза в ACCESS (16), были подобны критериям Almenoff (15). Отметим, что McLennan (неопубликованные данные; G. McLennan, MBBS, PhD; март 2001), используя ПЦР, в параллельном с ACCESS специальном лабораторном исследовании, не обнаружил признаков микобактериальной ДНК в культурах проб крови 5 пациентов с саркоидозом. Также, исследования в нашей лаборатории не смогли идентифицировать микобактериальную ДНК в культурах, интерпретируемых как CWDFs-положительные.
Мы не пытались искать микроколонии CWDFs в мазках с помощью антимикобактериальных моноклональных антител, используемых Almenoff (15). Мы не думаем, это объясняет наши отрицательные результаты, поскольку в исследовании Almenoff (15) микроколонии CWDF сначала были идентифицированы при исследовании окрашенных по Kinyoun препаратов. Эти препараты затем использовались, чтобы подтвердить эти предварительные результаты, используя моноклональные антитела. Идентификация CWDF опирается на их характерный микроскопический внешний вид и способность к окрашиванию, и предшествует их анализу другими методами. Тем не менее, были сделаны несколько попыток усилить ДНК, используя ПЦР и праймеры, специфические для M tuberculosis, M avium, Mycobacterium genus, Actinomycetales и Eubacterium (неопубликованные данные; март 1998). Были получены продукты амплификации, гомологичные к различным разновидностям, но ни одной доминирующей разновидности не было идентифицировано. Эти методы не были использованы для поиска CWDF в нашем исследовании из-за противоречивых результатов и потому, что другой специальный лабораторный проект исследования ACCESS был разработан, чтобы исследовать применение ПЦР для исследования крови пациентов (неопубликованные данные; G. McLennan, MBBS, PhD; март 2001). Наши исследователи не смогли обнаружить присутствие инфекционного агента, несмотря на прохождение обучения в той же самой лаборатории, которая ранее сообщила об успешном культивировании CWDF при саркоидозе. Окрашенные организмы, которые предположительно могли бы быть CWDFs, не быти идентифицированы и, возможно, были артефактами.
Мы не делали попыток культивировать микобактериальные CWDFs из ткани пациентов с саркоидозом, где, возможно, организмы могут существовать в течение длительного периода времени (13, 14). Graham (21) изолировал из материалов биопсии кожи нескольких пациентов с саркоидозом бактерии без клеточной стенки, которые позже ревертировали в кислотостойкие организмы. Организмы росли очень медленно. В другом исследовании, использующем ПЦР, эта группа исследователей наблюдала положительную амплификацию, используя праймеры, специфические для М. avium complex и/или М. avium subsp paratuberculosis в пяти из шести изолятах и двух свежих биопсих кожи (22). Амплификации или гибридизации с праймерами M tuberculosis или M avium subsp silvaticum probes не наблюдалось. Возможно, поиск роста микобактерий при саркоидозе должен быть сосредоточен на культурах гранулематозной ткани, скорее чем крови. Усилия по идентифицикации микобактериальных сигнатур в саркоидной ткани дали неокончательные даные (23).
Наше исследование не подтвердило предыдущие сообщения об обнаружении CWDFs исключительно в крови пациентов с активным саркоидозом. Результаты подвергают сомнению применимость широко распространеных методов для поиска роли бактерий в этиологии саркоидоза