American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine Vol 172. pp. 1299-1307, (2005)
Бактериальные эндотоксины увеличивают производство интерлейкина-18. Потенциальная роль колонизации грамм-отрицательными бактериями при саркоидозе
Deirdre M. Kelly, Catherine M. Greene, Gerard Meachery, Michael O'Mahony, Paula M. Gallagher, Clifford C. Taggart, Shane J. O'Neill and Noel G. McElvaney
Respiratory Research Division, Department of Medicine, Royal College of Surgeons in Ireland, Education and Research Centre, Beaumont Hospital, Dublin, Ireland
Реферат
Цель: саркоидоз - Th1 гранулематозная болезнь неизвестной этиологии. Ранее мы продемонстрировали роль интерлейкина-18 при саркоидозе. Мы исследовали регулирование производства интерлейкина-18 при этом состоянии. Методы: уровни цитокинов в ЖБАЛ были измерены с помощью ELISA. Мы исследовали активность промотора гена интерлейкина-18, мРНК и белковые уровни интерлейкина-18 в ЖБАЛ пациентов с активным саркоидозом и пациентов с разрешившимся саркоидозом в ответ на очищенный белковый дериват Mycobacterium tuberculosis, сульфат бериллия, сульфат циркония, сульфат алюминия и липополисахарид. Были оценены уровни эндотоксинов в ЖБАЛ индивидуумов с активным саркоидозом, индивидуумов с разрешившимся саркоидозом и группы контроля. Было выполнено генотипирование 94 пациентов с саркоидозом и 97 индивидуумов группы контроля для полиморфизма гена интерлейкина-18 -607A/C с помощью аллель-специфической ПЦР. Бактериальная ДНК в ЖБАЛ была идентифицирована с помощью ПЦР. Результаты: ЖБАЛ пациентов с активным саркоидом содержала увеличенные уровни интерлейкина-18, интерферона-гамма и интерлейкина-12 по сравнению с пациентами с разрешившимся саркоидозом а также содержала значительно более высокие уровни эндотоксинов. Уменьшение уровней эндотоксинов в ЖБАЛ уменьшило активность промотора гена интерлейкина-18 in vitro. Наблюдалась более высокая частота аллеля -607C и -607C/C у пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля; однако, это не было связано с функциональным ответом на эндотоксин. Наконец, бактериальная 16S рРНК Haemophilus influenzae и Moraxella catarrhalis была обнаружена в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом. Заключение: патогенез саркоидоза связан Th1 ответом. Наше исследование показало, что грамм-отрицательные бактерии могут вносить вклад в увеличени экспрессии интерлейкина-18.
Введение
Саркоидоз - мультисистемная болезнь неизвестной этиологии, характеризованная гранулематозным воспалительным процессом (1, 2). Предполагается, что в основе патогенеза болезни лежит воздействие специфических стимулов окружающей среды на наследственно восприимчивых индивидуумов. Предполагаемые стимулы окружающей среды включают инфекционные и неинфекционные агенты. Многочисленные сообщения о семейной группировке болезни, указывают, что генетическая предрасположенность играет важную роль (3). Присутствие неказеозных гранулем - особенность саркоидоза и 90 % пациентов имеет легочные симптомы (4, 5). Первичное проявление этой болезни - накопление мононуклеарных воспалительных клеток, главным образом активизированых CD4+ лимфоцитов Т-хелпер (Th1 клетки), которые производят интерлейкин-2 и интерферон гамма (6-9).
IL-18 играет важную роль при Th1 ответе, вместе IL-12 увеличивая производство IFN- gamma (10, 11). IL-18 производится в основном моноцитами/макрофагами (12), но также экспрессирован у дендритных клеток, купферовских клеток, кератиноцитов, синовиальных фибробластов, эпителиальных клеток и остеобластов (13). Увеличенные уровни IL-18 и его рецепторов присутствовуют в легких пациентов с саркоидозом (14-17). Также это важный фактор в регулировании экспрессии IL-2 легочными CD4+ T-лимфоцитами посредством AP-1 и ядерного фактора NFkappaB (17).
Мутации в регулирующих регионах генов цитокинов были связаны с восприимчивостью к большому числу сложных болезней. Одна такая мутация найдена в 5 ' нетраслируемом регионе (UTR) промотора гена IL-18 (18). Предполагалось, что полиморфизм единственного нуклеотида (SNP) -607C/A расположен на участке сцепления cAMP-реактивного элемента связывающего белка (CREB) (19). Замена цитозина (C) на аденин (A) в этой позиции разрушает участок сцепления с CREB. Предыдущие исследования показали, что этот SNP связан с диабетом, некротическим энтероколитом, ревматоидным артритом, развитием сепсиса а также с саркоидозом (20-24).
Чтобы уточнить роль IL-18 при саркоидозе, мы исследовали влияние различных стимулов и генетических факторов на экспрессию IL-18. Мы обнаружили, что инкубация моноцитов ЖБАЛ пациентов с активным саркоидозом, значительно увеличила уровни IL-18, принимая во внимание, что инкубация моноцитов ЖБАЛ пациентов с разрешившимся саркоидозом, не увеличивала. Мы измерили уровни IL-18, IL-12 и IFN-gamma у пациентов с активным саркоидозом, пациентов с разрешившимся саркоидозом и в группе контроля и обнаружили увеличенные уровни цитокинов у пациентов с активным саркоидозом. Наиболее поразительные результаты были получены при анализе эндотоксинов в ЖБАЛ; было обнаружено, что ЖБАЛ пациентов с активным саркоидозом содержит значительно более высокие уровни эндотоксинов, чем ЖБАЛ пациентов с разрешившимся саркоидозом и группы контроля. Дополнение полимиксина B в ЖБАЛ аннулировало активность IL-18. Чтобы объяснять этот эффект, мы попытались обнаружить присутствие бактериальной ДНК грамм-отрицательных бактерий в ЖБАЛ и идентифицировали присутствие ДНК бактерий Haemophilus influenzae и Moraxella catarrhalis. Эти наблюдения предполагают потенциальную роль экспрессии IL-18, управляемой грамм-отрицательными бактериями при саркоидозе и позволяют точнее охарактеризовать Th1 ответ при этой болезни. О некоторых аналогичных исследованиях сообщалось ранее (25, 26).
Группа исследования
Информированное согласие на исследование ЖБАЛ, используя протокол (27), одобренный комитетом по этике Beaumont Hospital (Дублин, Ирландия), было получено у 11 пациентов с доказанным биопсией стадией I (54.5 %) и стадией II (45.5 %) саркоидоза, 6 пациентов с разрешившимся саркоидозом и 11 некурящих индивидуумов в группе контроля. Пациенты с разрешившимся саркоидозом имели клинические и радиологические данные, совместимые со стабильной болезнью, которая разрешилась спонтанно или после лечения преднизолоном и имели среднюю продолжительность болезни 17.6±3.1 месяца или меньше и минимум 3 месяца без лечения кортикостероидами. Пациенты с активным саркоидзом имели среднюю продолжительность активной болезни 27.8 ± 4.6 месяцев или больше.
Генотипирование для поиска полиморфизма -607A/C было проведено у 94 пациентов с саркоидозом (стадия 0, I, II или III) и 97 здоровых индивидуумов группы контроля (отношение мужчины : женщины 61:33 и 42:55, соответственно; средний возраст 39±3.6 и 75±4.0 лет, соответственно).
Уровни IL-18 также были оценены в ЖБАЛ 9 пациентов с хронической обструктивной болезнью легкого (4 мужчины и 5 женщин; FEV1 50±6 %).
Результаты
Уровни цитокинов в ЖБАЛ пациентов с активным саркоидозом и пациентов с разрешившимся саркоидозом
Ранее мы сообщили об увеличенных уровнях IFN-gamma, IL-12 и IL-18 у пациентов с активным саркоидозом по сравнению с пациентами с разрешившимся саркоидозом. Чтобы определить, является ли это особенностью гранулематозного процесса или особенностью индивидуумов с саркоидозом, мы измерили уровни цитокинов в ЖБАЛ у пациентов с активным саркоидозом и пациентов с разрешившимся саркоидозом. Уровни IFN- gamma, IL-12 и IL-18 были значительно ниже (p < 0.05) у пациентов с разрешившимся саркоидозом по сравнению с пациентами с активным саркоидозом. Также мы оценили уровни IL-18 в ЖБАЛ 9 индивидуумов с хронической обструктивной болезнью легкого (ХОБЛ), состоянием, связанным с грамм-отрицательной инфекцией. Уровни IL-18 в ЖБАЛ у пациентов с ХОБЛ были подобны уровням у пациентов с активным саркоидозом (1,001±267 и 1,262±363 pM, соответственно).
Влияние клеток ЖБАЛ пациентов с активным саркоидозом и пациентов с разрешившимся саркоидозом на уровни IL-18, производимые THP-1 клетками
Чтобы определить, может ли активность HIL-18 5 '-UTR региона промотора быть непосредственно активизирована саркоидной ЖБАЛ, THP-1 клетки были кратковременно культивированы с комплексом PGL3-5 '-UTR-люцифераза. По сравнению с нестимулироваными клетками, активность люциферазы была втрое выше после возбуждения ЖБАЛ пациентов с активным саркоидозом. Когда стимуляция производилась ЖБАЛ пациентов с разрешившимся саркоидозом, индукции активности HIL-18 5 '-UTR не наблюдалось. Полуколичественная RT-ПЦР и ELISA использовались, чтобы количество определить влияние ЖБАЛ на экспрессию гена IL-18 и белковой экспрессии IL-18 у THP-1 клеток. ЖБАЛ пациентов с активным саркоидозом значительно увеличивала экспрессию гена IL-18. Подобный эффект был отмечен относительно белковой экспрессии IL-18 (27.4±0.29, 302.7±35.07 и 133.7±27.3 pg IL-18 в мл группы контроля, пациентов с активным саркоидозом и пациентов с разрешившимся саркоидозом, соответственно).
Влияние очищенного белкового деривата Mycobacterium tuberculosis, сульфата бериллия, сульфата алюминия, сульфата циркония и LPS на активность IL-18
Учитывая, что формирование гранулем также происходит при туберкулезе и хронической бериллиевой болезни, мы исследовали эффект PPD Mycobacterium tuberculosis и BeSO4 на экспрессию IL-18. THP-1 клетки были кратковременно культивированы с HIL-18 5 '-UTR-люциферазой и стимулированы PPD (5 TU), BeSO4 (100 µM) или LPS (10 µg) в течение 24 часов. И BeSO4 и LPS значительно увеличили активность промотора а также индуцировали белковую экспрессию и экспрессию гена IL-18 у THP-1 клеток. Влияние BeSO4 не ингибировалось полимиксином B. Стимуляция PPD не увеличивала активность промотора. Однако, PPD стимулировал экспрессию мРНК IL-18 и белковую экспрессию у THP-1 клеток. Al2(SO4)3 (25-100 µM) и Zr(SO4)3 (25-100 µM) также увеличивали производство IL-18 THP-1 клетками, причем Al2(SO4)3 имел значительно более мощный эффект.
Измерение уровней эндотоксинов в ЖБАЛ
Учитывая мощный эффект LPS на активность промотора гена IL-18 и белковую экспрессию, мы количество определили уровни эндотоксинов в ЖБАЛ пациентов с активным саркоидозом, пациентов с разрешившимся саркоидозом и в группе контроля. ЖБАЛ пациентов с активным саркоидозом содержала самые высокие уровни эндотоксиноа (26.0±3.7 ЕС) по сравнению с ЖБАЛ пациентов с разрешившимся саркоидозом (7.7±4.3 ЕС) и группой контроля (13.5±3.0 ЕС). Физиологический уровень эндотоксинов в ЖБАЛ пациентов с активным саркоидозом был эквивалентен 52±6 ng LPS в мл. Полимиксин B, который связывает и нейтрализует LPS, значительно уменьшил (p < 0.001) влияние активность промотора in vitro. В качестве контрольного эксперимента, мы определили влияние полимиксина B на экспрессию IL-18, индуцированную не LPS. Полимиксин B не имел никакого подавляющего эффекта на производство IL-18, индуцированное BeSO4 (53±2.3 и 51±0.6 pg IL-18 в мл для BeSO4 и BeSO4 + полимиксин B, соответственно).
Генетический анализ полиморфизма HIL-18 5 '-UTR -607C/A
Предполагается, что полиморфизм HIL-18 5 '-UTR -607C/A разрушает участок сцепления CREB. Шведское исследование показало, что пациенты с рассеянным склерозом и гомозиготные для цитозина в позиции -607, имели более высокие уровни мРНК IL-18 по сравнению с пациентами, гомозиготными для аденина (18). Генотип и частоты -607C/A SNP были исследованы в гомогенной Ирландской популяции у 94 пациентов с саркоидозом и 97 индивидуумов в группе контроля. Частоты генотипов соответствовали закону Харди-Вайнберга. Из 94 пациентов с саркоидозом, 51 были гомозиготными для аллеля C (54.3 %), 5 пациентов были гомозиготными для аллеля А (5.3 %) и 38 пациентов была гетерозиготными (40.4 %). Частота аллеля C была значительно увеличена у пациентов с саркоидозом (p = 0.029; OR 1.96; доверительный интервал 95 %, 1.258-3.052) по сравнению с группой контроля. Статистически существенное увеличение наблюдалось для -607C/C в группе пациентов с саркоидозом (p = 0.0265; chi2, df = 7.259, 2). Генотип -607A/A был редким в этой популяции, так как только 5 пациентов (5.3 %) с саркоидозом и 13 индивидуумов группы контроля (13.4 %) были гомозиготными для аллеля А.
Влияние HIL-18 5 '-UTR -607C/A SNP на активность промотора
Наши предыдущие эксперименты, исследующие активность промотора, использовали плазмиду, которая несла аденин в позиции -607. Учитывая, что аллель -607C был преобладающим в группе пациентов с саркоидозом, было важно определить, имеет ли -607C/A SNP функциональный эффект на активность IL-18. THP-1 клетки были кратковременно культивированы с комплексом pGL3 5 '-UTR-люцифераза, которая несла аллель А или C в позиции -607. После возбуждения физиологическими уровнями LPS (50 и 100 ng), активность промотора была значительно увеличена (p < 0.001), причем активность была подобной при возбуждении 10 µg LPS. Не имелось существенных различий между возбуждением 50 ng LPS (-607A аллель, 1.8±0.06 LU /µg; -607C аллель, 2.25±0.02 LU /µg) или 100 ng LPS (-607A аллель, 2.8±0.21 LU /µg; -607C аллель, 2.75±0.17 LU /µg).
Поиск 16S рРНК с помощью ПЦР
Из-за значительно более высоких уровней эндотоксинов в саркоидной ЖБАЛ, мы стремились определить, какой разновидностью грамм-отрицательных бактерий эти эндотоксины были произведены. Для этого мы выполнили 16S рРНК-специфическую ПЦР, используя праймеры, которые усиливают регион 16S рРНК, который присутствует у всех бактерий. Мы обнаружили присутствие бактериальной ДНК в 26 образцах БАЛ (73 %) пациентов с активным саркоидозом. Чтобы определить разновидность грамм-отрицательных бактерий, использовалась разновидность-специфическая ПЦР. ДНК H. influenzae и M. catarrhalis были обнаружены в 69 и 54 % образцов саркоидной ЖБАЛ, соответственно. ДНК Pseudomonas, Chlamydia или Legionella не были обнаружены. ПЦР ЖБАЛ пациентов с разрешившимся саркоидозом не обнаружила бактериальной ДНК. Анализ ЖБАЛ группы контроля показал наличие бактериальной ДНК в 46.6 % образцов, однако, не было обнаружено любой из разновидностей, отмеченных выше.
Обсуждение
Наше исследование показало, что бактериальные эндотоксины могут играть важную роль в регулировании производства IL-18 при саркоидозе. ЖБАЛ пациентов с активным саркоидозом, но не ЖБАЛ пациентов с разрешившимся саркоидозом индуцировал активность промотора гена IL-18 и индуцировал мРНК IL-18 и белковое производство IL-18 THP-1 клетками. Инактивация LPS полимиксином B устраняла этот эффект. Измерение уровней эндотоксинов, показало более высокий уровень LPS в ЖБАЛ пациентов с саркоидозм. ПЦР позволила идентифицировать присутствие ДНК H. influenzae и M. catarrhalis в ЖБАЛ. Эти результаты указывают на потенциальную роль грамм-отрицательный бактерией в увеличении производства IL-18 при саркоидозе.
Саркоидоз впервые был описан в 1877 г. но причина этой болезни до сих пор остается неуловимой (36). Воздействие неорганических и органических агентов окружающей среды, таких как глинистая почва, пыльца сосны и минеральные соли, были выдвинуты как возможные антигены, участвующие в этиологии саркоидоза (1). Поскольку признак этой болезни - формирование гранулем, другие агенты, которые могут проявлять этот ответ, такие как микобактерии, алюминий и цирконий, также рассматривались (37-39). Интересно, что наше исследование показало, что соли алюминия и циркония могут усиливать производство IL-18 THP-1 клетками.
Роль инфекционных агентов при саркоидозе предполагалась, так как некоторые исследования показали увеличенный титр антител к Propionibacterium acnes и Chlamydia pneumoniae (40, 41). Propionibacterium acnes были изолированы из саркоидных повреждений и рРНК Propionibacterium acnes была обнаружена у всех 15 пациентов с саркоидозом в Японском исследовании (42, 43).
Данные, представленные в этом исследовании предполагают участие H. influenzae и M. catarrhalis в патогенезе саркоидоза. Все пациенты с активным саркоидозом имели бактериальную ДНК одной или обеих из этих бактерий. Эти грамм-отрицательные бактерии участвуют в развитии хронической обструктивной болезни легкого, пневмонии, синусита и хронического бронхита (44-47). Пациенты с саркоидозом, у которых не произошло разрешение болезни, спонтанное или при терапии, возможно, имели нарушение механизма бактериального клиренса и это могло быть связано со способностью этих индивидуумов произвести IL-18 ответ. Хотя LPS был также обнаружен в нормальной ЖБАЛ, уровни LPS были значительно ниже и имели иное происхождение, чем LPS в саркоидном ЖБАЛ. Кроме того, уровни LPS в ЖБАЛ группы контроля и у пациентов с разрешением болезни были более низкими, чем самая низкая доза LPS, способная стимулировать физиологический ответ у THP-1 клеток (50 ng/ml).
IL-18 способен стимулировать производство IFN-gamma Th1 клетками в синергизме с IL-12 (48). Наше и другие исследования показали, что уровни IL-18 увеличены в легких пациентов с саркоидозом. Также было показано, что IL-18 увеличивает экспрессию IL-2 и активизирует CD4+ T-лимфоциты (16, 17). Было показано, что IL-18 производится альвеолярными макрофагами и IL-18 был обнаружен в столбчатых эпителиальных клетках при биопси дыхательных путей пациентов с саркоидозом (16, 49).
Рецептор IL-18 - член IL-1 семейства toll-like рецепторов (TLR) и было показано, что TLRs участвуют в регулировании Th1 ответа (50). Сигнал TLR4 является критически важным для производства IL-18 макрофагами (51) и одно исследование показало, что TLR4-дефицитные мыши имели значительно более низкие уровни IL-18 по сравнению с мышами с дикого типа (52). Исследования также показали участие IL-18 в ответе хозяина на бактериальную инфекцию; IL-18-дефицитные мыши имели нарушенный врожденный иммунный ответ при пневмококковой пневмонии (53) и перитоните Escherichia coli (54). В нашем исследовании мы обнаружили присутствие ДНК грамм-отрицательных бактерий в ЖБАЛ пациентов с активным саркоидозом, однако, эта бактериальная ДНК не являлась фактором, ответственным за стимулирование экспрессии IL-18, так как обработка ЖБАЛ ДНК-азой не имела никакого эффекта на способность ЖБАЛ индуцировать производство IL-18. Уровни IL-18 в течение активной стадии легочного саркоидоза были увеличны по сравнению с пациентами с разрешившимся саркоидозом.
Саркоидоз патологически подобен хронической бериллиевой болезни. Некоторые исследователи даже употребляют термин ''саркоидоз известной этиологии'' чтобы описать хроническую бериллиевую болезнь. Хроническая бериллиевая болезнь характеризуется аллергией к солям бериллия и предыдущие исследования показали, что BeSO4 стимулирует производство фактора некроза опухоли альфа, IL-6 и IL-18 клетками ЖБАЛ (55, 56). В нашем исследовании, BeSO4 увеличивал экспрессию IL-18 THP-1 клетами in vitro. В другом исследовании было продемонстрировано, что производство IL-18 индуцируется в ответ на очищенный белковый дериват (PPD) Mycobacterium tuberculosis (57, 58). Мы показали, что, хотя PPD стимулирует белковое производство IL-18 и мРНК IL-18, он не действует на 5 '-UTR промотор. Наше исследование также показало, что и PPD и BeSO4 стимулируют мРНК IL-18 и белковое производство IL-18. Интересно, что каталаза-пероксидаза, но не PPD Mycobacterium tuberculosis, была идентифицирована как тканевый антиген, связанный с саркоидозом и она была целью адаптивного иммунного ответа, ведущего к гранулематозному воспалению при саркоидозе (59). Однако, пациенты в этом исследовании не имели предыдущего воздействия бериллия и культуральные исследования ЖБАЛ не показали наличия Mycobacterium tuberculosis.
Кроме факторов окружающей среды, имеются свидетельства, что генетические факторы вносят вклад в патогенез саркоидоза (1). Многие исследования показали, что гены человеческого лейкоцитарного антигена играют важную роль при саркоидозе (60). В исследовании ACCESS аллель DRB1*1101 был связан с саркоидозом в группе, состоявшей из чернокожих и белых пациентов (61). Рассматривается роль генов АПФ, фактора некроза опухоли альфа, CCR2 и VDR (62). Предполагается, что SNP -607C/A промотора гена IL-18 расположен на участке сцепления CREB (18). Пациенты с рассеянным склерозом и генотипом -607C/C имеют более высокие уровни IL-18 по сравнению с пациентами с другими генотипами (18). В группе Ирландских пациентов, генотип -607C/C и аллель -607C были наиболее частыми; однако, функциональный анализ не показал никакой дифференциальной активности между аллельными вариантами -607A и -607C в ответ на LPS. В Японской группе пациентов с саркоидозом, были преобладающими генотип -607A/C и аллель -607C (24). Эти данные говорят, что аллель -607C может быть генетическим фактором риска саркоидоза или может находиться в неравновесном сцеплении с функциональной мутацией в другом регионе.
Мы продемонстрировали, что грамм-отрицательные бактерии могут участвовать в начальном воспалительном ответе при саркоидозе. Это открывает новые возможности для разъяснения патогенеза этого состояния и разработки новых терапий.