Emerg Infect Dis 8(11), 2002

Молекулярный анализ саркоидных тканей на наличие микобактериальной ДНК

Wonder Puryear Drake, Zhiheng Pei, David T. Pride, Robert D. Collins, Timothy L. Cover, Martin J. Blaser
Vanderbilt University School of Medicine and Veterans Affairs Medical Center, Nashville, Tennessee, USA; and New York University School of Medicine and Veterans Affairs Medical Center, New York, New York, USA

Реферат

Мы выполнили с помощью полимеразный цепной реакции поиск микобактериальных 16S rRNA, rpoB и IS6110 последовательностей в 25 гистологических препаратах пациентов с саркоидозом и 25 гистологических препаратах группы контроля. 16S rRNA последовательность была усилена в 12 (48 %) случаях, rpoB последовательность в 6 (24 %) случаях саркоидоза. Всего, 16S rRNA или rpoB последовательности были обнаружены в 15 случаях саркоидоза (60 %) но не были обнаружены в группе контроля (p=0.00002). В 3 случаях, последовательности были иными, чем M. tuberculosis. Все гистологические препараты с последовательностями, совместимыми с M. tuberculosis, были негативны для IS6110. Мы получили доказательства, что один из микобактериальных организмов, имеющий сходство с M. tuberculosis, был обнаружен у большинства пациентов с саркоидозом.

Введение

Саркоидоз - мультисистемная воспалительная болезнь, которая главным образом воздействует на лимфатические узлы и ткань легких и характеризуется формированием неказеозных гранулем в вовлеченных органах [1]. Хотя причина саркоидоза остается неизвестной, несколько микроорганизмов были предположены как возможные этиологические агенты, включая бактерии (Borrelia burgdorferi, Proprionibacterium acnes и Mycobacterium species) и вирусы (человеческий герпесвирус 8, вирус Эпштейна-Барра, вирус цитомегалии и коксакивирус B) [2]. Металлы (бериллий и цирконий), минералы (тальк и глина) и органические вещества (пыльца сосны) также были предложены как этиологические агенты [2]. Усилия по идентифицикаци инфекционного агента при саркоидозе, используя методы гистологического окрашивания и обычные культуральные исследования были неудачны. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для поиска ДНК служит альтернативным методом идентификации возбудителей инфекции. Метод ПЦР использовался чтобы идентифицировать этиологический агент бактериального ангиоматоза (Bartonella henselae) [3] и болезни Уиппла (Tropheryma whippelii) [4]. Из-за реального патологического [5], иммунологического [6], эпидемиологического [7] и клинического подобия [8,9] между саркоидозом и инфекциями, вызванными микобактериальными организмами (особенно туберкулезом), мы проанализировали гистологические препараты пациентов с саркоидозом на наличие микобактериальных генов. Результаты предыдущих исследований были неокончательными; некоторые исследователи были неспособны продемонстрировать микобактериальную ДНК в саркоидных тканях [10,11], принимая во внимание, что другие исследователи обнаружили микобактериальную ДНК [12,13]. Мы исследовали зафиксированные в парафине легочные, гистологические препараты средостенных и цервикальных лимфатических узлов на наличие 16S rRNA, rpoB и IS6110 последовательностей.

Материалы и методы

Для этого исследования мы выбрали зафиксированные в парафине гистологические препараты средостенных или цервикальных лимфатических узлов, полученные в период с 1991 г. до 2001 г. В исследование были включены препараты 44 пациентов с саркоидозом и 57 индивидуумов группы контроля. Для включения в исследование пациентов с саркоидозом использовались следующие критерии: 1) клинические особенности были должны быть совместимы с саркоидозом (то есть, острая респираторная болезнь, сопровождаемая узловатой эритемой, внутригрудной лимфаденопатией и артритом или индолентная прогрессирующая легочная декомпенсация, связанная с внутригрудной лимфаденопатией, ретикулонодулярными инфильтратами или легочным фиброзом); 2) гистопатологические особенности были должны были быть совместимыми с саркоидозом (то есть, материалы биопсии каждого пациента были должны иметь неказеозные гранулемы, хорошо сформированные в пределах окружающей ткани с периферическими лимфоцитарными инфильтратами [5]); 3) известные микробные причины образования гранулем были должны быть исключены (материалы биопсии должны быть отрицательны для микроорганизмов при окрашивании гематоксилином и эозином и для грибковых и кислотостойких организмов при окрашивании аурамином-O. В каждом случае, результаты были рассмотрены двумя независимыми патологами.

Препараты лимфатического узла группы контроля были отобраны у пациентов, у которые была проведена медиастиноскопия или биопсия лимфатического узла в течение того же самого периода. В каждом случае был установлен категорический диагноз, иной чем саркоидоз. Группа контроля была отобрана из пациентов, у кого заключительным диагнозом был микоз, лимфома и первичные или метастатические злокачественные болезни легкого.

Из 25 пациентов с саркоидозом, 12 % были белыми, 88 % афро-американцами; 36 % были мужчинами, 64 % имели возраст < 50 лет. Группа контроля состояла из 20 % белых и 80 % афро-американцев; 68 % были мужчинами. Большинство (76 %) пациентов группы контроля имело возраст > 50 лет. У них была проведена медиастиноскопия, чтобы получить тканевое подтверждение вероятной злокачественной болезни. Группа контроля состояла из пациентов с раком легкого (72 %), хроническими микозами (16 %) или лимфомой (12 %). Средостенные лимфатические узлы были источником исследуемого материала у 88 % и 84 % пациентов с саркоидозом и в группе контроля, соответственно. Остальной материал был получен при биопсий легкого или цервикальных лимфатических узлов. Гранулемы были обнаружены во всех гистологических препаратах пациентов с саркоидозом и 7 из 25 препаратов группы контроля.

Обсуждение

Для этого исследования мы выбрали пациентов, чья болезнь была совместима с саркоидозом или у кого был установлен альтернативный диагноз. Исследование многих случаев, в конечном счете диагностированных как саркоидоз, показало атипичные результаты. Если наши наблюдения будут подтверждены, такие данные будут важны для будущих исследований.

Мы обнаружили микобактериальную ДНК в гранулемах 24 % образцах саркоидной ткани при оценке для rpoB, в 48 % при оценке для 16S rRNA в той же группе; 60 % были позитивны для обоих, rpoB и 16S rRNA. Мы подтверждаем ограничения изучения ткани и возможности загрязнения исследуемого материала, однако, ткани группы контроля не показали положительных результатов, делая загрязнение менее вероятным. Ранее проведенные исследования идентифицировали распространенность присутствия микобактериальной ДНК в гистологических препаратах в 30%-50 % [12,13,20]. Вместо единственного организма, мы обнаружили признаки гетерогенной популяции микобактериальных организмов в изучемых гистологических препаратах. Хотя мы обнаружили организмы, походящие на M. tuberculosis, M. gordonae и M. kansasii, другие исследования также идентифицировали последовательности M. avium [12,13].

Мы также обнаружили ДНК новых микобактерий у одного пациента. Хотя большинство ДНК последовательностей были похожи на M. tuberculosis, последовательности, походящие на другие микобактериальные организмы также были идентифицированы. В нескольких предыдущих исследованиях, сообщалось о нетуберкулезных микобактериях [13]. Одна новая последовательность была близко связана с 16S rДНК M. tuberculosis, скорее чем с последовательностями других микобактериальных организмов меньшей вирулентности. Присутствие двух отдельных полиморфизмов в новой последовательности предполагает скорее наличие ''истинного'' полиморфизма, чем ошибку, введенную ПЦР. Кроме того, новая последовательность отсутствовала в воде, в не саркоидной ткани и группе контроля ДНК M. tuberculosis. Синонимичные замены в геноме M. tuberculosis относительно редки, хотя геномные вариации были обнаружены в генах, связанных с устойчивостью к антибиотикам [21]. Это говорит, что вариация M. tuberculosis или близко связанных микобактерий, может присутствовать в образцах саркоидной ткани.

Присутствие ДНК M. tuberculosis в 48 % образцов саркоидоза примечательно, поскольку клинические ассоциации между саркоидозом и туберкулезом хорошо известны. В некоторых случаях, у пациентов с диагностированным туберкулезом развивается саркоидоз, в то время как у них проводится противотуберкулезная терапия, или наоборот [22-24]. Микобактериальная ДНК в образцах саркоидной ткани может объяснять клиническую корреляцию между саркоидозом и туберкулезом. То, что у пациентов развивался саркоидоз, в то время как у них проводилась противотуберкулезная терапия говорит, что M. tuberculosis не является этиологическим агентом саркоидоза. Наши результаты согласуются с данными других исследований [12,13], но другие работы не обнаружили микобактериальную ДНК [10,11]. Возможное объяснение этого противоречия - то, саркоидоз представляет ответ хозяина на группу инфекционных агентов, среди которых микобактерии представляют самую большую подгруппу. Альтернативное объяснение: микобактериальные организмы присутствуют во многих повреждениях, но в чрезвычайно низких уровнях, ниже порога обнаружения. Такая гипотеза малого числа организмов, вызывающих интенсивный воспалительный ответ, аналогичный туберкулоидной лепре [25], могла бы объяснять, почему организмы могут быть обнаружены только с помощью ультрачувствительных методов.

Еще одно альтернативное объяснение является следствием нашего наблюдения эффекта деградации микобактериального сигнала в экстракте ДНК. Мы наблюдали, что микобактериальная ДНК может быть усилена в течение 6-8-месячного периода, если оригинальный экстракт сохраняется при - 20°C. После этого интервала времени, для обнаружения микобактериальной ДНК небходимы свежие экстракты ДНК. Первоначальные образцы, в которых микобактериальная ДНК больше не мог быть усилена, оставались положительными для человеческого бета-актина, что позволяет предположить, что ДНК эукариотов деградирует медленнее, чем ДНК прокариотов. Деградация происходит несмотря на уменьшение числа циклов замораживание/оттаивание извлеченной ДНК и сохранения ДНК при - 20°C. Наше наблюдение говорит, что изоляция микобактериальной ДНК происходит эффективнее при выполении ПЦР анализа на свежих экстрактах, что может объяснять, отрицательные результаты других исследований.

На основании этих наблюдений, мы исследовали присутствие ДНК M. tuberculosis в саркоидной гранулеме, проверяя присутствие IS6110. ПЦР анализ для IS6110 является полезным, так как IS6110 обычно присутствует в количестве 1-25 копий в мембране M. tuberculosis. M. bovis имеет только одну копию IS6110 [26]. Однако, мы не обнаружили присутствия IS6110 в саркоидных тканях или в контроле.

Существует несколько возможных объяснений присутствия микобактериальной 16S rRNA и rpoB и отсутствия IS6110 в саркоидных тканях. Первая причина - наш анализ наличия IS6110, возможно, был достаточно чувствителен, чтобы обнаружить малое число геномов M. tuberculosis в саркоидных тканях. Однако, в исследованиях с последовательным разведением, метод был достаточно чувствителен, чтобы обнаружить один бактериальный геном. Другие лаборатории, которые сообщили о способности метода обнаружить 1-2 копии бактериального генома, также не смогли обнаружить IS6110 в экстракте саркоидной ткани [11,27-29], что совместимо с нашими результатами.

Вторая возможность - то, M. tuberculosis присутствует, но штамм не содержат IS6110. Однако, о штаммах M. tuberculosis, которые обладают одной копией или вообще не содержат IS6110 не сообщалось [31,32]. В Соединенных Штатах были исследованы приблизительно 14,000 штаммов M. tuberculosis и все они обладают IS6110 [33]. Поэтому, этот сценарий кажется маловероятным.

Третье объяснение - то, что, агент, который мы считаем связан с саркоидозом, имеет близкое генетическое родство с M. tuberculosis, но не является M. tuberculosis. Другие члены семейства M. tuberculosis-complex (M. tuberculosis, M. bovis, M. microti и M. africanum) имеют 100 % 16S и rpoB гомологию с M. tuberculosis, но принадлежат различным разновидностям и обычно легко дифференцируются от M. tuberculosis по биохимическим и клиническим особенностям. Хотя мы не предпринимали попыток изоляции микроорганизмов в исследуемых материалах, будущие исследования должны быть направлены на идентификацию этих микобактерий и поиск любой связи с саркоидозом.

Мы обнаружили микобактериальные 16S rRNA и rpoB последовательности в гистологических саркоидных препаратах, но не в группе контроля. При секвенировании, результаты были наиболее совместимы с M. tuberculosis, но IS6110 не был обнаружен. Мы также обнаружили присутствие гетерогенной микобактериальной популяции, включая организмы, связанные с M. tuberculosis, M. gordonae и М. kansasii. Эти результаты говорят, что, в саркоидных тканях могут быть обнаружены различные микобактериальные агенты и что они могут играть важную роль в этиологии саркоидоза.