Thorax 1997;52(Suppl 3):S47–S51
Микобактерии и саркоидоз
O M Kon, R M du Bois
Royal Brompton Hospital, London, UK
Реферат
Кислотостойкие бактерии без клеточной стени (CWDF) были культивированы из крови, бронхоальвеолярного лаважа и жидкости передней камеры глаза пациентов с саркоидозом. Увеличение уровней моноклональных антител к Mycobacterium tuberculosis (H37RV) использовалось, чтобы охарактеризовать рост CWDF в крови пациентов с саркоидозом.
Методы: кровь 20 пациентов с активным саркоидозом и 20 индивидуумов группы контроля была проанализирована с помощью культуральных методов, используемых для роста CWDF. Изолированные микобактерии в дальнейшем были исследованы с помощью флуоресцентного анализа, используя моноклональные антитела, высоко реактивные к M. tuberculosis.
Результаты: CWDF были выращены из крови 19 из 20 пациентов с саркоидозом. CWDF окрашивались с моноклональными антителами и с помощью модивицированного окрашивания по Kinyoun. Никаких организмов из крови группы контроля культивирорвано не было.
Заключение: эти данные демонстрируют, что CWDF можно вырастать из крови почти всех пациентов с активным саркоидозом. Результаты подтверждают, что эти организмы имеют микобактериальное происхождение и подобны, если не идентичны, Mycobacterium tuberculosis. Их роль в патогенезе саркоидоза неизвестна.
Введение
Саркоидоз - мультисистемная гранулематозная болезнь неизвестной этиологии. Поскольку саркоидоз обычно воздействует на легкие и грудные лимфатические узлы, было предположено, что возможный этиологическй агент может попадать в организм ингаляционно.
Множество агентов было предложено как причина этой болезни, но никакого окончательного согласия относительно специфического антигена не существует.
Возможные агенты, участвующие в патогенезе саркоидоза
Микобактериальные инфекции
Вирусы
Неорганические антигены
Органические антигены
Эти агенты, как известно, способны стимулировать формирование гранулем и могут попадать в организм ингаляционно. Некоторые из них могут персистировать в ткани из-за их резистентности к действию внутриклеточных бактерицидных механизмов или из-за слабой деградации из-за особенностей их физических характеристик. Хотя наиболее обширные исследования были сосредоточены на инфекционной этиологии и, в частности, на микобактериальной инфекции, другие возможные антигены также были исследованы. Возможно, имеется более чем один причинный агент и также возможно, что другие факторы, например генетические, могут модулировать иммунную реакцию в патогенезе саркоидоза. Эта точка зрения поддержана более высокой инцидентностью саркоидоза у родных братьев/сестер по сравнению с частотой болезни во всей популяции (2).
Исследования MHC позволили предположить генетическую связь, но проведенные исследования дали противоречивые результаты, возможно из-за этнических различий исследуемых групп и различий используемых технологий (3-6).
Возможные неинфекционные агенты
Пыльца сосны рассматривалась как возможный этиологический агент из-за очевидной связи между заболеваемостью саркоидозом и распределением сосновых лесов на юго-востоке США. Пыльца сосны может стимулировать формирование неказеозных гранулем у морских свинок (7). Однако, дальнейшие эпидемиологические исследования не подтвердили эти начальные наблюдения (8). Воздействие глинистой почвы (9), талька (10) и вторичный оксалоз (11) также были предположены как возможные этиологические факторы. Бериллий (12) и цирконий (13) производят гранулемы, которые являются неразличимыми от саркоидных эпителиоидных гранулем у сенсибилизированных индивидуумов, но не производят положительные аллергические кожные реакции замедленного типа у пациентов с саркоидозом.
Инфекционный / передающийся агент
В поддержку возможности существования передающегося агента свидетельствует история легочного саркоидоза, развившегося у реципиента после трансплантации сердца от донора, у которого позже при аутопсии был обнаружен саркоидоз (14). Также известна история болезни, где саркоидоз, возможно, был передан донору при трансплантации костного мозга (15). Исследование на животных моделях позволило установить, что гомогенаты человеческой саркоидной ткани могут стимулировать характерные гранулематозные реакции (16, 17).
Немикобактериальные инфекционные агенты
Имеются отчеты, свидетельствующие о связи вирусных инфекций с саркоидозом (18-20). У пациентов с саркоидозом часто имеются высокие титры антител к различным вирусам, но эти результаты могут отражать гиперреактивность B-клеток и увеличение синтеза иммуноглобулинов (21). Также предлагалось, что микобактериальные и вирусные инфекции могут взаимодействовать и производить саркоидоз в результате индуцированного вирусом дефекта T-клеточного ответа на микобактериальную инфекцию. Uesaka (22) описал изоляцию 17 организмов в ткани 36 пациентов с саркоидозом и обнаружил что некоторых из них имеют Nocardia-подобные свойства. Известны несколько случаев астероидного нокаридоза в терминальной стадии саркоидоза (23). Кислотостойкие коккобациллярные (coccobacillary) бактерии были идентифицированы в ткани пациентов с саркоидозом. Коринебактерии могут производить клинический синдром, походящий на саркоидоз, с лимфаденитом, пневмонитом и повреждениями кожи (24, 25). Однако, исследования участия этих организмов в патогенезе саркоидоза проведены не были. Микоплазма-подобный организмам (MLO) - облигатная бактерия без клеточной стенки. Недавно эти организмы были обнаружены с помощью электронной микроскопии в лейкоцитов во внутриглазной жидкости и стекловидном теле пациентов с увеитом, вторичным к саркоидозу (26). Описано, что MLO могут стимулировать легочные синдромы, подобные саркоидозу (27). Введение MLO от пациентов с саркоидным увеитом в глаза мышей, может производить увеит и системные гранулематозные реакции (28). Ранее, MLO были идентифицированы в лейкоцитах и эндотелиальных клетках, смежных с гранулемами в материале трансбронхиальной биопсии пациентов с саркоидозом (28). Хотя эти агенты были предложены в качестве причины саркоидоза, большинство исследований сосредоточилось на микобактериях.
Микобактерии
Almenoff с коллегами (29) недавно охарактеризовали кислотостойкие формы без клеточной стенки, которые они вырастили из крови пациентов с активным саркоидозом и продемонстрировали, что они имеют микобактериальное происхождение, используя моноклональные антитела, высоко реактивные к M. tuberculosis. Эти результаты снова привлекли внимание к возможной связи между микобактериями и саркоидозом. То, что микобактериальная инфекция может играть важную роль в патогенезе саркоидоза, было известно достаточно давно. Например, Pinner в 1938 г. предложил называть саркоидоз ''неказеозным туберкулезом'' из-за гистологического подобия (30).
Обоснование микобактериального патогенеза
В зависимости от факторов хозяина, пациенты имеют клинически разнообразные ответы на микобактериальную инфекцию, от паттерна, замеченного у иммуннологически скомпрометированных пациентов, где имеется большое число организмов, до слабого иммунологического ответа у пациентов без признаков или симптомов болезни, которые были идентифицированы по характерным рентгенограммам, кожной реактивности и другим иммунологическим ненормальностям. Эта группа пациентов, возможно, имеет малое число жизнеспособных микобактерий, персистирующих в тканях и не обнаруживаемых обычными средствами. Предлагалось, что саркоидоз может быть клиническим проявленим микобактериальной инфекции в этой группе пациентов, которые имеют сильный гранулематозный ответ, связанный с эффективным уничтожением микобактерий (31). В результате эффективного уничтожения микобактерий, их обнаружение является трудным или даже невозможным. Известны случаи, когда туберкулез диагностируется на основании типичного рентгенографического и клинического представления, без бактериологического подтверждения, или когда в ткани обнаружены казеозные гранулемы (также описанные при саркоидозе) в отсутствии положительной бактериологии. Типичные случаи саркоидоза могут быть обнаружены после лечения туберкулеза, при обнаружении кислотостойких организмов в ранее негативных культурах, или бывшими положительными в единичных случаях (32, 33). Известны случаи туберкулеза предшествующего или следующего за саркоидозом и даже случаи сосуществования этих двух болезней (34-37).
Хотя пациенты с саркоидозом часто имеют отрицательные внутрикожные пробы с различными антигенами, вызывающими реакции гиперчувствительности замедленного типа, что может быть дискриминатором болезни, имеются пациенты с саркоидозом, отвечающие на туберкулин (34). Кроме того, имеются отчеты о бактериологически доказанном туберкулезе, нечувствительном к противотуберкулезной терапии, несмотря на хорошую чуствительность in vitro к противотуберкулезным препаратам. Пациенты впоследствии улучшились после использования кортикостероидов (34).
Было предположено несколько механизмов, с помощью которых микобактерии могут производить клинические и гистологические изменения, характерные для саркоидоза. После установления, что большое количество пациентов с туберкулезом и саркоидозом имели микобактериальную инфекцию, Mankiewicz (38) предположил, что пациенты, инфицированные туберкулезом обычно производят нейтрализующие антитела и что пациенты, неспособные производить эти антитела - то есть пациенты с саркоидозом - могут формировать неказеозные гранулемы. Хотя в дальнейшем были получены экспериментальные данные в поддержку этой гипотезы, другие исследователи не смогли придемонстрировать дефицит производства этих антител. Burnet (39) предложил, что микобактерии могут персистировать как внутриклеточный организм в мезенхимальных клетках, которые присутствуют в эпителиоидных клетках неказеозных гранулем. Hanngren развил концепцию взаимодействия вирусов и микобактерий, предполагая, что параллельная вирусная инфекция снижает функцию Т-клеток и поэтому изменяет иммунную реакцию по отношению к микобактериям (40).
Т-лимфоциты могут играть центральную роль в начальной иммунной реакции на предполагаемый антигенный стимул при саркоидозе. Т-лимфоциты способны к формированию характерных гранулематозных образований, замеченных при саркоидозе, путем производства различных медиаторов (41-43). Т-лимфоциты, несущие cd рецепторы также были обнаружены в периферической крови пациентов с саркоидозом (44). Эти Т-лимфоциты пролиферируют в присутствии микобактериальных антигенов и, в частности, демонстрируют экспансию Vd2+ субпопуляции 45 у пациентов с туберкулезом и саркоидозом и поэтому могут отражать необнаруженную инфекцию при саркоидозе.
Исследования на животных моделях
Инфекционная причина саркоидоза была поддержана экспериментами на животных моделях, где введение материала саркоидного лимфатического узла мышам приводило к формированию гранулем, когда биопсия проводилась через 6-8 месяцев. Кислотостойкие организмы также были обнаружены в материале биопсии (17). Тот же самый ответ и кислотостойкие организмы были обнаружены после введения гомогената или супернатанта гранулематозной ткани этих мышей другой группе мышей. Вводимые субстанции пропускали через фильтр (0.2 µm), поэтому возможно, что ''передающийся'' агент должен иметь размер вируса или протопласта и может быть инактивирован при облучении или автоклавировании. Микобактерии, имеющие характеристики Mycobacterium tuberculosis из некоторых из этих гомогенатов были выращены на среде Lowenstein-Jensen. Другие исследования подтвердили медленное развитие гранулем после введения саркоидных гомогенатов (46). Однако, некоторая неопределенность относительно этих экспериментов все еще остается, поскольку другие исследователи не смогли их воспроизвести (16).
Антимикобактериальные исследования
Множество исследователей сравнивало уровень антимикобактериальных антител у пациентов с саркоидозом, микобактериальной инфекцией и группой контроля (47, 48), но эти исследования дали противоречивые результаты (49, 50).
Молекулярные исследования
Было выполнено несколько исследований присутствия микобактериальной ДНК при саркоидозе. Обзор используемых методов был всесторонне описан в (31).
В исследовании Mitchell (51), была исследована РНК 5 здоровых индивидуумов и 5 пациентов с саркоидозом. При использовании последовательностей, специфических для РНК Mycobacterium tuberculosis, была обнаружена значительно более высокая экспрессия микобактериальных нуклеиновых кислот в ткани селезенки пациентов с саркоидозом чем в группе контроля. Bocart (52) использовал полимеразную цепную реакцию (ПЦР), чтобы обнаружить 65 kD микобактериальный антиген и обнаружил его в 3 из 14 случаев. Popper (53) также получил подобные результаты в группе пациентов саркоидоза.
Saboor (55) в исследовании 22 пациентов с саркоидозом, используя ПЦР, обнаружил экспрессию IS6110 (последовательность, специфическая для Mycobacterium tuberculosis) в БАЛ у половины пациентов, но также и продемонстрировал высокую норму ложноположительных результатов у здоровых индивидуумов группы контроля, что подразумевает возможность, что некоторые из положительных результатов могут быть следствием бактериального загрязнения материала. Также были получены доказательства присутствия нетуберкулезных микобактерий в 20 % случаев. Fidler с коллегами (56) исследовал ткани 16 пациентов с саркоидозом, 16 пациентов группы контроля (плоскоклеточный рак, болезнь Ходжкина) и 4 пациентов с туберкулезом и обнаружил ДНК Mycobacterium tuberculosis у 7 из 16 пациентов саркоидоза, но также и в одном случае в группе контроля.
Некоторые исследования не обнаружили присутствия M. tuberculosis в исследуемом материале. Ghossein с коллегами (57) не обнаружили ДНК Mycobacterium tuberculosis в тканях 10 пациентов с саркоидозом и 10 индивидуумов в группе контроля, хотя используемая методика была способна продемонстрировать ДНК M. tuberculosis у шести пациентов с туберкулезом. Точно так же Gerdes с коллегами (58) не обнаружили последовательности, специфической для Mycobacterium tuberculosis (16S rRNA) в 14 образцах, хотя вся группа контроля, состоящая из 6 пациентов с туберкулеза была положительна.
Almenoff с коллегами (29) культивировали кислотостотйкие организмы без клетотчной стенки (CWDF) или ''L-формы'' из крови пациентов с активным саркоидозом и охарактеризовали их как ''вероятно происходящие от Mycobacterium tuberculosis'', используя моноклональное антитела H37RV.
''L-форма'' является термином, которым обычно описывают сферопласты (атипичные морфологические формы, производные от классических бактерий, которые потеряли клеточную стенку) и имеют вид ''жареного яйца'' при росте на агаре (61). CWDF могут персистировать в течение продолжительного времени, возможно, вследствие потери мембранных рецепторов, необходимых для фагоцитоза. Не имеется никаких доказательств, что L-формы патогенны, но они могут медленно ревертировать назад, к материнской форме, и поэтому поддерживать болезнь на продромальном уровне (62). Дополнительный фактор, поддерживающий роль CWDF в саркоидозе - то, что их сложно обнаружить при обычных культуральных исследованиях. CWDF были описаны в ткани пациентов с саркоидозом (64-66) и наиболее вероятно, что они имеют микобактериальное происхождение. Кроме того, эти CWDF были культивированы из крови (67), кожи (60), БАЛ и жидкости передней камеры глаза пациентов с саркоидозом (68). Экспериментальные исследования введения CWDF, культивированных из крови пациентов с саркоидозом, морским свинкам, продемонстрировали образование гранулематозных повреждений в легком, печени, почках, селезенке и глазах (69).
В недавнем исследовании Alavi (70) эти CWDF, обнаруженные в тканях пациентов с саркоидозом, с помощью специфических антител были охарактеризованы как происходящие от Mycobacterium tuberculosis.
Almenoff с коллегами (29) исследовали 20 пациентов с клинически очевидным саркоидозом, чья мокрота была отрицательна для кислотостойких организмов. Все эти пациенты имели легочную болезнь, 3 пациента также имели вовлечение кожи, один генерализованную болезнь и один нейросаркоидоз. 7 пациентов получали системные кортикостероиды. 20 здоровых индивидуумов из группы контроля также были исследованы. Ни один их них не имел ВИЧ или туберкулез в медицинской истории. Кровь всех пациентов была исследована с использованием модифицированной окраски по Kinyoun. Бактерии без клеточной стенки были идентифицированы у 19 из 20 пациентов с саркоидозом и ни у одного в группе контроля.
Авторы охарактеризовали эти CWDF с помощью моноклональных антител к Mycobacterium tuberculosis. Предыдущие эксперименты показали, что эти антитела были относительно специфичны для H37RV, BCG и H37RA антигенов со слабым связыванием с атипичным микобактериями и отсутствием связывания с другими грамм-положительными или грамм-отрицательными бактериями. Авторы идентифицировали связывание H37RV с CWDF с помошью флюоресцентной микроскопии. Они подчеркивают, что дальнейший анализ DNA этих L-форм позволит охарактеризовать и дифференцировать другие атипичные микобактерии.
Факты против микобактериальной этиологии
Хотя имеются данные о присутствии микобактерий у пациентов с саркоидозом, этот факт не обязательно подразумевает причинную патогенетическую связь и поэтому эти результаты должны интерпретироваться с осторожностью. В настоящее время, некоторые исследования обнаружили микобактериальную ДНК в 50 % случаев саркоидоза, что подразумевает возможность существования некоторого другого неохарактеризованного агента. Однако, Almenoff с коллегами (29) культивировали микобактериальные L-формы у 19 из 20 пациентов. Возможные факторы, приводящие к различиям в этих исследованиях - отсутствие группы контроля и влияние кортикостероидов. Возможно, кортикостероиды способствуют быстрому росту микобактерий у этих пациентов и что обнаружение микобактерий или L-форм является эффектом ''свидетеля (bystander)''. Лечение саркоидоза кортикостероидами не приводит к усилению микобактериальной инфекции.
Кроме того, предыдущие работы, исследовавшие влияние противотуберкулезной терапии при саркоидозе не показали никакой эффективности, хотя роль микобактериальной инфекции может заключаться в инициировании ''сверхактивного'' иммунного процесса и может не требоваться для поддержания этого процесса. Не имеется никаких эпидемиологических данных об увеличении распространенности саркоидоза в регионах с увеличенной распространенностью туберкулеза (34, 71). Кроме того, БЦЖ вакцинация не уменьшает заболеваемость саркоидозом (72).
Заключение
Этиология саркоидоза все еще остается неизвестной. Однако, учитывая результаты недавних исследований, возможная роль микобактерий в патогенезе этой болезни нуждается в дальнейшей оценке.
Результаты Almenoff поддерживают участие микобактерий в патогенезе саркоидоза. Исследования, проведенные до настоящего времени, дали противоречивые результаты и необходимы более крупные исследования, использующие стандартизованные молекулярные методы. Точный механизм, посредством которого микобактериальные формы без клеточной стенки инициируют гранулематозный ответ у восприимчивых индивидуумов, также нуждается в объяснении. Эта гипотеза должна быть проверена на основании оценки генетической восприимчивости, понимании того, как CWDF инициируют T-клеточную иммунную реакцию (которая является краеугольным камнем саркоидоза) и анализ ДНК изолированного CWDF.