Thorax 2002;57:897-901

Апоптоз-резистентные лимфоциты бронхоальвеолярного лаважа при саркоидозе

H Stridh, A Planck, D Gigliotti, A Eklund, J Grunewald
Department of Medicine, Division of Respiratory Medicine, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden
Department of Microbiology and Tumorbiology Centre and Department of Microbiology, Pathology and Immunology, Division of Biomedical Laboratory Technology, Karolinska Institutet

Реферат

Саркоидоз - хроническая гранулематозная болезнь легкого неизвестного происхождения. Накопление активизированных T-клеток в местах воспаления представляет раннюю стадию формирования гранулемы. Так как механизмы, управляющие нормальным разрешением воспалительных процессов изучены плохо, в этом исследовании мы стремилось изучить апоптический фенотип Т-лимфоцитов из периферической крови и из легкого пациентов с саркоидозом.

Бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ) был выполнен у 10 пациентов с активным саркоидозом и у пяти здоровых индивидуумов в группе контроля.

Фактически, мы не наблюдали никакого апоптоза лимфоцитов при окрашивании аннексином V и по Hoechst. У неапоптических лимфоцитов БАЛ пациентов с саркоидозом была обнаружена непрерывная активность каспазы-3. Однако, как было показано в исследованиях in vitro, для эффективной активации Т-клеток, после триггеринга ТКР необходима активация каспазы. Только 11.0 % (диапазон 7.7-17.6) лимфоцитов ЖБАЛ пациентов с саркоидозом были аннексин V положительны после воздействия стимулятора апоптоза трибутилтина (ТВТ) по сравнению с 55.0 % (диапазон 42.0-62.0) лимфоцитов БАЛ группы контроля (p < 0.001). После анти-fas обработки только 8.5 % (диапазон 6-10) лимфоцитов БАЛ пациентов, но 45.5 % (диапазон 38-62) группы контроля были апоптическими.

Лимфоциты ЖБАЛ пациентов с саркоидозом имеют неапоптическую морфологию, связанную с активностью эндогенной каспазы-3. Эти лимфоциты резистентны к апоптозу, что может вносить вклад в накопление воспалительных клеток в легких, постоянство воспаления и развитие гранулем.

Введение

Саркоидоз - хроническая гранулематозная болезнь неизвестной этиологии, которая чаще всего воздействует на легкие. В ранней стадии болезни происходит мононуклеарный альвеолит с доминированием активизированных CD4+ T-клеток и макрофагов. Скоординированное взаимодействие этих клеток ведет к формированию характерных неказеозных гранулем и, у некоторых пациентов, к фиброзу и постоянному ухудшению функции легкого (1,2). В течение воспалительного процесса, число лимфоцитов и, в частности, некоторых субпопуляций Т-клеток, в БАЛ увеличены (1,3). Отношение субпопуляций лимфоцитов в БАЛ зависит от баланса иммиграции (регулируемой молекулами адгезии), местной пролиферации, апоптоза и миграции (4). Цитокины, такие как фактор некроза опухоли альфа и интерферон гамма, как известно, являются важными для формирования гранулемы (5,6), однако механизмы разрешения гранулем достоверно не установлены. Возможно, гранулематозное воспаление может быть ликвидировано изъятием воспалительных цитокинов и/или индукцией апоптоза (7-10).

Апоптоз является результатом активации внутренне кодируемой программы самоубийства клетки, которая индуцируется различными внешними и внутренними сигналами. Семейство протеаз цистеина, называемых каспазами, необходимы для исполнения сигнала (11). В частности, семейство каспазы-3 связано с апоптозом и никакая другая функция этих ферментов неизвестна.

Однако, недавние исследования показали высокие уровни активности каспазы-3 в отсутствии апоптоза у активизированных T-клеток (12-16). Кроме того, пролиферация ингибиторов каспазы, процессинг интерлейкина-2 экспрессия и MHC класса II в этих клетках (13,14), указывает, что семейство ферментов каспазы-3 не только включено в индукцию клеточной смерти, но может участвовать в пролиферации лимфоцитов (15). Активация каспазы, обнаруженная у стимулированных T-клеток, могла бы быть неотъемлимой частью механизма клеточной активации. Однако, механизм активация каспазы-3 у CD3-стимулированных T-клеток остается неясным. Кроме того, индуцированная рецепторами Т-клеток (ТКР) активность каспазы была связана с устойчивостью к апоптозу и это состояние, возможно, является переходным, так как когда клетки стимулировались CD3 в течение длительного периода, активность каспазы снижалась и клетки снова становились восприимчивыми к апоптозу (16). Поэтому, возможно, имеется корреляция между индуцированной ТКР активностью каспазы, состоянием активации клеток и устойчивости к апоптозу.

Тонкий баланс между апоптозом и выживанием активизированных воспалительных клеток, таким образом, является фундаментальным механизмом для поддержания гомеостаза иммунной системы. Недостаточный апоптоз T-клеток может влиять на клональную делецию и приводить к нарушению толерантности и накоплению соответствующих T-клеток, способствующих хроническому воспалению. Такие процессы действительно наблюдаются при воспалительной болезни кишечника, где устойчивость Т-клеток к апоптозу вносит вклад в накопление Т-клеток и поддержку хронического воспаления (17).

Хотя наши знания о молекулярных механизмах саркоидоза значительно улучшились в течение последних нескольких лет, мы все еще далеки от их полного понимания. В частности механизмы, управляющие нормальным разрешением саркоидного воспалительного процесса, изучены плохо. Только несколько исследований сосредоточились на апоптозе при легочном саркоидозе, и их результаты указали на измененный апоптический фенотип клеток, участвующих в воспалительном процессе (18,19). Кроме того, имеется противоречивая информация относительно роли апоптоза при саркоидозе. Cree с коллегами (20) наблюдал апоптические клетки в пределах гранулем пациентов с саркоидозом, однако имелись значительные различия между индивидуальными повреждениями и степенью апоптоза, которая коррелировала со способностью к спонтанной ремиссии. Недавние исследования показали, что Fas рецептор (FasR) и Fas лиганд (FasL) имеют более высокие уровни экспрессии у легочных Т-лимфоцитов пациентов с активным саркоидозом чем у популяций нормальных T-клеток (21,22). Также, альвеолярные макрофаги пациентов с саркоидозозом имеют более высокую экспрессию FasR и TNFR1 (23). Подобно Fas, анти-апоптический протеин Bcl-2 сильно экспрессирован лимфоцитами, окружающими гранулематозные повреждения пациентов с саркоидозом (24). Поэтому, предыдущие данные могут указывать на изменения апоптического фенотипа клеток, участвующих в процессе саркоидного воспаления. Однако, наиболее важный вопрос - чувствительность к индукции апоптоза, не был исследован.

Мы сравнили чувствительность лимфоцитов БАЛ и лимфоцитов периферической крови (PBL) к индукции апоптоза у пациентов с легочным саркоидозом и в группе контроля. Апоптоз был индуцирован с помощью трибутилтина (TBT), средства, которое является мощным индуктором активации каспазы и апоптоза T-клеток и периферических Т-лимфоцитов при лейкемии (25-28).

МЕТОДЫ

Пациеты

Десять пациентов с саркоидозом (8 мужчин), средний возраст 33.5 лет (диапазон 26-49 лет) участвовали в исследовании. Все 8 пациентов не курили. Диагноз был установлен в соответствии с критериями ATS (29), при положительных результатах биопсии (n=5) или клинической картине синдрома Лёфгрена, то есть двусторонней грудной лимфаденопатией (BHL) и артритом голеностопного сустава и/или узловатой эритемой. У одного пациента диагноз был основан на типичной клинической картине, лимфоцитозе БАЛ, BHL и инфильтратах паренхимы при КТ. Ни одного пациента не лечили кортикостероидами до проведения БАЛ, который выполнен в среднем через 3.5 месяца (диапазон 1-16 месяцев) после появления симптомов. Болезнь была классифицирована как активная согласно критериям WASOG (30) у всех пациентов. Пять здоровых некурящих добровольцев (три мужчины) со средним возрастом 27 лет (диапазон 26-49 лет) соствавляли группу контроля. Все они имели нормальную рентгенограмму и ни один не имел никаких клинических признаков болезни легкого или любой другой воспалительной болезни. Исследование было одобрено комитетом по этике.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Идентификация апоптоза у клетотк PBL/PBMC и БАЛ

Один из путей идентификации апоптических клеток состоит в том, чтобы обнаружить фосфатидилсерин (PS), который при апоптозе располагается на внешней или внутренней стороне плазматической мембраны. Недавно изолированные лимфоциты БАЛ и PBL в группе контроля и у пациентов с саркоидозом были проверены на наличие PS, с помощью окрашивания аннексином V. В среднем 7.0 % (диапазон 4.0-10.0) и 5.3 % (диапазон 3.9-18.0) нестимулированных PBL группы контроля и пациентов, соответственно, были аннексин V положительны. У нестимулированных лимфоцитов БАЛ группы контроля и пациентов, соответствующие значения были 5.0 % (диапазон 2.0-12.0) и 9.0 % (диапазон 4.5-14.4).

Другая характерная особенность апоптоза - фрагментация ядер, может быть визуализирована с помощью окрашивания по Hoechst. Было визуализировано приблизительно 5.0 % (диапазон 3.0-8.3) лимфоцитов БАЛ и PBMC группы контроля и пациентов, что позволяет предположить, что большинство клеток были неапоптическими.

Индукция апоптоза в PBL и клетках БАЛ

Чтобы изучить чувствительность к индукции апоптоза, клетки БАЛ и PBMC группы контроля и пациентов с саркоидозом были подвергнуты воздействю двух классических стимуляторов апоптоза - анти-fas и TBT (25-28) и проанализированы при аннексин V окрашивании. После 1 часа воздействия 2 µM TBT, 85.0 % (диапазон 78.0-100.0) PBL группы контроля и 50.8 % (диапазон 24.0-72.1) и PBL пациентов с саркоидозом были аннексин V положительны. У одного пациента PBL оказался более резистентным к индукции апоптоза, так как после воздействия TBT аннексин V положительны были только 6 % PBL. Этот пациент также имел отличные от других клинические особенности, так как он был единственным пациентом с рентгенологической стадией III.

После воздействия TBT в течение 1 часа, 55.0 % (диапазон 42.0-62.0) лимфоцитов ЖБАЛ группы контроля, но только 11.0 % (диапазон 7.7-17.6) лимфоцитов БАЛ пациентов с саркоидозом стали аннексин V положительны (p < 0.001). Увеличение времени воздействия не приводило к усилению апоптоза, вместо этого клетки стали некротическими. Таким образом, увеличение PS после обработки TBT было значительно выше у лимфоцитов БАЛ группы контроля, чем у пациентов с саркоидозом. Та же самая тенденция была замечена при воздействии анти-fas антител - 45.5 % (диапазон 38-62) лимфоцитов ЖБАЛ группы контроля, но только 8.5 % (диапазон 6-10) лимфоцитов БАЛ пациентов были аннексин V положительны.

Активность каспазы-3 у PBL и лимфоцитов БАЛ

Чтобы оценить, имеют ли лимфоциты БАЛ и PBL пациентов с саркоидозом и группы контроля признаки активации каспазы, клетки были проверены с помошью проточной цитометрии. Как и ожидалось, была обнаружена небольшая активность каспазы у PBL группы контроля (средняя интенсивность флюоресценции (MFI)= 4.0, диапазон 3.0-6.0) и пациентов с саркоидозом (MFI=4.5, диапазон 2.1-93.3). Один пациент имел значительную активность каспазы в PBL (MFI=93.3). Это был тот самый пациент, PBL которого имели повышенную резистентность к апоптозу в ответ на обработку TBT.

Увеличенная активность каспазы-3 была обнаружена у лимфоцитов ЖБАЛ группы контроля (MFI= 51.0, диапазон 21.0-68.0), и более явная активность каспазы наблюдалась у лимфоцитов БАЛ пациентов с саркоидозом (MFI=89.1, диапазон 19.7-128.9, p=0.06).

Наблюдалось небольшое увеличение уровней каспазы-3 у лимфоцитов БАЛ пациентов с саркоидозом после обработки TBT (MFI=98.0, диапазон 78-120). Напротив, активность каспазы-3 была увеличена у PBL пациентов с саркоидозом и группы контроля и в клетках БАЛ группы контроля. У пациентов, у которых активность каспазы-3 была уже увеличена, обработка TBT не увеличивала активность.

ОБСУЖДЕНИЕ

Мы проанализировали апоптический фенотип и восприимчивость к индукции апоптоза у недавно изолированных PBMC и лимфоцитов БАЛ 10 пациентов с саркоидозом и у пяти здоровых индивидуумов в группе контроля. Апоптоз определялся с помощью окрашивания аннексином V для обнаружения PS и окрашиванием по Hoechst для определения фрагментации ядер. Приблизительно 5-10 % лимфоцитов имели признаки апоптоза при окрашивании аннексином V и по Hoechst, принимая во внимание, что положительные сигналы для FasR и CD69 были обнаружены у большинства клеток ЖБАЛ, что подтверждает предыдущие сообщения (31-33). Клетки ЖБАЛ, таким образом, являются высоко активизированными, но не апоптическими.

Удаление активизированных лимфоцитов - одна из предпосылок для разрешения процесса воспаления. Все еще неясно, может ли дефект в механизме апоптоза продлевать жизнь Т-клеток у пациентов с саркоидозом и таким образом вносить вклад в хроническое воспаление. Нарушение апоптоза могло бы быть одним из механизмов, способствующих формированию иммунных гранулем, характеризованных постоянным воспалением в местах активности болезни. При других воспалительных состояниях, таких как воспалительная болезнь кишечника, были обнаружены T-клетки с нарушенным апоптическим фенотипом. Множество молекул, связанных с апоптозом, регулируют иммунные механизмы, вовлеченные в саркоидный воспалительный процесс. Кроме того, скорость процесса разрешения гранулематозных болезней сильно зависит от местного производства сигналов, индуцирующих или ингибирующих апоптические процессы.

Система FasR/FasL играет важную роль в ограничении экспансии T-клеток и предотвращении чрезмерного накопления активизированных клеток в местах воспаления. Было показано, что FasR и FasL сильнее экспрессированы у легочных лимфоцитов пациентов с саркоидозом чем у нормальных популяций Т-клеток, но апоптоз наблюдался только у тех пациентов, которые улучшились в течение последующего периода, что говорит о том, что система Fas могла бы играть важную роль, особенно в фазе разрешения гранулематозного воспаления (22). Мы показали, что, несмотря на высокую экспрессию FasR, анти-fas не приводит к обширному апоптозу лимфоцитов БАЛ у пациентов с саркоидозом. Таким образом, вероятно, что механизм апоптоза у этих клеток ''выключен'' и апоптоз не может быть индуцирован независимо от того, запущен ли апоптоз через рецепторы (анти-fas) или через митохондрии (TBT). Однако, путь FasR/FasL может играть критическую роль в фазе разрешения воспаления.

Мы показали, что активированные PBL, остаются резистентными к индуцированию апоптоза в течение 3-5 дней после стимуляции CD3 (16). Резистентность связана с непрерывной активностью каспазы-3 у этих клеток. Исследования показывают, что активация каспазы после триггеринга ТКР может быть физиологическим ответом, требуемым для эффективной активации Т-клеток (12-16). Мы обнаружили высокую активность каспазы-3 у лимфоцитов БАЛ пациентов с саркоидозом и, как и ожидалось, эти клетки были в значительной степени резистентны к индукции апоптоза. Воздействие TBT не увеличивало активность каспазы-3 у этих клеток, и при этом это не индуцировало апоптическую морфологию. Вместо этого, клетки стали некротическими несколькими часами позже. Напротив, когда с лимфоцитами ЖБАЛ группы контроля были проведены аналогичные эксперименты, апоптоз был успешно индуцирован. Роль каспазы в процессе активации T-клеток, поэтому, все еще ясно не определена и при этом не ясно, почему белки в клетках с высокой активностью каспазы-3 защищены от деградации. Однако, очевидно, что активность каспазы должна сильно регулироваться, чтобы защитить регулирующие и другие жизненно важные белковые структуры от протеолитической деградации.

PBL группы контроля (имеющие низкоактивизированное состояние) были наиболее восприимчивы к индукции апоптоза, принимая во внимание, что лимфоциты ЖБАЛ пациентов с саркоидозом (имеющие высокоактивизированное состояние) были менее восприимчивы. Подобная разница в восприимчивости к индукции апоптоза наблюдалась и у лимфоцитов БАЛ группы контроля и PBL пациентов с саркоидозом, где обе популяции клеток имеют промежуточную степень активации. Наши результаты указывают на важность состояния активации T-клеток во время воздействия апоптических стимулов. Большое различие результатов между индивидуальными повреждениями (20), может наблюдаться из-за различий в состоянии активации/пролиферации.

Т-лимфоциты, участвующие в иммунном ответе должны распространиться и дифференцироваться в эффекторные клетки. Потребность избежать преждевременной смерти клеток, участвующих в иммунной реакции имеет физиологическую уместность и может быть связана с коротким периодом устойчивости к апоптозу после активации. Апоптоз-резистентный фенотип лимфоцитов БАЛ пациентов с саркоидозом мог бы, поэтому, быть связан с высокоактивизированным состоянием этих клеток.

Единственный пациент со стадией III болезни имел особенно высокую активность каспазы-3 у PBL в отсутствии апоптической морфологии, и эти клетки также показали устойчивость к индукции апоптоза, но, в целом, стадия болезни не влияла на число апоптических клеток в этой группе пациентов с саркоидозом.