Eur Respir J 1999; 13: 1329-1337

Апоптоз в течение гранулематозного воспаления при легочном саркоидозе

R. Kunitake, K. Kuwano, H. Miyazaki, N. Hagimoto, Y. Nomoto, N. Hara
Research Institute for Diseases of the Chest, Faculty of Medicine, Kyushu University, Higashiku, Fukuoka, Japan.

Реферат

Саркоидоз - хроническая воспалительная болезнь неизвестной этиологии, характеризованная формированием ненекротических гранулем. Курс болезни обычно самоограниченный со спонтанным разрешением гранулем. В иммунной системе, Fas антиген (Fas) и Fas лиганд (FasL) вовлечены в регулирование иммунных реакций, стимулируя апоптоз. Поэтому, возможно, что система Fas/FasL и апоптоз могут быть связаны с курсом гранулематозного воспаления при саркоидозе.

Метод TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated biotin nick end-labelling) был использован, чтобы оценить разрывы цепи ДНК как характеристику апоптоза. Также был выполнен иммуногистохимический анализ, чтобы обнаружить белки Fas и FasL и RT-PCR (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипазой), чтобы обнаружить mRNA FasL.

Положительные сигналы при использовании TUNEL были обнаружены у эпителиоидных гистиоцитов и лимфоцитов в пределах гранулем и у лимфоцитов бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) пациентов с саркоидозом. Положительные сигналы для Fas также были обнаружены в этих клетках. mRNA FasL была экспрессирована у лимфоцитов БАЛ у 15 из 20 пациентов с саркоидозом, но от только у одного из 10 пациентов с нормальной паренхимой легкого. Белок FasL был экспрессирован у лимфоцитов окружающх гранулему и у лимфоцитов в пределах гранулемы. Имелась существенная корреляция между результатами TUNEL и клиническим курсом пациентов с саркоидозом.

Апоптоз эпителиоидных гистиоцитов и воспалительных клеток влияет на течение гранулематозного воспаления. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить роль Fas, FasL и других регулирующих факторов апоптоза в гранулематозном воспалении при легочном саркоидозе.

Fas антиген (Fas) - белок на поверхности клеток, который является медиатором апоптоза. Он является членом семейства рецепторов фактора роста нервов / фактора некроза опухоли. Он экспрессирован у различных клеток и тканей, включая тимус, печень, яичники, сердце и легкое [1]. Fas лиганд (FasL) - мембранный белок типа II, который является членом семейства TNF. FasL преимущественно экспресирован у активизированных T-лимфоцитов и в некоторых тканях, включая тонкий кишечник, почки, яичко и легкое [2]. При перекрестной связи с FasL, Fas является медиатором апоптоза клеток, несущих Fas антиген. В иммунной системе, Fas и FasL вовлечены в регулирование иммунных реакций [3-5]. В настоящее время признано, что ненужные клетки могут быть уничтожены апоптозом, который уничтожает клетки без инициации воспалительного ответа.

Polunovsky с коллегами [6] продемонстрировали присутствие сигналов, способных стимулировать смерть клеточных элементов грануляций в течение процесса восстановления после острого повреждения легкого. Апоптоз ненужных клеток в процессе ремоделирования - важный механизм для разрешения воспаления и для восстановления поврежденной ткани легкого.

Саркоидоз - мультисистемная гранулематозная болезнь неизвестной этиологии, наиболее обычно воздействующая на молодых взрослых с проявлениями в виде двусторонней лимфаденопатии, легочных инфильтратов повреждений кожи или глаз. Саркоидоз может разрешаться спонтанно или в результате кортикостероидной терапии. Гранулемы часто разрешаются спонтанно, без продолжения воспаления и фиброза. Механизмы разрешения саркоидных гранулем не известны. Возможно, разрешение гранулематозного воспаления может быть индуцировано удалением воспалительных цитокинов и/или индукцией ингибирующих сигналов для этих цитокинов. Для разрешения болезни без продолжения воспаления или фиброза, эпителиоидные гистиоциты, фибробласты и воспалительные клетки должны быть устранены без нежелательных побочных эффектов. Поэтому, вероятно, что апоптоз и система Fas/FasL могут быть связаны с курсом гранулематозного воспаления при легочном саркоидозе.

С помощью метода TUNEL были исследованы присутствие и распределение разрывов цепи ДНК, как характеристика апоптоза в тканях легкого и клеток бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) пациентов с легочным саркоидозом. Экспрессия белка Fas в тканях легкого и клетках БАЛ и FasL в тканях легкого были исследованы с использованием иммуногистохимического анализа и RT-PCR, чтобы обнаружить mRNA FasL.

Пациенты

Были исследованы двадцать пациентов с гистологически доказанным легочным саркоидозом, 10 мужчин, 10 женщин, возрастной диапазон 24-68 лет (средний возраст 42 года), 10 курящие, 10 некурящие. Образцы для исследования были получены при трансбронхиальной биопсии легкого (TBLB) и БАЛ. Во всех случаях экспертиза была выполнена до начала лечения кортикостероидами. Группа контроля состояла из шести мужчин и четырех женщин, возрастной диапазон 56-78 лет (средний возраст 67 лет), восемь курящие, два некурящие.

Результаты

Курс болезни был оценен по рентгенографическим и клиническими результатам. Восемнадцать из 20 пациентов наблюдались в течение 2-6 лет. Из них 10 улучшились, в то время как восемь все еще имеют активную болезнь. Курс двух пациентов (пациенты 2 и 8) неизвестен. Результаты TUNEL: число TUNEL-положительных клеток в гранулематозной ткани легкого градуировалось от 0 до 3, согласно проценту окрашенных ядер: 0, < 10 %; 1, 10-20 %; 2, 20-50 %; 3, > 50 %.

Заметное TUNEL окрашивание было отмечено главным образом у эпителиоидных гистиоцитов в пределах гранулем в 12 из 20 (60 %) случаев. Положительные TUNEL сигналы также были обнаружены у некоторых лимфоцитов и макрофагов. С другой стороны, ни один из десяти нормальных экземпляров паренхимы легкого не показал положительных сигналов. Положительные TUNEL сигналы также были найдены у лимфоцитов БАЛ у 6 из 11 (54 %) пациентов с саркоидозом и у небольшого числа макрофагов. Не имелось положительных сигналов у клеток ЖБАЛ в группе контроля.

Иммуногистохимический анализ Fas

Частота экспрессии Fas градуировалась от 0 до 3, согласно проценту окрашенных клеток: 0, < 10 %; 1, 10-20 %; 2, 20-50 %; 3, > 50 % клеток. Результаты были оценены тремя независимыми экспертами. Иммунореактивность Fas была обнаружена в пределах гранулем у всех 20 пациентов с саркоидозом. Наиболее заметная экспрессия Fas наблюдалась в цитоплазме эпителиоидных гистиоцитов и многоядерных гигантских клеток в пределах гранулемы. Положительные сигналы были также замечены у некоторых альвеолярных макрофагов, окружающих гранулему и у некоторых лимфоцитов. Не имелось положительных сигналов в нормальной паренхиме легкого. Экспрессия Fas также была обнаружена у лимфоцитов БАЛ и макрофагов пациентов с саркоидозом, но не в нормальной паренхиме легкого.

Иммуногистохимический анализ FasL

Иммуногистохимический анализ FasL был выполнен в восьми случаях. FasL был обнаружен в трех из восьми случаев. FasL был локализован в лимфоцитах в пределах гранулемы и в окружающих гранулему тканях легкого пациентов с саркоидозом. Положительные сигналы для FasL были обнаружены у < 10 % лимфоцитов. FasL не был обнаружен в нормальной паренхиме легкого.

RT-PCR анализ mRNA FasL

RT-PCR анализ mRNA FasL клеток БАЛ показал специфические гибридизационные полосы для mRNA FasL в 15 из 20 (75 %) случаев саркоидоза, но только в одном из 10 экземпляров нормальной паренхимы легкого. Экспрессия mRNA FasL была обнаружена у лимфоцитов БАЛ у 10 из 15 пациентов с саркоидозом, которые имели положительные результаты RT-PCR.

Связь между результатами TUNEL и экспрессией Fas/FasL

Не имелось существенной корреляции между результатами TUNEL и экспрессией Fas/FasL или mRNA FasL.

Связь между результатами TUNEL и клиническим курсом

Результаты TUNEL в гранулематозных повреждениях коррелировали с клиническим курсом болезни (p < 0.05). Ни результаты TUNEL ни экспрессия mRNA FasL не коррелировали с числом лимфоцитов, процентом лимфоцитов или отношением CD4/CD8 в БАЛ, уровнем АПФ или присутствием внелегочного вовлечения.

Обсуждение

Гранулематозное воспаление при саркоидозе обычно разрешается спонтанно. В этом исследовании, метод TUNEL позволил обнаружить положительные сигналы у эпителиоидных гистиоцитов, лимфоцитов и макрофагов в пределах или в окружении саркоидных гранулем. Кроме того, результаты TUNEL коррелировали с клиническим курсом болезни, оцененным по рентгенографическими и клиническим результатам. Большинство TUNEL-положительных пациентов улучшились в течение периода наблюдения. Поэтому, апоптоз эпителиоидных гистиоцитов и воспалительных клеток может играть роль в определении курса гранулематозного воспаления.

Устранение процессом апоптоза лейкоцитов и пролиферирующих резидентных клеток было предложено как важный механизм разрешения воспаления и предотвращения поствоспалительного рубцевания и фиброза [13, 14]. Восстановление после острого повреждения легкого требует устранения воспалительных клеток из альвеолярных воздушных пространств [6]. Неудача устранения нежелательных клеток процессом апоптоза продлевает воспаление.

Альвеолит - самое раннее обнаруженное проявление повреждения легкого при легочном фиброзе [15]. In vivo были получены данные указывающие, что апоптоз свойственен для бронхиолярных и альвеолярных эпителиальных клеток мышей при блеомицин-индуцированном легочном фиброзе [11]. Также было описано, что разрывы цепи ДНК являются характеристикой апоптоза, обнаруженного с помощью TUNEL у бронхиолярных и альвеолярных эпителиальных клеток при идиопатическом легочном фиброзе (IPF) [9]. В отличие от IPF, при саркоидозе положительные сигналы TUNEL были ограничены клетками, производящими гранулематозное воспаление и гранулематозное воспаление обычно разрешается без фиброза.

Эти результаты говорят, что эпителиоидные гистиоциты, макрофаги и лимфоциты выборочно устраняются в ходе гранулематозного воспаления. Демонстрировалось, что Fas был экспрессирован у бронхиолярных и альвеолярных эпителиальных клеток в нормальных тканях легкого [16]. Также было обнаружено, что экспрессия Fas у бронхиальных и альвеолярных эпителиальных клеток при IPF была увеличена [17]. В отличие от IPF, при саркоидозе экспрессия Fas была увеличена у эпителиоидных гистиоцитов, макрофагов и лимфоцитов. Эти результаты совместимы с данными TUNEL-окрашивания. Увеличенная экспрессия Fas, ограниченная воспалительными клетками, может отражать физиологически регулируемый апоптоз при саркоидозе. mRNA FasL была обнаружена у лимфоцитов ЖБАЛ. FasL наблюдался у лимфоцитов окружающих гранулему, в пределах гранулемы и в ткани легкого пациентов с саркоидозом.

В то время как mRNA FasL была обнаружена в 15 из 20 случаев (75 %), белок FasL был обнаружен только в трех из восьми случаев. Эти три случая показали экспрессию mRNA FasL у лимфоцитов БАЛ. Имеются некоторые причины низкой частоты экспрессии FasL. Во-первых, чувствительность иммуногистохимического анализа для FasL была недостаточно высокой. Это может быть следствием того, что экземпляры были зафиксированы формалином и залиты парафином, а не использовались свежезамороженные ткани. Во-вторых, так как экспрессия FasL является спорадической, FasL мог быть обнаружен только в нескольких экземплярах ткани, полученных с помощью TBLB.

Milik с коллегами [18] продемонстрировали, что апоптоз вносит вклад в устранение лимфоцитов в течение физиологического легочного иммунного ответа и требует экспрессии Fas и FasL. Поэтому, экспрессия Fas и FasL у лимфоцитов ЖБАЛ может быть уместна при регулировании воспалительной реакции, стимулируя апоптоз лимфоцитов ЖБАЛ. Также возможно, что экспрессия FasL у лимфоцитов гранулеме и в пределах окружения гранулем может стимулировать апоптоз эпителиоидных гистиоцитов, макрофагов и лимфоцитов, у которых увеличена экспрессия Fas.

Однако, экспрессия Fas и FasL в этом исследовании не коррелировала с результатами TUNEL или с клиническим курсом, в то время как результаты TUNEL коррелировали со спонтанным разрешением болезни, оцененной по рентгенографическим и клиническим результатам. Покоящиеся T-клетки или недавно активизированные T-клетки не подвергаются апоптозу в ответ на сигналы Fas. Чувствительность к Fas-индуцированному апоптозу развивается через 4-6 дней после активации, возможно под действием цитокинов [19]. Поэтому, некоторые факторы, такие как интерлейкин-2 или производство других факторов, могут уменьшать восприимчивость к апоптозу активизированных T-лимфоцитов и других воспалительных клеток при саркоидозе.

Легочные T-лимфоциты пациентов с саркоидозом, но не клетки здоровых индивидуумов, секретируют большое количество фактора хемотаксиса моноцитов [20, 21], что приводит к фактически непрерывному привлечению моноцитов, которые в конечном счете станут эпителиоидными клетками легочных гранулем. Поэтому, так как взаимодействие между факторами клеточной смерти и факторами жизни клеток является комплексным, не может иметься корреляции между экспрессией Fas/FasL и клиническим курсом.

Так как число случаев в этом исследовании был мало, необходимо наблюдение большей группы пациентов, чтобы объяснить точную роль апоптоза и Fas/FasL в разрешении гранулематозного воспаления.