Am. J. Respir. Crit. Care Med., Volume 161, Number 3, March 2000, 814-818

Легочные клетки T-хелпер, экспрессирующие Т-клеточный рецептор AV2S3, связаны с клиническими особенностями легочного саркоидоза

JOHAN GRUNEWALD, MARY BERLIN, OLLE OLERUP, and ANDERS EKLUND
Department of Medicine, Division of Respiratory Medicine, Karolinska Hospital, Stockholm; and Department of Biosciences at Novum and Division of Clinical Immunology, Huddinge Hospital, Huddinge, Sweden

Реферат

В предыдущих исследованиях Скандинавских пациентов с саркоидозом, мы описали сильную связь между ограниченной легкими субпопуляцией T-клеток, экспрессирующих Т-клеточный рецептор (ТКР) AV2S3 и аллелями человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) -DRB1*0301 (DR17) и -DRB3*0101, что предполагает существование специфического саркоидого антигена. В настоящем исследовании была проверена связь между степенью накопления в легких AV2S3+ T-клеток с клиническими данными 51 HLA-DRB1*0301/DRB3*0101-позитивного Скандинавского пациента с легочным саркоидозом. Значительно большее количество AV2S3+ T-клеток (среднее значение 30.0 %) было найдено у пациентов с короткой (< 2 лет), чем с длинной (> 2 лет) (среднее значение 18.6 %) продолжительностью болезни (p = 0.003). Сильная положительная связь также была найдена между AV2S3+ T-клетками и отношением CD4+/CD8+ в БАЛ (p = 7*10^-6) и с острым началом болезни (p = 0.018). Отрицательная связь была найдена между интервалом времени от начала болезни до проведения бронхоальвеолярного лаважа (p = 0.0001) и возрастом пациента (p = 0.002). Наши результаты связывают накопление AV2S3+ T-клеток в легком с острым воспалительным ответом при саркоидозе. Кроме того, связь этих клеток с хорошим прогнозом указывает, что AV2S3+ T-клетки могут иметь протективную роль против предполагаемого саркоидного антигена.

Введение

Саркоидоз - системная гранулематозная болезнь неизвестной этиологии. Фактически, она может затрагивать любой орган, хотя наиболее часто вовлекаются легкие. Считается, что болезнь развивается у наследственно предрасположенных индивидуумов, которые подвергнуты воздействию пока еще неописанного антигена. Исследования иммунного ответа при саркоидозе, включая формирование неказеозных эпителиоидных гранулем, эпидемиологические данные и истории болезни пациентов, у которых проводилась трансплантация органов, указывают на существование специфического саркоидного агента (1).

В иммунном ответе при саркоидозе важную роль играет презентация предполагаемого антигена T-лимфоцитам антигенпрезентирующими клетками (APCs). Антигены обычно презентируются как пептиды в контексте молекул человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) класса II (HLA-DR, -DP, -DQ) которые экспрессированы APCs и опознаются T-клетками с помощью Т-клеточных рецепторов (ТКР). После взаимодействия между APCs и T-лимфоцитами при саркоидозе, развивается воспаление, характеризованное накоплением в легких CD4+ T-клеток (2), главным образом T-хелперов, производящих Th1 цитокины, такие как интерферон-гамма и интерлейкин-2 (3, 4).

В течение созревания лимфоцита в тимусе, вариабельная часть альфа-бета цепи ТКР формируется из случайной комбинации вариабельного (V), дополнительного (D; только для бета цепи) и соединяющего (J) сегмента гена. Разнообразие ТКР очень велико, составляя 10¹⁵ вариантов (5). Однако, при презентации специфического антигена, T-клетки во многих случаях используют только AV или BV сегмент гена ТКР (6).

Анализируя T-клетки бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), мы ранее описали строгую корреляцию между накоплением в легких CD4+ и AV2S3+ T-клеток и HLA-DR17 гаплотипом (то есть, DRB1*0301; другое название DR17 [3]) у Скандинавских пациентов с саркоидозом, которые имели активную болезнь (10, 11). В недавнем исследовании мы обнаружили, что эта связь также включала HLA-DRB3*0101 аллель, который был экспрессирован у большинства HLA-DR17-позитивных и некоторых HLA-DR13-позитивных индивидуумов (J. Grunewald). Мы также секвенировали цепь ТКР альфа AV2S3+ легочных T-клеток и результаты показали, что эти клетки были стимулированы неизвестным саркоидным антигеном (12).

В настоящем исследовании мы связали относительное число легочных ТКР AV2S3+ T-клеток с клиническими данными 51 Скандинавского пациента с активным легочным саркоидозом, которые имели различную степень накопления AV2S3+ T-клеток в легких. Мы обнаружили связь между относительным числом AV2S3+ T-клеток в БАЛ и некоторыми клиническими особенностями болезни, включая короткую продолжительность болезни. Эти результаты связывают AV2S3+ T-клетки в БАЛ с острым иммунным ответом при саркоидозе, а также говорят, что эти клетки могут иметь протективную роль при ответе на неизвестный саркоидный антиген.

Пациенты

Группа исследования состояла из 51 Скандинавского пациента с легочным саркоидозом, которые были включены в предыдущее исследование экспрессии AV2S3 клеток БАЛ и лимфоцитов периферической крови (J. Grunewald с коллегами). Все пациенты были белыми и имели более или менее явные признаки накопления T-клеток, экспрессирующих ТКР AV2S3.

Все пациенты имели клинические и рентгенографические результаты, совместимые с саркоидозом. Двадцать один пациент имел положительные результаты биопсии, 38 пациентов имели отношение CD4+/CD8+ в БАЛ > 3.5 (13) и 41 пациент имел классический синдром Лёфгрена. У всех пациентов, включенных в это исследование была активная болезнь, определенная на основании результатов рентгенограммы, тестов функции легкого и присутствии симптомов во время проведения исследования или в течение 3 месяцев до начала исследования. Начало болезни было классифицировано как острое или неострое, было определено время от первого появлления симптомов до проведения БАЛ. Были зарегистрированы респираторные симптомы и внелегочные проявления, синдром Лёфгрена был диагностирован при присутствии таких симптомов как артрит и/или узловатая эритема и лихорадка. Рентгенографическая стадия болезни была определена для каждого пациента. Тридцать девять пациентов наблюдались более 2 лет и были классифицированы согласно изменениям рентгенограммы и/или симптомов как имеющие короткую продолжительность болезни (то есть ремиссия в течение 2 лет) или большую продолжительность болезни (то есть наличие признаков активности болезни более 2 лет) (14).

Все пациенты дали информированное согласие на участие в исследовании и исследование было одобрено комитетом по этике.

Результаты

Все пациенты, зарегистрированные в исследовании, были HLA-DRB1* 0301 и/или -DRB3*0101 положительны и имели различную степень накопления CD4+ T-клеток, экспрессирующих ТКР AV2S3. Пациенты включенные в исследование, имели средний возраст 36 лет, 30 мужчин и 21 женщина. Все пациенты имели активный саркоидоз, AV2S3+ T-клетки БАЛ составляли в среднем 29.0 % всех CD4+ T-клеток, по сравнению с только 4.1 % CD4+ Т-клеток периферической крови. Для сравнения, предыдущие исследования показали, что в среднем 3.5 % CD4+ T-клеток в периферической крови здоровой группы контроля экспрессировали AV2S3 (15), 7.6 % CD4+ Т-клеток БАЛ шести HLA-DR17-позитивных индивидуумов здоровой группы контроля экспрессировала AV2S3 (11), 5.0 % T-клеток БАЛ четырех HLA-DR17-позитивных пациентов с аллергическим альвеолитом экспрессировали AV2S3 (16). Так как число AV2S3+ T-клеток в легком в настоящем исследовании варьировалось от 8.6 % до 41.6 %, мы планирорвали определить, коррелируют ли эти вариации с другими особенностями пациентов. Поэтому мы оценили клинические характеристики каждого пациента, данные БАЛ и результаты исследований функции легких и проанализировали связь этих данных с числом AV2S3+ T-клеток в БАЛ.

Относительное число AV2S3+ Т-клеток в БАЛ и клинические характеристики пациентов

Отрицательная корреляция была найдена между числом AV2S3+ T-клеток и возрастом пациентов, причем более старшие пациенты имели меньшее число AV2S3+ T-клеток в БАЛ (p = 0.002, R =-0.41). Также имелась отрицательная корреляция с временем от началом симптомов болезни до проведения БАЛ.

Острая форма начала болезни была связана со значительно более высоким числом AV2S3+ T-клеток в БАЛ (30.2 %; диапазон: от 12.1 до 41.6 %) чем с неострым началом (21.7 %; диапазон: от 8.6 до 40.0 %) (p = 0.018). Пациенты с синдромом Лёфгрена имели тенденцию иметь более высокий процент AV2S3+ Т-клеток в БАЛ (p = 0.059).

Мы наблюдали 39 пациентов более 2 лет и классифицировали их в две группы, согласно исходу болезни. Мы обнаружили, что пациенты с короткой продолжительностью болезни (< 2 лет) имели значительно более высокий процент AV2S3+ T-клеток в БАЛ (30.0 %; диапазон: от 12.1 до 41.4 %) чем пациенты с продолжительной (> 2 лет) болезнью (18.6 %; диапазон: от 9.0 до 30.4 %) (p = 0.003). Фактически, только 1 из 10 пациентов с продолжительностью болезни > 2 лет имел >= 30 % AV2S3+ T-клеток в БАЛ, по сравнению с 15 из 29 пациентов с короткой продолжительностью болезни (p = 0.02). Таким образом, любой пациент с >= 30 % AV2S3+ T-клеток в БАЛ имеет очень хороший прогноз. Не было обнаружено существенных связей между AV2S3+ T-клетками в БАЛ и полом, статусом курения, респираторными / внелегочными симптомами или рентгенографической стадией.

Относительные число AV2S3+ Т-клеток в БАЛ, другие результаты исследования БАЛ и легочная функция

Как и ожидалось, отношение CD4+/CD8+ было увеличено (в среднем 6.7) по сравнению с отношеним CD4+/CD8+ в периферической крови (в среднем 2.0). Процент AV2S3+ T-клеток в легких был сильно связан с отношением CD4+/CD8+ в БАЛ (p = 7*10^-6; R = 0.59) и с признаками лимфоцитарного альвеолита. Таким образом, высокое число AV2S3+ клеток в БАЛ коррелировало с высоким числом клеток в БАЛ (p = 0.04, R = 0.29), с высоким относительным числом лимфоцитов в БАЛ (p = 0.02, R = 0.30) и с низкими относительным числом альвеолярных макрофагов (p = 0.04, R = -0.28) и базофильных гранулоцитов в БАЛ (p = 0.02, R = -0.32).

Не было обнаружено связи между числом AV2S3+ T-клеток в БАЛ и легочной функцией (VC, FEV1, DLCO) или с уровнями АПФ (среднее значение 29.4 units/L; диапазон: от 9.7 до 63.1 units/L).

ОБСУЖДЕНИЕ

В предыдущих исследованиях T-клеток БАЛ Скандинавских пациентов с саркоидозом, мы установили связь между DRB1*0301 (HLA-DR17) и накоплением в легких T-клеток, экспрессирующих ТКР AV2S3 (10, 11), и расширили эту связь, включив в исследование HLA-DRB3*0101 аллель. Строгая связь между некоторым вариабельными сегментами гена ТКР, выборочно экспрессированными T-клетками, расположенными в очаге воспаления и специфическими HLA аллелями, уникальна для иммунологических исследований человека. Более глубокое исследование возможной связи между относительным числом AV2S3+ T-клеток в БАЛ и различными клиническими особенностями пациентов с саркоидозом было бы важным для объяснения роли для этих клеток при саркоидозе. Наши данные позволяют связать AV2S3+ T-клетки с признаками, отражающими острый воспалительный ответ при саркоидозе и кроме того предполагают, что эти клетки имеют протективную роль против предполагаемого саркоидного антигена.

Наше первоначальное наблюдение экспансии AV2S3+ T-клеток в БАЛ у HLA-DR17-позитивных пациентов, при том что они имели нормальное число AV2S3+ T-клеток в периферической крови, позволило связать эти клетки с участком активности болезни. Исчезновение AV2S3+ T-клеток в БАЛ происходит параллельно уменьшению лимфоцитарного альвеолита и было связано с клиническим улучшением у большинства этих пациентов с течением времени. Поэтому, это наблюдение также позволяет связать AV2S3+ T-клетки в БАЛ с времем острого местного иммунного ответа при саркоидозе, и поэтому относительное число AV2S3+ Т-клеток в БАЛ может использоваться как маркер степени воспаления у пациентов со связанными с саркоидозом аллелями HLA-DR.

Известно, что большие популяции T-клеток, экспрессирующие вариабельный сегмент гена ТКР, являются последствием предыдущей иммунной реакции против специфического антигенного пептида. Поэтому, AV2S3+ T-клетки БАЛ могут быть вовлечены в иммунный ответ против специфического антигена, который находится в легких пациентов с саркоидозом. Аналогично, T-клетки, экспрессирующие вариабельный сегмент гена ТКР в вовлеченном органе также были описаны при других аутоиммуннных болезнях, например при рассеянном склерозе (17) и у здоровых индивидуумов (18), причем их частота увеличивается с возрастом (19). Хотя последние результаты были получены для Т-клеток периферической крови, они могут быть уместны для легочных T-клеток, так как предыдущие исследования, сравнивающие состав T-клеток в периферической крови и БАЛ не обнаружили никаких существенных различий (20, 21). Это позволяет ожидать увеличенную частоту T-клеток, экспрессирующих вариабельный сегмент гена ТКР у пожилых здоровых индивидуумов. Напротив, наши данные, что пожилые пациенты с саркоидозом имеют уменьшенное число AV2S3+ T-клеток в БАЛ говорит, что эти клетки связаны с патологией саркоидоза.

Хотя функция накопления в легких AV2S3+ T-клеток при саркоидозе была исследована, ее точная роль в иммунном ответе при саркоидозе все еще не известна. Генерация клонов T-клеток и их использование в исследованиях пролиферации не было плодотворным. Однако, существенная связь AV2S3+ T-клеток с короткой продолжительностью болезни, указывает на выгодную роль этих клеток. Одной из причин этого эффекта могло бы быть эффективное уничтожение предполагаемого саркоидного антигена. Другой причиной могло бы быть производство некоторых эффекторов, например цитокинов, что впоследствии ведет к более эффективному иммунному ответу. Связь между более высоким относительным числом AV2S3+ T-клеток в БАЛ и хорошим прогнозом при саркоидозе открывает возможность использования этой информации при клинической оценке пациентов, принятия решения о начале лечения или наблюдении.

Относительное число AV2S3+ T-клеток в БАЛ у наших пациентов с саркоидозом также было связано с несколькими маркерами лимфоцитарного альвеолита, особенно с отношением CD4+/CD8+. Увеличенное отношение CD4+/CD8+ является специфичным для саркоидоза, если пациент имеет типичную клиническую картину (13). Специфичность накопления AV2S3+ T-клеток в БАЛ была предположена в нашем предыдущем исследовании другой легочной воспалительной болезни (аллергический альвеолит), в котором мы не смогли обнаружить накопление AV2S3+ T-клеток в легких пациентов, согласованных по гаплотипу (16). Подобное исследование T-клеток пациентов с бериллиозом, согласованных по гаплотипу, который сильно походит на саркоидоз, имело бы большой интерес. К сожалению, бериллиоз является очень редкой болезнью в Швеции.

Мы представили данные, которые связывают AV2S3+ T-клетки в БАЛ у HLA-DR17 и в подгруппе HLA-DR13-положительных Скандинавских пациентов с саркоидозом, с острым воспалительным ответом у этих пациентов. Наши данные предполагают выгодную роль этих клеток в иммунном ответе на предполагаемый саркоидный антиген. Оценка относительного числа AV2S3+ T-клеток в БАЛ у HLA-DR17 или DRB3*0101 -положительных пациентов с саркоидозом, которые составляют треть всех Скандинавских пациентов с саркоидозом, может использоваться как маркер активности воспаления при оценке прогноза и диагностике пациентов с саркоидозом.