Dermatology 2000;200:342-345

Три случая кожного саркоидоза: поиск бактериального агента с помощью анализа 16S рРНК и лечение антибиотиками

L. Toutous-Trellu, B. Ninet, P. Rohner, R. Auckenthaler, J.-H. Saurat, M. Pechere
Service de dermatologie, DHURDV, Laboratoire central de bacteriologie, Hopital universitaire de Geneve, Suisse

Реферат

Введение: этиология саркоидоза остается неизвестной. Хотя часто обсуждается инфекционная природа саркоидоза, для лечения используется только противовоспалительные или иммуносупрессивные препараты. Цель: исследовать гипотезу бактериального происхождения саркоидоза, используя лечение кожного саркоидоза антибиотиками. Методы: у пациентов с хроническим кожным саркоидозом, резистентным к обычной терапии и не нуждающихся в системной стероидной терапии, проводилось лечение антибиотиками в течение 6 месяцев. Поиск бактериальной ДНК производился с помощью секвестрирования 16S рРНК в материале биопсии коных повреждений до и после лечения антибиотиками. Результаты: три пациента получали комбинированную терапию кларитромицином 1 г в день и ципрофлоксацином 1 г в день. Никаких клинических изменений не произошло в 2 случаях и ухудшение произошло в одном случае. Бактериальная ДНК была обнаружена во всех образцах кожи, включая контольные. Секвенирование ДНК не позволило идентифицировать уникальную бактериальную разновидность. Заключение: мы не смогли получить данные, указываюшие о бактериальном происхождении саркоидоза; однако, этот подход должен быть расширен на большее количество пациентов.

Введение

Этиология саркоидоза остается неизвестной. Начиная с перового описания болезни, предлагалось множество гипотез инфекционного происхождения саркоидоза. Микобактериальная этиология рассматривалась из-за клинических, гистологических и радиологических подобий между микобактериальными инфекциями и саркоидозом [1, 2, 3]. Однако, очевидной причинной связи ни в одном исследовании установлено не было. Лабораторные методы, использующие ПЦР были полезны для обнаружения микроорганизмов с медленным ростом на традиционных средах [4, 5]. Поскольку саркоидоз и другие воспалительные болезни, такие как ревматоидный артрит и болезнь Крона, могут иметь инфекционную природу, мы использовали антибиотики широкого спектра, чувствительную биологическую технику для обнаружения бактериальной ДНК и последующее секвенирование бактериальной 16S рРНК.

Дизайн

Проспективное, открытое экспериментальное исследование, проводимое в отделении дерматологии.

Пациенты

Критериями включения в исследование были: гистологически подтвержденный саркоидоз с хроническими кожными повреждениями, не отвечающими на обычную терапию. У всех пациентов были проведены лабораторные исследования (индексы клеток крови, ферменты печени, кальциемия, креатинемия, уровень АПФ и серологические иммуноглобулины), рентгенограмма грудной клетки и исследование функции легких. Пациенты, нуждающиеся в системной стероидной терапии, беременные женщины и лица моложе 18 лет были исключены из исследования. Комбинированная терапия макролидами и хинолонами прооводилась в течение 6 месяцев. Полная клиническая экспертиза проводилась каждые 6 недель. Для оценки изменения кожных повреждений, были отмечены число повреждений, их размер, цвет и инфильтрация (субъективная мягкость). Повреждения были сфотографированы до и после терапии. Контрольные обследования проводились в начале, через 3 и 6 месяцев терапии (кларитромицин 1 г в день и ципрофлоксацин 1 г в день). Рентгенограмма и легочная функция были исследованы до и после окончания терапии. Перфорационная биопсия кожи была проведена до и после лечения для проведения бактериологического анализа. Пацинты дали информированное согласие на участие в исследовании.

Микробиологические исследования

Эпидермис кожных саркоидных повреждений был получен в стерильных условиях, чтобы исключить загрязнение поверхностными микроорганизмами. Каждый образей ткани был немедленно заморожен при - 70°C. В качестве контроля использовались здоровая кожа с участка, отдаленного от саркоидного повреждения у пациента 1 и а также образец здоровой кожи пациента, прооперированного по поводу базальноклеточной эпителиомы. Молекулярные исследования проводились согласно методике, описанной Springer [6] и Goldenberger [7].

Результаты

В исследование были включены три женщины, которые полностью закончили курс 6-месячной терапии и могли быть оценены через 1 год после окончания лечения.

Пациент 1. 30-летняя португальская женщина имела легочный и кожный саркоидоз. Диагноз был установлен 3 года назад на основании обнаружения саркоидных гранулем в биопсийной ткани, двусторонней внутригрудной лимфаденопатии, двусторонних легочных инфильтратов, увеличенного уровня АПФ 113 U/l (норма 18-55) и лимфоцитоза в ЖБАЛ. Через год лечения преднизоном, легочные и кожные повреждения улучшилась. После прекращения кортикостероидной терапии, на груди, конечностях и лице развились узловые повреждения. Через 7 месяцев была начата терапия кларитромицином 1 г в день и ципрофлоксацином 1 г в день. Клинические, биологические и радиологические исследования не показали никаких изменений. Новые папулы на плечах развились в течение 6-го месяца терапии. Пациент был толерантным к терапии, однако, через 6 месяцев после окончания терапии, повреждения оставались неизменными.

Пациент 2. 42-летняя швейцарская женщина в течение 6 лет наблюдалась по поводу твердых инфильтативных бляшек на лице. Биопсия повреждений (в 1991 и 1997 г.) показала голые (naked) гранулемы. Системных признаков саркоидоза не было. Кожная реакция на туберкулин была отрицательной; реакция оседания эритроцитов, индекс плазматических клеток, уровни кальция, глюкозы, серологические иммуноглобулины были в пределах нормы. Уровень АПФ был немного увеличен 62 U/l (норма 18-55). Рентгенограмма грудной клетки была нормальной. Кожные повреждения не отвечали на местные стероиды, кальципотриол, оральный изотретиноин, гидроксихлорохин и аллопуринол. Лечение кларитромицином 1 г в день и ципрофлоксацином 1 г в день проводилось в течение 6 месяцев без побочных эффектов. Небольшое улучшение (изменение цвета и уменьшение инфильтрации) появилось через 3 месяца после окончания терапии.

Пациент 3. У 57-летней французской женщины легочный саркоидоз был диагностирован 30 лет назад. Проводилось лечение системными кортикостероидами. В настоящее время у нее развился легочный фиброз. Легочная функция ухудшилась почти до 50 % от нормы. Три года назад она заметила фиолетовые инфильтраты на кончике носа. Клиническая и гистологическая экспертиза подтвердила диагноз озноблённой волчанки. Лабораторные исследования показали лимфопению (700/mm³), увеличенные уровни иммуноглобулинов IgG 17.9 g/l (норма 6.7-12.6) и IgA 3.5 g/l (норма 0.8-2.6). Кальциемия и уровень АПФ были нормальными. Рентгенограмма показала легочные ретикулонодулярные помутнения и увеличенные внутригрудные лимфатические узлы. Туберкулиновая кожная проба была отрицательной. Было начато лечение кларитромицином 1 г в день и ципрофлоксацином 1 г в день. Через 3 месяца развились высыпания на коже и лечение антибиотиками было прекращено. Затем была начата терапия другой комбинацией антибиотиков, рифампицин 10 мг/кг в день и азитромицин 1,200 милиграмм в неделю в течение 3 месяцев. Никакого улучшения кожных повреждений не произошло (цвет, размер, инфильтрация). Лабораторные данные и легочная функция не изменились.

Микробиологические результаты

Несмотря на строгие меры предосторожности, чтобы избежать загрязнения материала кожной биопсии поверхностными комменсалами кожи и строгий контроль за стерильностью лабораторного оборудования и реактивов, смешанные бактериальные последовательности были обнаружены во всех образцах и идентификация единственной бактериальной разновидности не могла быть выполнена. Поиск микобактериальной ДНК был отрицательным во всех биопсиях. Исследование контрольных образцов дало подобные результаты.

Обсуждение

Инфекционное происхождение саркоидоза остается одной из наиболее вероятных этиологических гипотез. Аргументы в пользу этой гипотезы многочисленны. В течение долгого времени, патологи подозревали существование специфической причины болезни из-за подобия повреждений во всех органах [8]. Иммунологические механизмы саркоидоза походят на стимулированый антигеном преобладающе клеточный иммунный ответ (CD4 > CD8) с производством цитокинов, главным образом TNF-alpha, IL-1 и IL-2. Этот тип иммунного ответа совместим с реакцией на внутриклеточный микроорганизм [1, 5, 9]. Эпидемиологические и генетические данные также совместимы с этой теорией [10]. Сообщалось о хороших результатах лечения анибиотиками 4 пациентов с активным системным саркоидозом, резистентным к кортикостиероидам [11].

Для нашего исследования были выбраны антибиотики широкого спектра действия с хорошим проникновеним в кожу. Продолжительность лечения была выбрана равной 6 месяцам, поскольку известно, что микобактериальная и хроническая стафилококковая инфекции требуют длительного лечения. Два антибиотка с синергетическим эффектом использовались, чтобы избежать потенциальной резистентности к антибиотикам. Также, антибиотики должны были иметь минимальный профиль побочных эффектов. По этим причинам, мы выбрали новые макролиды, такие как кларитромицин и азитромицин и хинолоны, такие как ципрофлоксацин. Наше исследование не получило никаких убедительных результатов, доказывающих бактериальное происхождение кожного саркоидоза. Хотя было проанализировано всего 3 случая, результаты лечения антибиотиками были неутешительными. Пациент с уродующими повреждениями на лице имел небольшое изменение цвета бляшек, которое вероятно было связано со спонтанной эволюцией повреждений, поскольку ранее она также замечала подобные события. Напротив, пациент 1 имел ухудшение кожных повреждений в конце терапии.

Может быть предложено несколько объяснений этих результатов. Во-первых, саркоидоз может быть не связан с бактериальной инфекцией. Во-вторых, саркоидоз может быть вызван бактериями, резистентными к антибиотикам. В-третьих, небольшое улучшение кожных повреждений можно объяснить противовоспалительным действием антибиотиков. Известно, что кларитромицин и ципрофлоксацин имеют противовоспалительные и имммуномодулирующие свойства [12, 13]. Эти свойства антибиотиков используются, например, при лечении атеросклероза [14, 15]. Поэтому, действие антибиотиков особенно трудно понять при болезнях, подобных саркоидозу, где связь между патогеном и развитем болезни остается неясной.

Поиск 16S рРНК - один из наиболее универсальных методов для обнаружения различных бактерий в небольшх образцах ткани [6, 7]. Этот метод способен идентифицировать многие микроорганизмы, например обнаружения человеческого вируса герпеса 8 (HHV-8) в повреждениях при саркоме Капоши. Результаты поиска микобактериальной ДНК в саркоидных повреждениях остаются спорными [16]. В саркоидных тканях производился поиск ретровирусов [17] и HHV-8 [18]. Недавно, Ishige с коллегами [19] обнаружили Propionibacterium sp. в саркоидных лимфатических узлах. Мы обнаружили смешанные бактериальные последовательности, возможно соответствующие загрязнению кожными сапрофитами. Большинство кожных образцов до и после лечения а также контрольные образцы, показали последовательности, характерные для зооглеи.