Eur Respir J 2003; 21:414-420

Изменения в бронхоальвеолярном лаваже при саркоидозе

F. Sabounchi-Schutt, J. Astrom, U. Hellman, A. Eklund and J. Grunewald
Dept of Medicine, Karolinska Institute, Division of Respiratory Medicine, Lung Research Laboratory, Karolinska Hospital, Stockholm, and Amersham Biosciences and Ludwig Institute for Cancer Research, Uppsala, Sweden

Реферат

При саркоидозе, воспалительной болезни легкого, профиль белков в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) изменен. Чтобы иследовать изменения в БАЛ при саркоидозе, были проанализированы образцы БАЛ шести пациентов и четырех здоровых индивидуумов используя электрофорез в полиакриламидном геле.

Мы обнаружили значительно более высокий уровень белков в диапазоне pH 5.5-6.7 у пациентов с саркодозом по сравнению с группой (472 против 384). Кроме того, уровень белков у пациентов был значительно уменьшен в диапазоне pH 4.5-5.5 (399 против 518). Измерение оптической плотности в геле показало изменение уровней экспрессии нескольких белков. Семнадцать изменений были идентифицированы, о семи белках ранее для БАЛ не сообщалось. Многие из их - неплазменные белки, вовлеченные в воспалительные и окислительно-восстановительные процессы.

Содержание белка в БАЛ у пациентов с саркоидозом изменено, особенно для неплазменных белков. Описанный подход в будущем может быть использован для определения всех изменений в белковом составе БАЛ при саркоидозе и может дать возможность идентифицировать болезнь-специфические белки.

Саркоидоз - системная гранулематозная болезнь, которая чаще всего воздействует на легкие и лимфатическую систему. Причина болезни все еще остается неизвестной. Однако, определенный прогресс был достигнут в терминах понимания уникальных клинических, иммунологических и патологических особенностей саркоидоза. Меньше известно относительно специфичных белков и различных вариантов белков, которые могут вносить вклад в развитие и экспрессию болезни. Классический инструмент для изучения белков - бронхоскопия с бронхоальвеолярным лаважем. Бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ) позволяет получить материал из дыхательных путей, который может быть использован и для диагностических и исследовательских целей. Исследование растворимых субстанций и секреторных протеинов в БАЛ внесло вклад в понимание патогенеза саркоидоза и других воспалительных болезней легкого (1-3). Многочисленные исследования описали клеточные компоненты БАЛ при саркоидозе (1, 4, 5). Однако, полный состав белков в БАЛ все еще остается неизвестным.

Недавние исследования БАЛ показали, что электрофорез в полиакриламидном геле может быть полезен для исследования изменений в экспрессии белков у пациентов с различными болезнями легкого (6-9). Это мощный метод, способный демонстрировать распределение белков в органе без требования детального знания об индивидуальных белках. Этот метод позволяет разделять белки в сложных биологических образцах, таких как БАЛ. Ранее мы сообщили об обнаружении и идентификации БАЛ-специфических белков у здоровых индивидуумов (10). Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы установить полный паттерн белков в БАЛ при саркоидозе и исследовать изменения экспрессии белков, связанные с этой болезнью. Мы использовали узкий диапазон градиентов pH, что максимизирует разрешающую способность и облегчает последующую процедуру идентификации белков, используя масс-спектрометрию. В исследование были включены шесть пациентов с саркоидозом с синдромом Лёфгрена и четыре здоровых индивидуума в группе контроля.

Группа исследования

Был исследован БАЛ шести пациентов с саркоидозом и четырех здоровых индивидуумов. Все участники исследования были привлечены из Karolinska Hospital (Stockholm, Sweden). Исследование было одобрено этическим комитетом и информированное согласие было получено у всех участников. Все пациенты имели острое начало саркоидоза с синдромом Лёфгрена, включая двустороннюю грудную лимфаденопатию, лихорадку, артралгию голеностопного сустава и/или узловатую эритему. Кроме того, все пациенты имели увеличенное отношение CD4/CD8 в БАЛ. Три пациента имели положительную биопсию (пациенты 3, 4 и 5). Здоровые индивидуумы имели нормальную рентгенограмму легких и без любых признаков респираторных болезней и других воспалительных или инфекционных болезней.

Результаты

Пациенты по сравнению с группой контроля имели более высокую концентрацию клеток в БАЛ, большее количество лимфоцитов и значительно увеличенное отношение CD4/CD8. Концентрация белка в БАЛ была значительно увеличена (p < 0.01) у пациентов (134 µg/mL (диапазон 124-168)) по сравнению с группой контроля (68.0 µg/mL (57.5-76.0)).

Паттерн белков в БАЛ

Первоначально, мы использовали широкий диапазон градиентов pH 3-7, 6-9 и 4-7 для разделения белков БАЛ. Для каждого интервала pH были выполнены по крайней мере два параллельных эксперимента. Самое высокое количество белков было обнаружено в диапазоне 4.5-6.7, приблизительно пятая часть в диапазоне 6-9 и очень мало в диапазоне ниже pH 4.0. Эти результаты согласуются с предыдущими сообщениями (10). На основании этих наблюдений, авторы решили сосредоточиться на интервале 4.5-6.7, используя более узкие диапазоны 4.5-5.5 и 5.5-6.7.

В группе контроля большее количество белка было обнаружено диапазоне 4.5-5.5 по сравнению с диапазоном 5.5-6.7, в то время у пациентов с саркоидозом такая тенденция не была очевидной. Имелось значительные различия в диапазоне 5.5-6.7 между пациентами по сравнению с группой контроля (472 (440-625) против 384 (331-416); p < 0.05), и диапазоне 4.5-5.5 (399 (359-418) у пациентов с саркоидозом против 518 (485-598) в группе контроля; p < 0.05).

Идентификация белков в бронхоальвеолярном лаваже

Чтобы идентифицировать различия между пациентами с саркоидозом группой контроля, был выбран 21 белок, по которым наблюдались максимальные различия. Семнадцать из этих белков были идентифицированы. Семь из идентифицированных белков по данным авторов, ранее не были описаны при аналогичных исследованиях БАЛ: ингибитор нейтрофильной эластазы, кальцифосфин, бета-галактозидаза-связывающий лектин, альдегид дегидрогеназа I, катепсин H, антиоксидантный протеин II и альдегид редуктаза. Два белка ранее не были описаны. Еще два белка не были достоверно идентифицированы.

Обсуждение

Пациенты, включенные это исследование, имели острый саркоидоз с синдромом Лёфгрена. Клеточный состав БАЛ этих пациентов показал, как и ожидалось, увеличенное отношение CD4/CD8 и увеличение числа лимфоцитов. Полная концентрация белка у пациентов с саркоидозом была значительно увеличена.

Уровни как минимум 12 белков были значительно уменьшены у пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля. В число этих 12 белков входили антиоксидантные белки, которые могут быть важны при остром саркоидном воспалении. Уменьшенный уровень этих белков может быть индикатором дисбаланса оксиданты/антиоксиданты при этой болезни. Кроме того, уровни двух белков, идентифицированные в этом исследовании, вовлеченых в окислительные процессы (альдегид дегидрогеназа I и альдегид редуктаза) также были уменьшены у пациентов с саркоидозом.

Один из недавно идентифицированных белков, представленных в этой работе - ингибитор нейтрофильной эластазы (NEI), который регулирует активность нейтрофильной эластазы, протеазы, катепсина G и протеиназы. Вероятная роль NEI заключается в регулировании активность протеазы и предотвращении повреждения ткани фагоцитирующими клетками (26, 27). Таким образом, защита от свободной NE, индуцированная NEI, значительно уменьшена при саркоидозе. Уменьшенный уровень аннексина I также может отражать состояние защитной функции NEI от свободной NE. Аннексин I, обычно присутствует в высокой концентрации на эпителиальной поверхности здорового легкого и в БАЛ и имеет мощную противовоспалительную активность (28). Деградация этого белка наблюдалась в БАЛ пациентов с различными болезнями легкого (29, 30). Эта деградация управляется нейтрофильной эластазой (31, 32), предполагая возможную связь между аннексином I и NEI.

Среди белков, уровни которых уменьшены в БАЛ пациентов с саркоидозом, был обнаружен кальцифосфин, который вовлечен в рост и дифференцирование клеток и может регулировать функции клеток, такие как пролиферация и дифференцирование (33). Уменьшенные уровни этого белка могли бы вызывать ингибирование этих процессов.

Ранее было выполнено несколько аналогичных исследований белков БАЛ при саркоидозе (9, 34, 35). Только одно из этих исследований сравнило БАЛ пациентов с саркоидозом с БАЛ здоровой группы контроля (9). Wattiez (9) сообщил, что экспрессия нескольких белков отличилась при саркоидозе по сравнению с группой контроля. Хотя несколько из этих белков также были также обнаружены в настоящем исследовании (бета 2 микроглобулины и белок клеток Клара), экспрессия большинства остальных белков не была одинаковой. Различные методики проведения эксперименттов не дают возможности провести точное сравнение результатов этих исследований.

В этом исследовании мы обнаружили изменение уровней экспрессии 21 белка, 17 из которых были идентифицированы. Уроовни 12 из 17 идентифицированных белков были значительно уменьшены у пациентов с саркоидозом. Большинство идентифицированных белков находились в диапазоне 4.5 < ph < 6.7 и имели низкий молекулярный вес (< 30 kD). Кроме того, мы идентифицировали семь новых неплазменных белков, о которых ранее не сообщалось в аналогичных исследованиях. Данные двух белков не соответствовали любым известным белкам и они были определены как неизвестные. Изменения белкового паттерна, наблюдаемые в этом исследовании, совместимы с эффектами воспалительных процессов, окислительными, противовоспалительными процессами и регулированием разнообразных клеточных процессов, связанных с пролиферацией. Однако, точная роль некоторых идентифицированных белков остается неизвестной.