Eur Respir J 2003; 22:748-754

Мутации гена CARD15 при саркоидозе

M. Schurmann, R. Valentonyte, J. Hampe, J. Muller-Quernheim, E. Schwinger and S. Schreiber Institute of Human Genetics, University of Lubeck, Lubeck, Dept of General Internal Medicine, Christian-Albrechts-Universtitat Kiel, Kiel, and Dept of Pneumology, Medical University Hospital Freiburg, Freiburg, Germany

Реферат

Саркоидоз, синдром Блау и болезнь Крона - сложные болезни, характеризованные гранулематозным воспалением, воздействующим на различные органы. Было показано, что мутации гена CARD15 на хромосоме 16, вносят значительный вклад в развитие болезни Крона и синдрома Блау. Эти факторы побудили авторов изучить мутации гена CARD15 при саркоидозе.

Было генотипировано 138 семей, включая 302 пациентов с саркоидозом и 127 пациентов без истории семейного саркоидоза (вместе с их родителями), для четырех полиморфизмов CARD15, связанных с увеличенным риском болезни Крона. Кроме того, часть гена, мутации в которой предрасполагают к синдрому Блау, была секвенирована у 39 пациентов из 39 семей с саркоидозом у родных братьев/сестер, имевших общую родительскую хромосому 16s и у 8 пациентов из семей с несколькими случаями саркоидоза. Ни одна из известных мутаций синдрома Блау и никаких новых полиморфизмов при саркоидозе найдены не были. Наблюдалась увеличенная частота редкой аллели полиморфного участка 802C > T (SNP5) и 2722G > C (SNP12) в по крайней мере одной из двух исследованных групп.

Мутации гена CARD15, которые являются важными при болезни Крона и синдроме Блау, не играют главной роли при саркоидозе. Однако, эти мутации могут иметь минорную важность, особенно у пациентов без истории семейного саркоидоза.

Саркоидоз, синдром Блау и болезнь Крона - сложные болезни. Они связаны с хроническим воспалением и имеют определенное перекрытие иммунопатофизиологии и паттерна вовлечения органов. И саркоидоз и болезнь Крона характеризованы усилением иммунного ответа на пока неизвестный антиген, с активацией моноцитов, T-клеток и формированием гранулем в вовлеченных органах (1-3). Основными участками вовлечения при саркоидозе и болезни Крона являются легкие и кишечник, соответственно, где может происходить контакт с экзогенным агентом. Обе болезни наиболее распространены у молодых взрослых, с небольшим преобладанием женщин. Заболеваемость для саркоидоза в Европейских популяциях составляет ~10-20 на 100,000 (4), для болезни Крона ~15-50 на 100,000 (5), со значительными региональными различиями. При обеих болезнях наблюдается семейная группировка, примерно в каждых 5 из 100 семей (5-9). Сосуществование болезни Крона и саркоидоза в одной семье или даже у одного пациента, происходит более часто, чем ожидалось при случайном совпадении болезней (9). Вовлечение кожи, глаз, суставов и других органов, которое может происходить при саркоидозе, также может наблюдаться при болезни Крона.

Синдром Блау, редкая наследственная болезнь, характеризуется гранулематозным артритом, увеитом и эритемой (10). Он вызван мутацией единственного гена и происходит в раннем детстве. На основании подобия клинических проявлений предполагалось, что синдром Блау - моногенный вариант саркоидоза раннего начала. Ген синдрома Блау был картирован вблизи центромеры хромосомы 16 с помощью анализа сцепления в семье с несколькими случаями болезни (11). Ген восприимчивости к болезни Крона был картирован в локусе (IBD1) в том же самом регионе в нескольких исследованиях больших групп родных братьев/сестер (сибсов), страдающих от болезни Крона (12-14).

В нескольких независимых исследованиях было продемонстрировано, что различные аллели гена CARD15 (также известен как NOD2), связаны с болезнью Крона (15-17), со значительной корреляцией гентип/фенотип и с относительным риском развития, достигающим 23.4 (18-20). Ген CARD15 находится на длинном плече хромосомы 16 вблизи центромеры (16q12). Белок CARD15 состоит из двух доменов привлечения каспазы (CARD), нуклеотидов домена олигомеризации (NOD) и повторов, содержащих лейцин (LRR). Важной функцией CARD15 может быть активация ядерного фактора NF-kappaB в ответ на возбуждение микробными липополисахаридами. Высокая активность NF-kappaB - характерная особенность болезни Крона (21) и саркоидоза (22). Было предположено, что полиморфизм единственного нуклеотида (SNP) в пределах LRR, может изменять активацию NF-kappaB в ответ на липополисахариды. Альтернативно, мутации гена CARD15 могут влиять на регулирование апоптоза клеток (23). Впоследствии, мутации гена CARD15 были обнаружены в семьях с синдромом Блау (24, 25). Однако, в то время как связанные с болезнью Крона мутации гена CARD15 расположены в регионе LRR, мутации гена CARD15 при синдроме Блау были найдены в регионе NOD. Определенное подобие и перекрытие симптомов саркоидоза, синдрома Блау и болезни Крона, указывают на необходимость исследования полиморфизмов гена CARD15 при саркоидозе.

Пациенты

Были исследованы 3 группы: 1) семьи с двумя или более членами, страдающими от саркоидоза (''семейный саркоидоз''); 2) пациенты с саркоидозом без истории семейного саркоидоза вместе с их родителями (''саркоидное трио''); и 3) здоровые индивидуумы в группе контроля, согласованные с пациентами с саркоидозом по полу и возрасту. Всего в исследование было привлечено 302 пациента с саркоидозом (135 мужчин, 167 женщин; средний возраст при включении в исследование 51±13.1 лет, средний возраст при постановке диагноза 35±11.3 лет, диапазон 12-73 лет) и 153 близких родственников без саркоидоза (64 мужчины, 89 женщин).

Первая группа (''семейный саркоидоз'') включала 138 немецких белых семей, включая 66 семей с двумя или тремя родными братьями/сестрами с саркоидозом, 41 семью с одним родителем и ребенком с саркоидозом, 19 семей с двумя или более пациентов с саркоидозом с более отдаленным родством и 12 семей (44 пациент) с более чем двумя пациентами и более сложной родственной структурой.

Пациенты второй группы (''саркоидное трио'') включались в исследование, если диагноз был доказан гистологически (за исключением двух пациентов с классическим синдромом Лёфгрена) и оба родителя пациента согласились участвовать в исследовании. Эта группа состояла из 127 пациентов (белые из Германии; 49 мужчин, 78 женщин; средний возраст при включении в исследование 34±6.8 лет, средний возраст при постановке диагноза 33±6.9 лет, диапазон 11-51 лет) и 254 их родителя без саркоидоза. Группа контроля включала 265 здоровых немецких белых доноров крови, привлеченных через Dept of Transfusion Medicine at the Kiel University Hospital, Kiel, Germany (118 мужчин, 147 женщин; средний возраст при включении в исследование 51±8.2 лет).

Большинство пациентов были привлечены через группу поддержки немецких пациентов с саркоидозом, другие - из специализированных клиник. Все пациенты интервьюировались по телефону относительно их истории саркоидоза и структуры семьи. У всех пациентов и их врачей проводился анкетный опрос для получении информации о диагнозе и курсе болезни. Саркоидоз имел гистологическое подтверждение в 209 из 302 случаев в группе ''семейный саркоидоз'' и в 125 из 127 случаев в группе ''саркоидное трио''. Клинический курс у остальных пациентов был совместим с диагнозом саркоидоз. Все участники исследования дали письменное информированное согласие.

Результаты

Исследования SNP

1,011 индивидуумов из трех групп исследования (''семейный саркоидоз'', ''саркоидное трио'' и группа контроля) были генотипированы для четырех полиморфизмов CARD15, связанных с болезнью Крона: SNP5, SNP8, SNP12 и SNP13. Наблюдаемые размеры генотипов находились в согласии с ожидаемыми согласно закона Харди-Вайнберга (биномиальное распределение частот встречаемости аллелей диаллельного гена в свободно скрещивающейся популяции). Группа контроля в этом исследовании была частью северо-европейской популяции в исследовании структуры мутаций гена CARD15 (29), которое показало сильную неравновесность сцепления между SNP5, SNP8, SNP12 и SNP13.

Были выполнены три различных типа анализа данных: сравнение случай-контроль, анализ сцепления и анализ семейной ассоциации. Сравнение частот SNP в группе контроля, состоявшей из 265 индивидуумов и 265 пациентов с саркоидозом (138 пациентов из 138 семей группы ''семейный саркоидоз'', один пациент случайно выбирался из каждой семьи и 127 пациентов из 127 семей группы ''саркоидное трио'') показало значительно (p < 0.05) увеличенные частоты SNP5 аллель 1 и SNP12 аллель 1 у пациентов с саркоидозом. Обе группы пациентов с саркоидозом имели увеличение частоты SNP12, но только пациенты группы ''семейный саркоидоз'' имели существенное увеличение SNP5 аллель 1. Частоты SNP5 и SNP12 генотипов различались у пациентов с саркоидозом и в группе контроля.

Анализ сцепления, выполненный как исследование сибсов с саркоидозом, не показал существенного увеличения частоты любого из изучаемых SNP на хромосомах, общих у сибсов с саркоидозом (27). Лучший показатель непараметрического сцепления 0.41 (p=0.33) был получен для SNP12, но информационный контент биаллельных полиморфизмов был низким (лучший показатель 0.23 для SNP5). Если гаплотипы четырех смежных SNP рассматривались при многоточечном анализе сцепления, показатель непараметрического сцепления был 0.16 (p=0.43; информационный контент 0.3). В 6 из 10 семей с больше чем двумя вовлеченными сибсами, редкие мутации CARD15, SNP8, SNP12 или SNP13, были найдены по крайней мере у одного пациента (10 из 33 пациентов). Однако, в 5 из 6 семей, не наблюдалось косегрегации мутации CARD15 с саркоидозом. Фактически, единственный пациент, гомозиготный для редкой SNP13 аллели, имел двух родных братьев с саркоидозом, у которых не было обнаружено мутаций CARD15.

Анализ семейной ассоциации был выполнен как исследование смещения передаваемого соотношения, проверяющее степень отклонения от случайного передачи SNP аллелей от гетерозиготных родителей потомству. Были исследованы 109 троек (оба родителя и ребенок) из группы ''семейный саркоидоз'' и 127 троек из группы ''саркоидное трио''. В группе ''семейный саркоидоз'' не наблюдалось смещения передаваемого соотношения, ни для отдельного SNP, ни для гаплотипов. В отличие от этого, передача SNP5 аллеля была нарушена в группе ''саркоидное трио'', с предпочтительной передачей аллеля 1 и уменьшенной частотой передачи аллеля 2 от гетерозиготных родителей детям с саркоидозом.

Чтобы изучить возможную связь с возрастом при постановке диагноза, пациенты были разделены на подгруппы с диагнозом саркоидоз, установленным до возраста 32 года (72 пациента из группы ''семейный саркоидоз'' и 56 пациентов из группы ''саркоидное трио'') или более 32 лет (66 пациентов из группы ''семейный саркоидоз'' и 71 пациентов из группы ''саркоидное трио''). Сравнение этих подгрупп не показало никаких существенных различий по частоте SNP аллелей или частоте генотипов. Кроме того, пациенты с меньшим возрастом при постановке диагноза были выделены в каждой из 138 семей (138 индивидуумов, средний возраст при постанове диагноза 30±8.2 года, диапазон 12-58 лет), также как и пациенты с большим возрастом при постановке диагноза (138 индивидуумов, средний возраст при постановке диагноза 41±11.6 лет, диапазон 22-73). У этих пациентов также не было обнаружено никаких существенный различий по частоте SNP аллелей или частоте генотипов. Анализ смещения передаваемого соотношения в различных возрастных подгруппах, показал, что передача более редких аллелей SNP5, SNP8 и SNP12 происходила в основном из-за вклада пациентов из группы ''саркоидное трио'', диагностированных в возрасте более 33 лет. В этой подгруппе, отношение частоты передачи SNP5 аллели 1 к частоте отсутствия передачи была 35/20 (p=0.04), по сравнению с 25/19 (p=0.37) в группе пациентов с более ранним началом саркоидоза. Имелись пять троек, пациенты в которых были диагностированы в возрасте более 33 лет, и которым была передана SNP13 аллель. Во всех этих пяти тройках, редкая аллель 1 была передана пациенту.

Анализ SNP в домене олигомеризации

У 39 пациентов (из 39 семей), имевших общую родительскую хромосому 16 со своими сибсами, ни одна из известных мутаций синдрома Блау и никаких новых мутаций в экзоне 4 обнаружено не было. Тот же самый результат был получен у 8 пациентов, представляющих 7 семей, с более чем двумя пациентами в семье, которые не имели общей родительской хромосомы 16. Анализ последовательности нуклеотидов у этих пациентов показал, что частоты известных полиморфных участков SNP5, SNP6 и SNP7 экзона 4 не отличались от группы контроля.

Обсуждение

Саркоидоз и болезнь Крона - мультифакторные болезни, которые вызваны наследственной восприимчивостью и дополнительным влиянием экзогенных агентов (1-3). Напротив, при синдроме Блау очевидно влияние единственного доминирующего гена, поскольку эта болезнь подчиняется менделевским законам наследования, хотя пока еще неизвестные факторы значительно изменяют экспрессию болезни в различных семьях (10, 11). Моногенное наследование позволило произвести локализацию гена синдрома Блау в центромерном регионе хромосомы 16 при исследовании одной семьи (11). Для подтверждения существования гена, ответственного за развитие болезни Крона, было необходимо исследование большего числа семей с болезнью (12-14), и эта стратегия привела к идентификации мутаций гена CARD15, как основного фактора восприимчивости к болезни Крона (15-17). При саркоидозе, информация о поиске сцепления во всем геноме, пока ограничена одним сообщением (28), показавшем основной пик в главном комплексе гистосовместимости на коротком плече хромосомы 6, что находится в согласии с результатами многочисленных исследований генов-кандидатов (30-32). Однако, этот пик не может полностью объяснить увеличенный риск семейной болезни, обнаруженный в различных исследованиях Европейских популяций (6, 7, 9) и в США (8). Скорее всего, за развитие саркоидоза ответственны несколько генетических факторов.

Также важным подходом является анализ генов-кандидатов. Однако, гетерогенность саркоидоза, представляющая переменное влияние различных генетических и этнических факторов, может объяснять противоречивые результаты таких исследований (31). Поиск генов-кандидатов, которые могут вносить вклад в восприимчивость к саркоидозу, продолжается. В настоящее время, внимание сосредоточено на генах, которые участвуют в регулировании иммунного ответа, начиная с реакции на ингаляционный микробный триггер, заканчивая сбалансированным клеточным иммунным ответом (33).

Увеличенные уровни NF-kappaB играют важную роль в развитии и поддержании воспаления при болезни Крона (21). Так как функция белка CARD15 включает регулирование уровней NF-kappaB, мутации гена CARD15 у пациентов с болезнью Крона объясняют важную связь воздействия предполагаемого экзогенного агента с гранулематозным воспалением кишечника и других органов. Увеличенные уровни NF-kappaB также были обнаружены при саркоидозе (22) и сообщалось о семейной группировке саркоидоза и болезни Крона (9), предлагая схожесть патофизиологических механизмов обеих болезней.

Синдром Блау - редкая болезнь, с малым числом сообщений в литературе. До настоящего времени, не имеется никаких детальных исследований патофизиологии синдрома Блау и первое сообщение о генетике этой болезни было основано на исследовании четырех несвязанных семей (24). Все пациенты в этих семьях имели мутацию в домене NOD гена CARD15. В трех семьях, наблюдалась замена одной аминокислоты в NOD - замена аргинина в позиции 334 (R334Q и R334W) и еще в двух семьях была найдена идентичная точечная мутация (1001G > C, R334Q). Ранее, эти результаты были подтверждены обнаружением мутаций CARD15 в 5 из 10 несвязанных семьях (25), с R334Q и R334W в 3 и 2 семьях, соответственно. Поэтому, мутации при синдроме Блау происходят только кластерами в домене NOD, и мутации NOD и LRR связаны с различными фенотипическими последствиями в пределах широкого спектра гранулематозных болезней, ведя к развитию синдрома Блау или к существенному увеличению риска болезни Крона, соответственно.

Принимая во внимание значительное перекрытие клинических проявлений саркоидоза, синдрома Блау и болезни Крона и сосуществование саркоидоза и болезни Крона у пациентов и в семьях, ген CARD15, связанный с патогенезом синдрома Блау и болезни Крона, может рассматриваться как перспективный ген-кандидат восприимчивости к саркоидозу.

Имеется предварительная информация относительно гена синдрома Блау при саркоидозе. Rybicki с коллегами (34) проанализировали 33 чернокожих семьи с 67 родными братьями/сестрами с саркоидозом. При изучении центромерного региона хромосомы 16 с помощью восьми полиморфных маркеров, они не обнаружили сцепления. Однако, значительные различия заболеваемости, паттерна вовлечения органов и клинических проявлений саркоидоза у чернокожих и белых (1, 8), указывают на гетерогенность саркоидоза в этих этнических группах, и поэтому выводы этого исследования, могут не иметь силы для белых. 63 белых семьи ранее были частью исследования, в котором производилось сканирование всего генома, чтобы локализовать гены предрасположенности к саркоидозу с помощью набора микросателлитных маркеров (28). Локус D16S3396 из использованного набора микросателлитных маркеров, расположен близко к гену CARD15, на расстоянии приблизительно 0.6x10⁶ пар оснований. Не имелось никаких существенных свидетельств (p=0.21), что родные братья/сестры с саркоидозом, имели тенденцию иметь идентичный регион хромосомы 16, как ожидалось бы в случае основного вклада гена CARD15 в этиологию саркоидоза.

Однако, эти данные не исключают участия мутаций гена CARD15 в некоторой группе пациентов с саркоидозом. Если мутации гена CARD15 вносят вклад в саркоидоз только в части семей, эти мутации возможно должны находиться на хромосоме 16, которую сибсы с саркоидозом унаследовали от одного из родителей. Мы проанализировали регион гена CARD15, измененный при синдроме Блау и исключили мутации ранее неизвестных участков в группе пациентов, которые имели родительскую хромосому 16s. Это не может исключать минорное влияние редких вариантов NOD при саркоидозе, но это вклад должен происходить по крайней мере у белых пациентов, что маловероятно, так как если бы влияние этого гена было бы связано с развитием саркоидоза во всех семьях, он был бы легко обнаружен в исследовании, подобном нашему.

Чтобы обнаружить минорный вклад полиморфизмов гена CARD15 в этиологию саркоидоза, необходимы более крупные исследования. За исключением SNP13, более редкие аллели имели тенденцию быть более частыми у пациентов, чем в группе контроля и различие было существенным для SNP5 в группе ''семейный саркоидоз'' и для SNP12 в группе ''саркоидное трио''. Частоты аллелей SNP5, SNP8 и SNP12 в группе контроля находились в согласии с частотами, полученными в большом Европейском исследовании болезни Крона (18), хотя частота SNP13 аллеля в нашем исследовании была значительно выше (3.6 против 2 %). Немецкая группа контроля, включенная в другое исследование болезни Крона, показала даже более высокую частоту SNP13 аллеля 1 - 5.3 % (16). При генотипировании расширенной группы контроля, часть которой затем была исключена из-за молодого возраста при согласовани группы контроля по возрасту, известно, что частота SNP12 аллеля 1 в согласованной группе контроля была относительно низкой. Поэтому, эти существенные различия могут частично быть происходить из-за процедуры подбора группы контроля.

Для преодоления ограничения исследований дизайна случай-контроль при исследовании сложных болезней, были разработаны стратегии, подобные тесту смещения передаваемого соотношения (35). В этом исследовании наблюдалась сильная неравновесность сцепления между SNP. Редкие аллели SNP8, SNP12 и SNP13 наблюдаются практически исключительно в комбинации с SNP5 аллелем 1. В группе ''саркоидное трио'', все гаплотипы с редкой аллелью, по крайней мере с одним из четырех SNP, предпочтительно передавались от гетерозиготных родителей детям с саркоидозом, хотя это отклонение не было статистически значимым. Однако, наблюдалась существенная частота не передачи гаплотипа, составленного из четырех более обычных аллелей. Интересно, что передача аллелей и гаплотипов была почти абсолютна сбалансирована в группе ''семейный саркоидоз'', и этот факт может указывать на гетерогенность генетической этиологии саркоидоза при рассмотрении участия вариантов гена CARD15.

Результаты нашего исследовании исключают главную роль мутаций гена CARD15, которые имеют важное значение при болезни Крона и синдроме Блау, в патогенезе саркоидоза у белых пациентов. Это демонстрирует генетическую гетерогенность гранулематозных воспалительных болезней, хотя клинические фенотипы и иммунопатофизиология болезней имеют существенное перекрытие. Минорый вклад варианов гена CARD15 не может быть исключен, хотя это маловероятно, за исключением SNP12 аллеля 1.