Eur Respir J 2002; 20:1206-1212

Экспрессия хемокинов CC и C при легочном саркоидозе

M. Petrek, V. Kolek, J. Szotkowska and R.M. du Bois
Depts of Immunology and2 Respiratory Medicine, Palack University and University Hospital, Olomouc, Czech Republic. Interstitial Lung Disease Unit, Royal Brompton Hospital, London, UK

Реферат

Хемокины RANTES (регулятор активации, T-клеточной экспрессии и секреции; CC хемокин CCL-5 и воспалительный белок моноцитов MIP-1alpha (CCL-3)) участвуют в развитии альвеолита при легочном саркоидозе. Новые хемокины SCM -1alpha (XCL-1) и CCL-2 - также являются хемоаттрактантами мононуклеарных клеток и являются альтернативными кандидатами в медиаторы альвеолита. Поэтому, экспрессия MCP-1 и SCM-1alpha была исследована вместе с экспрессией RANTES и MIP-1alpha в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) пациентов с саркоидозом и в группе контроля. Также была исследована связь между экспрессией хемокинов и клиническим курсом саркоидоза.

Экспрессия mRNA для всех четырех хемокинов была определена с помощью полуколичественной ПЦР РНК, извлеченной из клеток БАЛ (17 пациентов, 12 группа контроля). Уровни RANTES, MIP-1alpha и MCP-1 в БАЛ были измерены с помощью иммуносорбентного анализа с применением фиксированных ферментов (60 пациентов, 17 группа контроля).

Экспрессия mRNA MCP-1, RANTES и SCM-1alpha были увеличены при саркоидозе, особенно у пациентов с серьезной болезнью. Уровни MCP-1 были увеличены в БАЛ пациентов с саркоидозом. Уровни MCP-1 сильнее всего были увеличены у пациентов с рентгенографической стадией 2 и у пациентов с персистирующей и рекуррентной болезнью.

MCP-1 и SCM-1alpha связанны с развитием альвеолита при саркоидозе и их экспрессия параллелльна курсу болезни.

Саркоидоз - мультисистемная гранулематозная болезнь, наиболее часто воздействующая на легкие, вследствие накопления CD4+ T-лимфоцитов и макрофагов, что ведет к формированию гранулем (1). Хотя при саркоидозе просходит пролиферация лимфоцитов (2), альвеолит - в значительной степени результат привлечения лимфоцитов и моноцитов из кровообращения (3). Этот процесс характеризован активизацией молекул адезии, рецепторов и лигандов хемокинов (3). Хемокины, полипептиды с низким молекулярным весом, имеют мощное влияние на специфические популяции лейкоцитов (5). Хемокины вовлечены в развитие альвеолита и формирование саркоидной гранулемы (3).

Согласно биохимической структуре, хемокины разделены на четыре группы: CXC, CC, C и CX3C (3). В пределах этой довольно широкой номенклатуры, различным лигандам хемокинов присвоены различные номера (7). Функциональные свойства RANTES заставляют мононуклеарные клетки перемещаться к легким. RANTES, in vitro хемоаттрактант T-клеток, преимущественно привлекает CD45R0+ T-клетки памяти, число которых увеличено в легких пациентов с саркоидозом (8). Хемокины MIP-1alpha и MCP-1, привлекающие моноциты, впоследствии были охарактеризованы как мощные хемоаттрактанты T-клеток in vitro (9). SCM-1alpha является чистым хемоаттрактантом лимфоцитов (11).

Чтобы исследовать потенциальную роль этих хемокинов в развитии альвеолита при саркоидозе, авторы изучили экспрессию mRNA и белковые уровни в бронхоальвеолярных клетках и БАЛ пациентов с саркоидозом и сравнили их с группой контроля. Далее авторы исследовали, связана ли экспрессия хемокинов с клиническим курсом саркоидоза, рентгенографической стадией, разрешением / прогрессом болезни и потребностью в лечении.

Группа исследования

В первой части исследования, была выполнена оценка экспрессии mRNA хемокинов у бронхоальвеолярных клеток. Бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ) был выполнен согласно стандартному протоколу у 12 индивидуумов группы контроля (возраст 39.5±3.8 лет), семь мужчин, восемь некурящих, четыре курящих) и 17 пациентов с саркоидозом (возраст 44.8±2.2 лет, семь мужчин, 16 некурящих, один курящий); рентгенографическая стадия 1 (n=12), стадия 2 (n=4), стадия 3 (n=1). Диагноз саркоидоз был основан на типичных клинических особенностях вместе с обнаружением гранулем на гистопатологической экспертизе материалов биопсии легкого и был поддержан наличием CD4+ лимфоцитоза в БАЛ, согласно критериев ATS/ERS/WASOG(12).

Группа контроля состояла из индивидуумов, которые во время проведения исследования и впоследствии не имели клинических признаков воспалительного процесса легкого; они не имели никаких болезней легкого в их медицинской истории. Все они имели нормальную цитологию, иммунологию и микробиологию БАЛ.

Во второй части исследования, была исследована экспрессия хемокинов в супернатанте БАЛ. Материалы для исследования были доступны у 17 индивидуумов группы контроля (возраст 44.6±4.4 лет, 13 мужчин, 10 некурящих, семь курящих) и 60 пациентов с саркоидозом (возраст 45.5±1.5 лет, 26 мужчин, 56 некурящих, четыре курящих); рентгенографическая стадия 1 (n=35), стадия 2 (n=17), стадия 3 (n=3) и стадия 0 (n=5). Из 60 пациентов, 41 (68.3 %) нуждались в лечении кортикостероидами. Клинический курс саркоидоза (через 2 года с момента постановки диагноза) мог быть оценен у 54 из 60 (90 %) пациентов: 14 пациентов (26 %) имели ремиссию без лечения (категория 1), 26 пациентов (48 %) имели ремиссию после лечения (категория 2), 8 пациентов (15 %) имели персистирующую болезнь (категория 3); рецидивы болезни наблюдалось у 6 пациентов (11 %) (категория 4).

Все участники (пациенты и группа контроля) были из одного центра (University Hospital, Olomouc, Czech Republic). Исследование было одобрено комитетом по этике.

Результаты

Экспрессия mRNA хемокинов у клеток БАЛ

mRNA хемокинов RANTES, SCM-1alpha и MIP-1alpha была обнаружена во всех образцах, полученных у пациентов и группы контроля; mRNA MCP-1 была обнаружена у 88 % (15 из 17) пациентов и 75 % (9 из 12) группы контроля. Полуколичественный анализ показал существенное увеличение экспрессии mRNA RANTES (p=0.01) и SCM-1alpha (p=0.02) у клеток БАЛ у пациентов с саркоидозом. Имелась тенденция увеличения экспрессии mRNA MCP-1 у пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля. Не имелось никакого различия между уровнями mRNA MIP-1alpha у пациентов с саркоидозом и группой контроля.

Экспрессия mRNA хемокинов и серьезность саркоидоза

Экспрессия mRNA хемокинов не отличалась между пациентами категории 1 (n=12) и категории 2 (n=4) (RANTES mRNA: категория 1 1.00±0.26, категория 2 1.44±0.32, p=0.56; SCM-1alpha mRNA: категория 1 2.1±0.24, категория 2 2.00±0.26, p=0.76). Имелась тенденция увеличения экспрессии mRNA RANTES и особенно SCM-1alpha у пациентов, которые нуждались в лечении (Т+), по сравнению с пациентами, для которых лечение не было необходимым (Т-) (RANTES mRNA: T+ 1.48±0.15, T- 0.88±0.63, p=0.12; SCM-1alpha mRNA: T+ 2.24±0.24, T- 1.56±0.53, p=0.06). Экспрессия mRNA MCP-1 была выше у пациентов с более серьезной болезнью, но различие не было статистически значимым (T+ 0.63±0.09, T- 0.40±0.14, p=0.08). Экспрессия mRNA MIP-1alpha не была связана с курсом болезни.

Уровни хемокинов в БАЛ

Три из четырех хемокинов (MCP-1, MIP-1alpha, RANTES), исследованных на уровне mRNA, также исследовались на уровне иммунореактивных белков в несконцентрированном БАЛ. Уровни белка SCM-1alpha не были измерены из-за невозможности проведения ELISA. В то время как белок MIP-1alpha был обнаружен в только одном из 77 (1.3 %) образцов БАЛ, белок RANTES был обнаружен в 28 % (17 из 60) образцов, но не был обнаружен ни в одном из 17 образцов группы контроля. Белок MCP-1 был обнаружен в 70 % (42 из 60) образцов пациентов с саркоидозом и в 53 % (9 из 17) образцов группы контроля. Уровни MCP-1, но не уровни RANTES, коррелировали с экспрессией mRNA данного хемокина; коэффициент корреляции (MCP-1) rs=0.55, p=0.001.

Белковые уровни MCP-1 в БАЛ были значительно выше у пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля (пациенты 14.6±3.5 pg/mL; группа контроля 5.7±2.9 pg/mL; p=0.02). Для RANTES, имелась тенденция увеличения белковых уровней у пациентов, но это различие не было статистически значимым (p=0.08).

Чтобы идентифицировать клеточный источник MCP-1, он был идентифицирован в клетках БАЛ четырех пациентов с саркоидозом. Сильная экспрессия MCP-1 наблюдалось у альвеолярных макрофагов. Белок MCP-1 был также связан с лимфоцитами, однако, его экспрессия наблюдалась приблизительно у трети лимфоцитов БАЛ и была менее интенсивной, чем у макрофагов.

Уровни хемокинов и клинический курс саркоидоза

Белковые уровни MCP-1 были увеличены у пациентов с рентгенографической стадией 2 по сравнению с пациентами со стадией 1 болезни (стадия 1 (n =35) 9.8±3.7 pg/mL; стадия 2 (n=17) 40.5±7.8 pg/mL; p=0.003). Кроме того, белковые уровни MCP-1 в БАЛ коррелирорвали с клиническим курсом болезни: уровни MCP-1 у пациентов, чья болезнь была персистирующей или рекуррентной через 2 года (категории 3 и 4), были увеличены по сравнению с уровнями у пациентов с разрешением болезни (категории 1 и 2) (категории 3 и 4 (n=14) 26.7±9.5 pg/mL; категории 1 и 2 (n=40) 10.3±3.5 pg/mL; p=0.01).

Связь между экспрессией хемокинов и числом клеток БАЛ

Экспрессия mRNA хемокинов RANTES и SCM-1alpha коррелировала числом лимфоцитов в БАЛ. Экспрессия mRNA хемокинов также была увеличена, когда пациенты с увеличенной пропорцией лимфоцитов БАЛ (> 10 %) были сравнены с пациентами с низким (< 10 %) индексом лимфоцитов (RANTES, p=0.02; SCM-1alpha, p=0.01). Также наблюдалась связь между mRNA RANTES и SCM-1alpha и абсолютным и относительным числом CD4+ лимфоцитов (p < 0.01) и также между этими хемокинами и отношением CD4/CD8+ (p < 0.01). Белковые уровни MCP-1 коррелировали с числом лимфоцитов в БАЛ (p=0.02) и были увеличены у пациентов с более высокой пропорцией (> 10 %) лимфоцитов в БАЛ (p=0.001). Для RANTES, имелась связь белковыми уровнями и числом лимфоцитов в БАЛ, но связь не была статистически значимой. Данные для SCM-1alpha не были получены. Также была проверена связь между mRNA, белковыми уровнями, процентом и общим количеством бронхоальвеолярных макрофагов, нейтрофилов и эозинофилов, но никакой связи найдено не было.

Обсуждение

Накопление макрофагов и лимфоцитов в альвеолах пациентов с саркоидозом является следствием взаимодействия между молекулами адгезии, лигандами и рецепторами хемокинов (3). Настоящее исследование было направлено на экспрессию mRNA и, где это было возможно, на белковые уровни четырех членов семейства хемокинов CCL и XCL, главных кандидатов, ответственных за трафик мононуклеарных клеток в легкое. Было обнаружено, что активность CC хемокинов, RANTES и MCP-1, была увеличена у пациентов с саркоидозом, также наблюдалась увеличенная экспрессия mRNA SCM-1alpha. Усиление экспрессии хемокинов было наиболее очевидным у пациентов, у которых болезнь прогрессировала и была связана с лимфоцитарным альвеолитом.

Наиболее существенные результаты были получены для MCP-1. Экспрессия MCP-1 в БАЛ была изучена при интерстициальных болезнях легкого, но до недавнего времени чаще для фиброзирующего альвеолита (14-15), чем для саркоидоза (16). Увеличенные белковые уровни MCP-1 в БАЛ 60 пациентов с саркоидозом в нашем исследовании подтверждают данные исследования (17). Недавно ссобщалось об увеличении серологических уровней MCP-1 у пациентов с саркоидозом (18). Мы считаем, что системные уровни MCP-1 вероятно отражают суммарное поражение всего организма гранулемами, в то время как уровни в БАЛ могут отражать вовлечение легкого. Локализация MCP-1 в альвеолярных макрофагах согласуется с этой интерпретацией. В контексте вышеупомянутых рассуждений о роли MCP-1 в БАЛ, интересно отметить существенное увеличение белковых уровней MCP-1 в БАЛ пациентов с рентгенографической стадией 2 болезни а также при персистирующей и рекуррентной болезни. Увеличение экспрессии MCP-1 было параллельным и для mRNA и для белковых уровней, хотя данные относительно mRNA не были статистически значимы. Однако, присутствие белка необходимо для реализации его функции хемоаттрактанта, поэтому данные относительно существенного увеличения белковых уровней MCP-1 и их связь с курсом болезни уместны in vivo.

Данные, что экспрессия RANTES преимущественно наблюдается у макрофагов (20) и текущие данные относительно уровней RANTES в БАЛ позволяют предположить, что RANTES действительно секретируется клетками в бронхоальвеолярные пространства. Однако, несмотря на обнаружение параллельного увеличения mRNA и белковых уровней RANTES, эта связь не была статистически значимой. Iida с коллегами (21) обнаружил увеличение белковых уровней RANTES в концентрированном БАЛ 40 пациентов с саркоидозом. Поэтому возможно, что процедура, используемая в данным исследовании для измерения уровней RANTES была слишком чувствительна к фактору растворения. Это объяснение поддержано недавним сообщением (22). Альтернативно, наблюдаемые несоответствия между mRNA и белковыми уровнями RANTES могут происходить из-за возможного влияния посттрансляционных и посттранскрипционных механизмов регулирования, включая производство и метаболизм RANTES (23). Сложность трансляционных процессов и присутствие других модифицирующих факторов, например возможность внутриклеточной деградации, может искажать связь между mRNA и белковыми уровнями RANTES в БАЛ.

Экспрессия MIP-1alpha была увеличена у саркоидных альвеолярных макрофагов (25). Однако, мы и другие исследователи (21) не смогли обнаружить белок MIP-1alpha в БАЛ пациентов с саркоидозом. Метод ELISA, используемый в этом исследовании, имел низкий предел обнаружения и был способен обнаружить незначительные количества этого белка в супернатанте клеток БАЛ. Этот факт, вместе с данными, что mRNA MIP-1alpha была обнаружена, но ее экспрессия в клетках пациентов с саркоидозом не была значительно увеличена, говорят, что MIP-1alpha не вносит существенного вклада в привлечение лейкоцитов при саркоидозе.

SCM-1alpha (XCL-1) - хемоаттрактант T-лимфоцитов (CD8+) и естественных киллеров (11). Увеличение экспрессии mRNA SCM-1alpha в БАЛ и корреляция уровней SCM-1alpha с числом лимфоцитов говорит, что XCL-1 может быть другим хемокином, вовлеченным в привлечение лимфоцитов в легкое in vivo. Однако, необходимо лучше определить роль этого члена семейства хемокинов C в развитии альвеолита при саркоидозе и идентифицировать его клеточный источник.

Наше исследование показало, что экспрессия хемокинов в БАЛ может быть связана с клиническим курсом саркоидоза. У пациентов с серьезной болезнью (по оценке через 2 года), экспрессия mRNA RANTES, SCM-1alpha и MCP-1 имела тенденцию быть более высокой, чем у пациентов, у которых болезнь разрешилась спонтанно. Белковые уровни MCP-1 были заметно выше у пациентов с рентгенографической стадией 2 а также у пациентов, у которых болезнь персистировала или был рецидив через 2 года. Эти результаты возможно имеют практическую ценность; измерение белковых уровней хемокинов в БАЛ может быть маркерами для оценки вероятного прогресса болезни. Представленные данные позволяют предложить измерение MCP-1 в БАЛ в качестве такого маркера.

Недавно, было предположено, что хемокины IP-10 (CXCL-10) и RANTES совместно участвуют в формировании воспалительного инфильтрата при саркоидозе (30). Данные этого и других исследований (16-18) говорят, что в локальных и системных процессах при саркоидозе может участвовать более широкий спектр хемоаттрактантов и хемокинов, чем предполагается сейчас. Возможно, различные хемокины вместе с CC и C рецепторами, могут участвовать в различных стадиях болезни. Вопрос относительного вклада каждого хемокина в рамках этого исследования не мог быть решен, также авторы не могли проанализировать взаимодействия лиганд-рецептор хемокинов.

Необходимы дальнейшие исследования, чтобы разрешить пока оставшиеся без ответа вопросы с акцентом на практической применимости этих результатов для оценки пациентов с легочным саркоидозом.