Eur Respir J 2000; 16: 414-419

N. Shijubo, Y. Itoh, K. Shigehara, T. Yamaguchi, K. Itoh, Y. Shibuya, R. Takahashi, T. Ohchi, M. Ohmichi, Y. Hiraga, S. Abe
Third Dept of Internal Medicine, Sapporo Medical University School of Medicine, Sapporo, Dept of Laboratory Medicine, Asahikawa Medical College, Asahikawa, Dept of Laboratory Medicine, Jichi Medical School, Kawachi, Dept of Respiratory Medicine, Sapporo Hospital of Hokkaido Railways Company, Sapporo, Japan.

Реферат

Саркоидоз - системная гранулематозная болезнь с высокой частотой спонтанной ремисии. 10-kDa белок клеток Клара (CC10), преобладающий продукт секреторных нереснитчатых бронхиолярных эпителиальных клеток, является мощным иммунорегуляторным и противовоспалительным средством.

Уровни CC10 были измерены в сыворотке и бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) 31 пациента с саркоидозом (9 с прогрессом и 22 с регрессом болезни) и была оценена возможность спонтанной ремиссии. Были исследованы ингибирующее действие рекомбинантного CC10 на производство интерферона-гамма (IFN-g), используя стимулированные липополисахаридом (LPS) саркоидные клетки БАЛ и влияние блокирующего эффекта моноклональных антител TY-5 к CC10 на функции CC10. Уровни CC10 в сыворотке и БАЛ группе с регрессом болезни были значительно выше, чем в группе с прогрессом болезни (сыворотка p < 0.05; БАЛ p < 0.005) и у здоровых индивидуумов (сыворотка p < 0.0001; БАЛ p < 0.005). CC10 частично ингибировал производство IFN-g LPS-стимулированными саркоидными клетки БАЛ (ингибирование CC10 : 1,000 ng*mL^-1, 30 %; 100 ng*mL^-1, 14 %). TY-5 восстановливал производство IFN-g, блокируя функции CC10. Пациенты с регрессом саркоидоза имели увеличенные уровни CC10 в сыворотке и БАЛ. 10-kDa белок клеток Клара может быть регулятором воспалительного процесса при саркоидозе.

При саркоидозе, неизвестный агент ведет к накоплению активизированных CD4 + лимфоцитов, производящих Th1 цитокины интерлейкин-2 (IL-2) и интерферон гамма (IFN-g) на участках воспаления и формированию гранулем [1]. Несмотря на системный характер болезни, активация T-клеток и макрофагов/моноцитов ограничена вовлеченными органами. Примерно у 60 % пациентов с саркоидозом, наблюдается спонтанная ремиссия [2, 3]. Механизмы уменьшения воспаления при саркоидозе существуют, однако, предпосылки или механизмы индукции спонтанной ремиссии неизвестны. 10-kDa белок клеток Клара (CC10) - преобладающий продукт секреторных нереснитчатых бронхиолярных эпителиальных клеток в респираторных и терминальных бронхиолах в легком [4]. Была доказана идентичность человеческого CC10 человеческому протеину-1 (P1) [5] и утероглобину (UG) [6]. CC10/UG обладает различными биохимическими и биологическими свойствами, включая ингибирование активности фосфолипазы A2 (PLA2) [7] и фосфолипазы C (PLC) [8]. CC10 является мощным ингибиротом IFN-g, фактора некроза опухоли (TNF-a) и IL-1b [9, 10]. Кроме того, дефицит CC10 проиводит к увеличенной чувствительности к гипероксия-индуцированному повреждению легкого, увеличивая экспрессию провоспалительных цитокинов [11]. Эти данные вели к предположению, что CC10 могут функционировать как ингибиторы воспаления в дыхательных путях.

Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы исследовать уровни CC10 в сыворотке и БАЛ а также оценить их корреляцию с исходом болезни у пациентов с саркоидозом и проверить ингибирующий эффект CC10 на производство IFN-g саркоидными клетками БАЛ.

Материалы и методы

В исследование были привлечены только никогда не курившие индивидуумы, поскольку курение табака связано с уменьшением уровней CC10, приблизительно на 30 % в сыворотке и приблизительно на 50 % в БАЛ [12, 13].

Пациенты

Тридцать один никогда не куривший пациент (возраст 47±20 лет; 4 мужчины и 27 женщины) были отобраны из числа 148 пациентов с саркоидозом из наших клиник (Sapporo Medical University School of Medicine и Sapporo Hospital of Hokkaido Railways Company) между 1992 и 1996 г. Они имели гистологические результаты, совместимый с диагнозом саркоидоз, неказеозные эпителиоидноклеточные гранулемы в легком, без свидетельств микобактериальной или грибковой инфекции. Ни один пациент не имел истории воздействия органических или неорганических материалов, способных причинять гранулематозные болезни легкого. Они не получали кортикостероидную терапию. Девять пациентов имели стадию 0 саркоидоза (нормальная рентгенограмма); 12 имели стадию 1 (грудная лимфаденопатия); семь имели стадию 2 (грудная лимфаденопатия и легочные инфильтраты); и три имели стадию 3 (легочные инфильтраты без грудной лимфаденопатии). Пациенты наблюдались более 3 лет. У всех пациентов со стадией 0, внелегочные повреждения (кожа, глаза и/или лимфатические узлы) регрессировали в пределах 3 лет без любой терапии (группа с регрессом болезни). У шести пациентов, внутригрудные повреждения прогрессировали на рентгенограмме легких и/или компьютерной томографии (КТ) в течение более 3 лет (группа с прогрессом болезни), и у 20 пациентов, внутригрудные повреждения исчезли спонтанно или регрессировали пределах 3 лет без любой терапии (группа с регрессом болезни). У двух пациентов проводилась кортикостероидная терапия в течение длительного периода из-за прогресса легочного саркоидоза или саркоидоза кости (группа с прогрессом болезни). У двух пациентов (стадия 1 и стадия 2), повреждения глаз быстро улучшились при коротком (4-8 недель) курсе кортикостероидной терапии. В пределах 3 лет после проведения терапии, наблюдался рецидив внутригрудных повреждений у одного пациента (группа с прогрессом болезни). Остальные пациенты не имели рецидива (группа с регрессом болезни). Группа с прогрессом (n=9) и регрессом болезни (n=22) были разделены.

Чтобы оценить влияние рекомбинантного CC10 на производство IFN-g клетками БАЛ, были отобраны восемь нелеченных пациентов (второй ряд). Они посетили больницу между июлем 1997 и декабрем 1998 г. Все имели гистологическое подтверждение саркоидоза. Пять пациентов имели стадию 1 и три стадию 2 (средний возраст 32±5 лет; три мужчины и пять женщин).

Здоровые индивидуумы

Исследование сыворотки были проведены у 64 здоровых никогда некуривших индивидуумов (средний возраст 42±9 лет; 15 мужчин и 49 женщин). Исследование БАЛ было проведено у 15 здоровых никогда некуривших индивидуумов (средний возраст 28±7 лет; 10 мужчин и пять женщин). Они не имели респираторных болезней в медицинской истории. Их рентгенограммы легких не показали никаких ненормальностей, спирометрические тесты также были нормальны (жизненная емкость > 80 %; объем форсированного выдоха в первую секунду (FEV1) > 70 %). Информированное согласие было получено у всех участников исследования.

Результаты

Уровни CC10 в сыворотке и БАЛ и их корреляция

Уровни CC10 у пациентов с саркоидозом (19.5±8.60 ng*mL^-1, диапазон 6.92±42.3 ng*mL^-1) были значительно увеличены по сравнению с здоровыми индивидуумами (11.6±3.85 ng*mL^-1, диапазон 5.16±22.4 ng*mL^-1; p < 0.0001). Не имелось существенных различий уровней CC10 в сыворотке в зависимости от рентгенологической стадии (стадия 0, 19.2±11.0 ng*mL^-1; стадия 1, 18.7±6.2 ng*mL^-1; стадия 2, 21.4a11.0 ng.mL-1; стадия 3,18.8±5.0 ng*mL^-1). Имелось существенное различие уровней CC10 в БАЛ здоровых индивидуумов (757±418 ng*mL^-1) и пациентов с саркоидозом (1,100±772ng*mL^-1). Не было найдено существенных различий по отношению CC10/альбумин в БАЛ у здоровых индивидуумов (18.7±9.1 ng.mg-1) и пациентов с саркоидозом (25.8±16.6 ng*mL^-1). Не имелось существенных различий в уровнях CC10 в БАЛ в зависимости от рентгенологической стадии (стадия 0, 1,110±671 ng*mL^-1; стадия 1, 1,050±780 ng*mL^-1; стадия 2, 1,330± 1,040 ng*mL^-1; стадия 3, 676±311 ng*mL^-1). Не было найдено существенных различий по отношению CC10/альбумин в БАЛ в зависимости от рентгенологической стадии (стадия 0, 26.5±13.1 ng*mL^-1; стадия 1, 24.2±18.7 ng*mL^-1; стадия 2, 29.6±20.0 ng*mL^-1; стадия 3, 20.6±14.0 ng*mL^-1). Имелась существенная положительная корреляция между уровнями CC10 в сыворотке и БАЛ у пациентов с саркоидозом (r=0.759, p < 0.0001).

Связь уровней CC10 с клиническим результатом

Связь уровней CC10 в сыворотке и БАЛ с клиническим результатом была проанализирована у 31 пациента с саркоидозом.

Средние уровни CC10 в сыворотке (21.7±9.13 ng*mL^-1) и БАЛ (1,360±751 ng*mL^-1) в группе с регрессом болезни были значительно выше, чем в группе с прогрессом болезни (сыворотка, 14.2±3.70 ng*mL^-1, p < 0.05; БАЛ, 458±328 ng*mL^-1, p < 0.005) и чем у здоровых индивидуумов (p < 0.0001 и p < 0.005, соответственно). Напротив, никаких существенных различий в уровнях CC10 не было обнаружено между группой с прогрессом болезни и здоровыми индивидуумами. Кроме того, среднее отношение CC10/альбумин (31.7±15.0 ng*mL^-1) было значительно выше в группе с регрессом болезни, чем в группе с прогрессом болезни (11.3±10.3 ng*mL^-1, p < 0.005) и у здоровых индивидуумов (p < 0.005). Не имелось существенного различия по отношению CC10/альбумин в БАЛ между группой с прогрессом болезни и здоровыми индивидуумами.

Влияние рекомбинантного CC10 на производство IFN-g клетками БАЛ

LPS-стимулированные саркоидные клетки БАЛ производили IFN-g (871±382 ng*mL^-1). CC10 уменьшил производство IFN-g LPS-стимулированными саркоидными клетки БАЛ (CC10 1,000 ng*mL^-1: ингибирование 30.3±17.6 %, диапазон ингибирования 11.7-54.9 %; CC10 100 ng*mL^-1: ингибирование 14.0-14.8 %, диапазон ингибирования 1.2-46.5 %). Однако, не имелось существенного различия в степени ингибирования CC10 производства IFN-g LPS-стимулированными саркоидными клетками БАЛ между стадией 1 и 2 болезни. Когда процент ингибирования CC10 производства IFN-g (100 и 1,000 ng*mL^-1) был проанализирован вместе с числом альвеолярных макрофагов и лимфоцитов, не имелось никакой существенной корреляции процента ингибирования с субпопуляциями клеток. MoAb TY-5 восстановили производство IFN-g, блокируя функции CC10.

Обсуждение

В настоящем исследовании были обнаружены значительно увеличенные уровни CC10 в сыворотке и БАЛ у пациентов с саркоидозом с регрессом болезни по сравнению с пациентами с прогрессом болезни и у здоровых индивидуумов. Рекомбинантный CC10 ингибировал производство IFN-g LPS-стимулированными саркоидными клетками БАЛ. MoAb TY-5 восстанавливали производство IFN-g, блокируя функции CC10. CC10 играет важную иммунорегуляторную и противовоспалительную роль в легких. Он ингибирует активность PLA₂, ключевого фермента воспалительных процессов [6]. Jonston [11] сообщил об увеличенной чувствительности к гипероксия-индуцированному повреждению легкого и увеличенному воспалительному ответу у CC10-дефицитных мышах. Производство CC10 эпителиальными клетками дыхательных путей человека стимулируется TNF-a [18]. Эти данные поддерживают гипотезу, что CC10 функционирует как противорегулятор воспаления. Об уровнях CC10 в сыворотке и БАЛ сообщалось при различных болезнях легкого [13, 19-24]. Уменьшение уровней CC10 было найдено в БАЛ пациентов с астмой [19], идиопатическим легочным фиброзом [20], хронической обструктивной болезнью легкого [21] и в сыворотке пациентов с астмой [22], хронической обструктивной болезнью легкого [21] и бактериальной пневмонией [23]. Увеличенные уровни CC10 были обнаружены в БАЛ пациентов с асбестозом [24]. Недавнее исследование показало уменьшение числа CC10-позитивных эпителиальных клеток в дыхательных путях пациентов с астмой [25]. Настоящее исследование документировало увеличенные уровни CC10 в сыворотке пациентов с саркоидозом, но не в БАЛ, что совместимо с предшествующими сообщениями [21]. Были зарегистрированы увеличенные уровни CC10 в сыворотке и БАЛ пациентов с саркоидозом с регрессом болезни. В этом исследовании, контрольные образцы БАЛ были получены у значительно более молодых индивидуумов, так как трудно получить образцы БАЛ у здоровых индивидуумов, согласованных по возрасту и полу с пациентами с саркоидозом, поскольку все некурящие пациенты с саркоидозом имели значительно больший возраст, многие из пациентов были женщинами и число мужчин было очень небольшим. Это исследование также продемонстрировало положительную корреляцию между уровнями CC10 в сыворотке и БАЛ у пациентов с саркоидозом, предполагая, что уровни CC10 в сыворотке отражают производство CC10 клетками легкого в состоянии болезни и у здоровых индивидуумов [12, 21].

В настоящем исследовании, рекомбинантный CC10 частично уменьшал производство IFN-g LPS-стимулированными саркоидными клетками БАЛ. Нативный CC10/P1 ингибировал производство IFN-g стимулированными фитогемагглютинином периферическими мононуклеарными клетками крови здорового донора [9]. CC10 уменьшал биологическую активностьт IFN-g, такую как антивирусная активность и стимулирование фагоцитоза [9]. Нативный CC10/P1 вызвал ингибирование индуцированной PLA₂ миграции фибробластов [20]. Рекомбинантный CC10 дозозависимо ингибировал активность PLA₂ и PLC [8, 26]. Рекомбинантный CC10/UG дозозависимо блокировал транспорт раковых клеток [27]. Рекомбинантный CC10/UG подавлял инвазию внеклеточного матрикса нормальными и раковыми клетками, которые экспрессировали рецепторы с высокой афинностью к CC10/UG [28, 29]. Некоторые свидетельства указывают, что между нативным и рекомбинантным CC10 нет существенных функциональных различий. Предполагается, что ингибирующий эффект CC10 на производство IFN-g саркоидными клетки БАЛ, может зависеть от экспрессии высокоафинных рецепторов CC10 клеток БАЛ. Наше исследование показало, что MoAb TY-5, специфические моноклональные антитела к человеческому CC10, восстанавливали производство IFN-g, блокируя функции CC10. По данным авторов, это первое сообщение, демонстрирующее, что специфические MoAb к человеческому CC10, нейтрализуют CC10. Эти данные говорят, что высокие уровни CC10 у пациентов с саркоидозом могут уменьшать воспаление и производство цитокинов в саркоидных повреждениях, что приводит к регрессу болезни. Легкие и глаза наиболее часто вовлекаются саркоидозом. Интересно, что иммунореактивность CC10 была обнаружена в глазах [30] также как и у клеток Клара в легком. Полиморфизм A38G человеческого CC10 был найден у детях с астмой [31]. Этот полиморфизм был связан с уменьшенными уровнями CC10 в сыворотке и увеличенным риском развития астмы [31]. Кроме того, гомозиготные 38A пациенты демонстрировали уменьшенные плазменные уровни CC10 по сравнению с гетерозиготными и гомозиготными 38G пациентами в группе без астмы [31]. Предполагается, что полиморфизм A38G в нетранслируемом регионе гена CC10 может быть связан с производством CC10 в ответ на IFN-g и TNF-a, что влияет на клинический результат саркоидоза. Необходимы дополнительные исследования, чтобы оценить связь уровней CC10 с полиморфизмом A38G у пациентов с саркоидозом.

Полученные данные указывает на важность 10-kDa белка клеток Клара как регулятора воспаления в дыхательных путях у пациентов с саркоидозом.