Eur Respir J 2001; 18:507-514

16 kDa белок клеток Клара (CC16) как маркер целостности аэрогематического барьера при саркоидозе

C. Hermans, M. Petrek, V. Kolek, B. Weynand, T. Pieters, M. Lambert and A. Bernard
Industrial Toxicology and Occupational Medicine Unit, Units of Pathology, Pneumology, General Internal Medicine Units, Cliniques Universitaires Saint-Luc, Catholic University of Louvain, Belgium. Depts of Immunology and Respiratory Medicine, Palacky University, Olomouc, Czech Republic

Реферат

Чтобы проверить гипотезу, что саркоидоз связан с увеличенной проницаемостью аэрогематического барьера, был исследован CC16 - секреторный низкомолекулярный 16 kDa белок, секретируемый бронхиолярными клетками Клара.

Уровни CC16 были измерены в сыворотке 117 пациентов с саркоидозом и 117 здоровых индивидуумов, согласованных по возрасту, полу и статусу курения. Регрессионный анализ использовался, чтобы идентифицировать связь между внелегочными переменными и уровнями CC16 в сыворотке.

Концентрация CC16 в сыворотке пациентов с саркоидозом была значительно увеличена по сравнению с группой контроля (25.9±16.2 против 13.9±5.2 µg/L). У некурящих пациентов без существенного ухудшения почечной функции, уровни CC16 в сыворотке увеличивались с увеличеним серьезности рентгенографической болезни и были на среднем на 50-100 % выше, когда наблюдалось паренхиматозное вовлечение. Однако, пациенты с саркоидозом имели нормальные уровни CC16 в БАЛ и постоянное число CC16-иммунопозитивных клеток в образцах биопсии легкого, предлагая, что увеличенная секреция CC16 в легком при саркоидозе является весьма маловероятной и что повышение уровней CC16 при саркоидозе является следствием увеличенной проницаемости аэрогематического барьера.

Настоящее исследование говорит, что CC16 в сыворотке может быть полезным инструментом атравматичной оценки повреждения и увеличенной проницаемости аэрогематического барьера при саркоидозе.

Введение

Легочный саркоидоз связан с накоплением и активацией воспалительных клеток в пределах легкого (1, 2). Эти клетки могут повреждать легочную ткань, в особенности альвеолярно-капиллярный барьер, ведя к уменьшению функции легкого и/или ухудшению газообменна. Другое последствие нарушения целостности аэрогематического барьера - увеличенная проницаемость для белков (3, 4), что обычно проявляется повышением уроня белков типа альбумина в бронхоальвеолярной лаваже (БАЛ) (4-10).

Согласно недавним исследованиям, целостность аэрогематического барьера и его проницаемость для макромолекул может быть оценена с помощью измерения уровней специфических секреторных белков, также называемых ''пневмопротеинами'' (11, 12). Один из этих белков - секреторный низкомолекулярный (16 kDa) белок клеток Клара (CC16), секретируется в больших количествах в просвет бронхиол нереснитчатыми бронхиолярными клетками Клара (13, 14). После попадания в кровоток через аэрогематический барьер, CC16 быстро элиминируется с помощью гломерулярной фильтрации (15). Уровни CC16 в сыворотке увеличены в нескольких ситуациях, связанных с разрушением аэрогематического барьера, напимер, при легочном фиброзе (16) или при повреждениях легкого, вызванного дымом у пожарных (17) и озоном (18). Если аэрогематический барьер не поврежден, концентрация CC16 может отражать число неповрежденных клеток Клара. Уменьшение CC16 в сыворотке наблюдается у курящих индивидуумов, у них число клеток Клара и уровни CC16 в БАЛ заметно уменьшены (14, 19-21).

Цель этого исследования состояла в том, чтобы определить, связан ли легочный саркоидоз с увеличенными уровнями CC16. Также была исследована связь серологического уровня CC16 со степенью вовлечения легкого при саркоидозе.

Пациенты и методы

117 пациентов с саркоидозом были привлечены в исследование из Dept of Medicine of the Cliniques Universitaires Saint-Luc, Brussels, Belgium и Respiratory and Immunology Units of the Palacky University Hospital, Olomouc, Czech Republic. Все пациенты имели рентгенограммы и/или клинические проявления, совместимые с саркоидозом, неказеозные эпителиоидноклеточные гранулемы при бронхиальной или легочной биопсии, отсутствие микобактериальной инфекции и воздействия окружающей среды, способного вызывать гранулематозную болезнь легкого. Большинство пациентов имело недавнее начало саркоидоза. У десяти пациентов проводилась противовоспалительная терапия в момент включения в исследование (нестероидные противовоспалительные средства или кортикостероиды). Группа контроля состояла из 117 здоровых доноров крови, индивидуально согласованных с пациентами с саркоидозом по возрасту (±2 года), полу и статусу курения.

За 24 часа до проведения бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), у пациентов был взят образец венозной крови для определения уровня CC16, ангиотензинпревращающего фермента (АПФ), лизоцима и креатинина. В подгруппе из 71 некурящих пациентов с саркоидозом без ухудшения почечной функции и семи некурящих индивидуумов группы контроля, были измерены CC16 и два белка, альбумин и ретинол-связывающий протеин (RBP; 21 kDa белок, секретируемый печенью). Также оценивалась серьезность альвеолита на основании процента лимфоцитов и отношения CD4+/CD8+. Рентгенограммы интерпретировалась радиологом, не знающим результаты других исследований и были категоризированы согласно стандартной классификации: нормальная рентгенограмма (Стадия 0), грудная лимфаденопатия без паренхиматозного вовлечения (Стадия I), грудная лимфаденопатия с паренхиматозными повреждениями (Стадия II) и паренхиматозное вовлечение без грудной лимфаденопатии (Стадия III). Результаты компьютерной томографии (КТ) были доступны для 59 пациентов и были классифицированы следующим образом: отсутствие изменений, изменения средостенных лимфатических узлов, изолированные или ассоциированные с паренхиматозными ненормальностями, только паренхиматозные изменения. У пациентов с саркоидозом и здоровых добровольцев было получено информированное согласие.

Результаты

Когда факторы, способные влиять на уровни CC16 были проанализированы совместно у пациентов с саркоидозом и группы контроля, саркоидоз являлся главным детерминантом, вместе с серологическим креатинином и курением табака. Когда две группы были проанализированы отдельно, также было обнаружено влияние курения табака, и для пациентов с саркоидозом и для группы контроля. Напротив, влияние почечной функции наблюдалось только в группе пациентов с саркоидозом, некоторые из которых имели ухудшение функции почек. Интересно, что в последней группе, была найдена связь между уровнем CC16 и серьезностью ненормальностей рентгенограммы. Возраст, пол и проведение противовоспалительной терапии не являлись существенными детерминантами изменения уровня CC16.

Курящие и некурящие пациенты с саркоидозом имели сопоставимое повышение уровня CC16 в сыворотке, которая была в среднем на 80 % выше, чем в группе контроля. Из-за присутствия ухудшения почечной функции у некоторых пациентов с саркоидозом и влияния курения табака уровень CC16, только 87 некурящих пациентов с саркоидозом без умеренной или серьезной почечной дисфункции (серологический креатинин < 14 mg/L) участвовали в дальнейшем анализе. В этой подгруппе, присутствие саркоидоза являлось главным детерминантом повышения CC16 в сыворотке (r2=0.249, p=0.0001) по сравнению с почечной функцией, которая имела минорное влияние (r2=0.021, p=0.03). Когда эта подгруппа пациентов была категоризирована согласно серьезности рентгенографического вовлечения, было обнаружено, что концентрация CC16 в сыворотке (µg/L) увеличивается в соответствие со степенью вовлечения легкого (группа контроля n=87: 14.4±4.6; стадия 0, n=4: 18.9±13.7; стадия I, n=49: 23.1±11.0; стадия II, n=24: 28.6±13.6; стадия III, n=10: 33.3±21.4; p=0.001). Уровни CC16 были значительно выше у пациентов с паренхиматозным вовлечением (стадии II - III) по сравнению с пациентами без паренхиматозного вовлечения (стадии 0-I). Повышение уровней CC16 (µg/L) также проявилось, когда пациенты были разделены согласно степени КТ ненормальностей (группа контроля, n=87: 14.4±4.6, нормальная КТ или изолированные средостенные лимфатические узлы, n=31: 21.2±9.8; средостенные лимфатические узлы с паренхиматозными изменениями, n=17: 28.1±13.2; только паренхиматозные ненормальности, n=11: 37.8±22.5, p=0.0001). Такое различие было, однако, не найдено, когда серологический лизоцим или уровни АПФ были сравнены между группами пациентов с и без паренхиматозного вовлечения.

В БАЛ пациентов с саркоидозом, в отличие от сыворотки, уровень CC16 сильно не отличался от группы некурящих здоровых индивидуумов (0.45±0.4 против 0.46±0.18 mg/L, p=0.44) и не имел различий при увеличении серьезности ненормальностей рентгенограммы. Средний уровень CC16 в БАЛ не различался между пациентами двух больниц, участвующих в исследовании, что исключало любое влияние различий процедур взятия лаважа на параметры БАЛ. Уровни альбумина и RBP имели тенденцию быть увеличенными в БАЛ пациентов с саркоидозом. Процент лимфоцитов в БАЛ, также как и отношение CD4+/CD8+, были увеличены у пациентов с саркоидозом. Концентрация CC16 в сыворотке пациентов с саркоидозом положительно коррелировала с уровнем RBP и процентом лимфоцитов в БАЛ. Однако, никакой корреляции не было найдено между уровнями CC16 и уровнями альбумина в БАЛ, уровнем CC16 и отношением CD4+/CD8+. Подобно уровню CC16 в сыворотке, уровень альбумина в БАЛ положительно коррелировал с процентом лимфоцитов (n=71, r=0.29, p=0.01).

В среднем, для каждого пациента были исследованы 3.9±2.5 образца бронхиальной биопсии и 17.1±7.3 бронхиолярных секций в экземплярах легочной биопсии. Среднее число гранулем было 1.63 (1-5) и 36.8 (1-100) для бронхиальных и легочных экземпляров биопсии, соответственно. CC16-иммунопозитивные клетки были идентифицированы в дыхательных путях пациентов с саркоидозом и группы контроля. В согласии с преобладающей бронхиолярной локализацией клеток Клара, плотность CC16-позитивных клеток была выше в легочных, чем в бронхиальных экземплярах биопсии (38.3±3.6 % против 21.2±11.5 %, p=0.05). Анализ показал существенное влияние курения табака; процент CC16-позитивных клеток был ниже в экземплярах бронхиальной биопсии у курящих, по сравненного с некурящими (12.4±8.3 % против 28.8±7.8 %, p=0.005). Однако, после согласования по статусу курения табака, никаких различий не было найдено между пациентами с саркоидозом и группой контроля по плотности CC16-позитивных клеток в материале бронхиальной (22.2±7.0 % против 28.8±7.8 %, p=0.08) или легочной биопсии (45.4±6.7 % против 38.3±3.7 %, p=0.09). CC16-иммунореактивность не была обнаружена в саркоидых гранулемах.

Обсуждение

Мы исследовали увеличенную проницаемость аэрогематического барьера с помощью измерения уровней CC16 в большой группе пациентов с саркоидозом. Саркоидоз увеличил серологический уровень CC16 в среднем на 80 %. Это увеличение было независимым от статуса курения и ухудшения функции почек, двух факторов, которые могут уменьшать и увеличивать серологические уровни CC16, соответственно (14, 15, 19-21, 28). Эти результаты позволяют исключить возможность, что увеличение уровня CC16 происходит из-за увеличения синтеза CC16 эпителиальными и/или воспалительными клетками. Уровни CC16 в БАЛ и число CC16-иммунопозитивных клеток у пациентов с саркоидозом и в группе контроля не различались и иммуноокрашивания CC16 не было обнаружено в саркоидных гранулемах. Эти данные также говорят, что, несмотря на противовоспалительные и антифиброзные свойства (16, 29, 30), CC16 функционально не вовлечен в патогенез легочного саркоидоза. Хотя некоторые пациенты с саркоидозом имели уменьшенный уровень гломерулярной фильтрации, только небольшая часть увеличения CC16 в сыворотке может быть объяснена уменьшенным почечным клиренсом этого белка. Увеличение происходит независимо от уровня гломерулярной фильтрации, что подтверждено фактом, что увеличение сохранилось после исключения пациентов с саркоидозом с ухудшением почечной функции. Так как респираторный тракт является главным источником CC16 у людей (12) и у грызунов (31), единственное разумное объяснение увеличенного проникновения этого белка из респираторного тракта в кровоток - увеличение проницаемости аэрогематического барьера.

Отсутствие корреляции между уровнями CC16 в сыворотке и альбумина в БАЛ не противоречат этой гипотезе, поскольку эти белки имеют существенные различия не только по размеру, но также и по направлению движения и механизмам прохода через аэрогематическийо барьер. Хотя о мехенизмах прохода известно относительно немного, белки перемещающиеся через аэрогематический барьер должны пройти через слой эпителиальных и эндотелиальный клеток, их базальные мембраны и через интерстиций (11, 12, 32). Некоторые данные предполагают, что белки пересекают аэрогематический барьер парацеллюлярно, через заполненные жидкостью поры комплексов, связывающие эпителиальные и эндотелиальные клетки (33). Из-за небольшого размера этих пор, аэрогематический барьер ограничивает движение главным образом больших белков типа альбумина, и в меньшей степени менее корупных белков, таких как CC16 (34-36). Эта размер-селективная проницаемость аэрогематического барьера дает привлекательное объяснение корреляции между уровнями CC16 в сыворотке и RBP в БАЛ, так как оба этих белка имеют сопоставимый размер, но перемещаются в противоположных направлених. Были получены данные, что движение альбумина и CC16 определяется диффузионными процессами вдоль градиента концентрации, существующего для этих двух белков по обе стороны аэрогематического барьера (14, 37).

Морфологически, были обнаружены повреждения альвеолярного эпителия, эндотелия и соответствующих базальных мембран, предполагая, что при саркоидозе повреждаются различные компоненты аэрогематического барьера (40). Хотя точный механизм этого этого эффекта остается неизвестным, вероятно стык между альвеолярными клетками имеет повышенную проницаемость или при саркоидозе увеличено число этих стыков, что приводит к увеличению движения экзогенных или эндогенных жидкостей и макромолекул. Однако, присутствие трансцеллюлюрного транспорта, хотя это маловероятно, не может быть полностью исключено (43). Как было сообщено ранее, уровень альбумина в БАЛ хорошо коррелировал с интенсивностью альвеолита (4, 5, 8). Еще более сильная корреляция была найдена между процентом лимфоцитов в БАЛ и CC16 в сыворотке. Эти результаты говорят, что двунаправленное движение белков через аэрогематический барьер может быть связано со степенью вовлечения легкого, оцененного по проценту лимфоцитов в БАЛ.

Интересно, что уровни CC16 были увеличены у всех пациентов, даже при отсутствии существенных рентгенологических ненормальностей. Однако известно, что вовлечение легкого и увеличенная проницаемость аэрогематического барьера присутствует у большинства пациентов с саркоидозом (44), даже при отсутствии радиологически обнаружимых инфильтратов. Кроме того, уровни CC16 имели тенденцию увеличиваться при увеличении серьезности паренхиматозной болезни легкого. Это поддерживает гипотезу, что количество CC16 в кровотоке определяется степенью легочной болезни. В литературе, однако, подобный паттерн изменений не был обнаружен для альбумина в БАЛ (10). Никакой корреляции не было найдено между серологическими уровнями CC16 и серологическими уровнями АПФ или лизоцима, двумя маркерами, наиболее обычно измеряемыми в сыворотке пациентов с саркоидозом. Эти результаты, однако, не удивительны, так как и АПФ и лизоцим производятся в пределах гранулем, и их уровни в сыворотке зависят от степепи и легочного и внелегочного вовлечения (46).

Увеличение уровня CC16 в сыворотке не специфично для саркоидоза, так как подобные изменения было описаны при различных клинических или экспериментальных состояниях, включая легочный фиброз (16), острый респираторный дистресс-синдром (15), воздействие озона (18) и у пожарных после вдыхания дыма (17). Это подобие при таких различных болезнях поддерживает концепцию существования общего механизма, наиболее вероятно связанного с разрушением аэрогематического барьера. Интересно, что увеличенные уровни другого секреторного белка, муцин-антигена KL-6 секретируемго альвеолярными клетками тип II, недавно были обнаружены в сыворотке пациентов с саркоидозом и бериллиозом и были связаны с серьезностью вовлечения легкого (47, 48). Как и нашем исследовании, KL-6 был предложен как полезный маркер степени проницаемости аэрогематического барьера при бериллиозе (48). Эти наблюдения поддерживают концепцию, что в отсутствии ухудшения функции почек, увеличение уровня CC16 в сыворотке может быть специфическим индикатором повреждения аэрогематического барьера увеличения его проницаемости для белков.

Результаты нашего исследования показывают, что саркоидоз связан с увеличенным проникновением CC16 через аэрогематический барьер. Это увеличение коррелировано с серьезностью паренхиматозного вовлечения легкого и со степенью альвеолита. Уровни CC16 в сыворотке пациентов с саркоидозом также находятся под влиянием курения и почечной функции, двух факторов, которые должны рассматриваться при использовании этого маркера.