CD13 / аминопептидаза N (E.C.3.4.11.2) - эктоэнзим, расположенный на наружной мембране различных клеток. Поскольку было показано, что экспрессия аминопептидазы регулируется Th1 цитокином IFN-gamma, мы исследовали роль CD13 / аминопептидазы N при легочном саркоидозе. Активность аминопептидазы в бронхоальвеолярном лаваже (ЖБАЛ) была значительно выше у пациентов с саркоидозом чем у здоровых добровольцев и в групе контроля. Активность значительно коррелировала с процентом лимфоцитов и отношением CD4+/CD8+ в ЖБАЛ и была выше у пациентов с саркоидозом с паренхиматозным вовлечением. CD13 / аминопептидаза N - протеин, имеющий молекулярную массу приблизительно 150 kD, был обнаружен у альвеолярных макрофагов (АМ) у пациентов с саркоидозом с более высокими уровнями, чем в группе контроля. CD13 / аминопептидаза N индуцировала in vitro хемотаксическую миграцию лимфоцитов человека в диапазоне концентраций от 10^-5 до 10^-1 U/ml. Хемотаксическая активность была больше для CD4+ Т-лимфоцитов чем для CD8+. Ферментативная активность CD13 / аминопептидазы N была ответствена за хемотаксическую активность, так как бестатин, ингибитор CD13 / аминопептидазы N, ингибировал хемотаксическую активность. Увеличение хемотаксической активности лимфоцитов было обнаружено в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля и активность значительно уменьшалась при лечении бестатином. Это исследование указывает, что экспрессия CD13 / аминопептидазы N может играть важную роль в вовлечении T-лимфоцитов при легочном саркоидозе и в патогенезе альвеолита в этой болезни.

Введение

Аминопептидаза N - мембраносвязанная металлопротеиназа, как было показано в (1) идентичная CD13, 150-kD поверхностному гликопротеиду, который первоначально использовался как маркер субпопуляций кроветворных клеток (2). CD13 / аминопептидаза N широко распространена в различных клетках млекопитающих - моноцитах / макрофагах, фибробластах, нейтрофилах, эндотелиальных клетках и эпителиоцитах (3, 4). CD13 / аминопептидаза N - рецептор человеческого коронавируса (5) и играет важную роль при начале ВИЧ (6). Было показано, что эта пептидаза участвует в процессе деградации внеклеточного матрикса при инвазии опухоли (7) и в производстве пептидов клетками, производящими презентацию антигена (8). Хотя имеется мало информации относительно регулирования экспрессии CD13 / аминопептидазы N, недавние исследования показали, что лимфокины IFN-gamma и IL-4 увеличивают экспрессию CD13 / аминопептидазы N у всех типов клеток (3, 9).

Саркоидоз - хроническая воспалительная болезнь, при которой имеется системный гранулематозный процесс и наиболее часто при этой болезни вовлекаются легкие. Паренхиматозные повреждения легкого у пациентов с саркоидозом характеризованы альвеолитом, связанным с мононуклеарными инфильтратами и формированием неказеозных гранулем и, у некоторых пациентов, легочного фиброза (10). Хотя триггер саркоидоза все еще не найден, лимфокины, производимые активизированными CD4+ Т-лимфоцитами играют главую роль в воспалительном процессе при этой болезни. CD4+ Т-лимфоциты могут быть разделены на две различных популяции, Th1 и Th2, определяемым по спектру цитокинов, производимыми этими клетками (11). Th1 клетки производят IL-2, IFN-gamma и фактор некроза опухоли бета и стимулируют клеточный иммунитет, принимая во внимание, что Th2 клетки производят IL-4, IL-5, IL-6 и IL-10 и играют важную роль в гуморальном иммунитете и аллергических болезнях (12). Имеются доказательства, что баланс различных цитокинов является важным для эффективной иммунной реакции и исхода инфекционных и аутоиммуннных болезней (13, 14). При саркоидозе преобладает Th1 ответ, поскольку лимфоциты в легком у пациентов с саркоидозом производят чрезмерные количества IFN-gamma и IL-2 (15). Th1 цитокины могут участвовать в активации макрофагов в местах воспаления и формировании гранулем (15). В этом исследовании мы обнаружили увеличенную активность аминопептидазы в ЖБАЛ и увеличенную экспрессию белка CD13 / аминопептидазы N у альвеолярных макрофагов у пациентов с саркоидозом, что коррелировано с активностью альвеолита. Кроме того, мы продемонстрировали, что CD13 / аминопептидаза N может играть значительную роль в патогенезе саркоидоза как хемоаттрактант T-клеткок.

Пациенты с саркоидозом

В исследовании участвовало 30 пациентов с саркоидозом. Диагноз саркоидоз был основан на ранее опубликованных клинических и гистологических критериях (10). Ни один пациент не получил кортикостероидную терапию до выполнения бронхоальвеолярного лаважа.

Группа контроля

Группа контроля состояла из 13 здоровых, некурящих добровольцев мужчин и 10 пациентов с другими болезнями (шесть мужчин и четыре женщины). Ни один из группы контроля не имел ненормальностей при физикальной экспертизе, рентгенограмме легких или исследовании функции легкого. Все пациенты группы контроля не имели интерстициальных болезней легкого; восемь имели рак легкого и два не имели никаких обнаруживаемых повреждений в легких, хотя имели кровь в мокроте.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Активность аминопептидазы в ЖБАЛ

Очень низкая активность аминопептидазы была обнаружена в ЖБАЛ в группе контроля и пациентов группы контроля (6.8 ± 2.0, 9.1 ± 5.9 nmol/h, соответственно). Среднее значение активности аминопептидазы в ЖБАЛ у пациентов с саркоидозом было значительно выше (49.9 ± 10.8 nmol/h) чем в группе контроля и пациентов группы контроля, но индивидуальные различия были очень большими, от 6 до 221 nmol/h.

Сравнение активности аминопептидазы в ЖБАЛ с другими параметрами у пациентов с саркоидозом

Активность легочного саркоидоза, которая оценивается клиническим, рентренографическими и физиологическими маркерами, является важной в предсказании прогресса болезни и отдаленного прогноза. Предыдущие отчеты показали, что число лимфоцитов, особенно CD4+ в ЖБАЛ является полезным в определении активности альвеолита при саркоидозе, серологические уровни АПФ также полезны при определении активности (24). Поэтому, чтобы определить значение активности аминопептидазы при саркоидозе, корреляцию активности аминопептидазы с процентом лимфоцитов в ЖБАЛ, были исследованы отношение CD4+/CD8+ в ЖБАЛ и серологический уровень АПФ. Активность аминопептидазы в ЖБАЛ имела значительную положительную корреляцию с процентом лимфоцитов и отношением CD4+/CD8+. Однако, не имелось никакой значительной корреляции между активностью аминопептидазы и серологическим уровнем АПФ (r = +0.356, p > 0.05). Значительные корреляции между активностью аминопептидазы и процентом лимфоцитов (r = +0.428, p = 0.0407) или отношением CD4+/CD8+ (r = +0.432, p = 0.030) также наблюдались у пациентов, чей ЖБАЛ имел высокую активность аминопептидазы (>= 18 nmol/h, n = 17). Не имелось значительных различий в активности аминопептидазы между мужчинами и женщинами и между курящими и некурящими пациентами с саркоидозом. Не имелось никакой значительной корреляции между активностью аминопептидазы и возрастом.

Пациенты с саркоидозом были классифицированы в две рентгенографические группы: Группа I без паренхиматозного вовлечения (Стадия I) и Группа II с паренхиматозным вовлечением (Стадия II/III). В соответствии с этой классификацией, 15 пациентов входили Группу I и 15 в Группу II. Значительного различия в среднем возрасте между этими двумя группами не имелось. Уровень активности аминопептидазы в ЖБАЛ был значительно выше в Группе II чем в Группе I. Процент лимфоцитов и отношение CD4+/CD8+ также было выше в Группе II чем в Группе I. Не имелось никакого значительного различия в серологическом уровне АПФ между этими двумя группами. Мы измерили Th1 цитокины; но ни IFN-gamma ни IL-2 не были обнаружены в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом.

Серологическая активность аминопептидазы

Была измерена активность серологической аминопептидазы, чтобы определить, отражается ли эта активность на ЖБАЛ. Мы провели измерение у 3 здоровых индивидуумов группы контроля, 3 пациентов группы контроля и 14 пациентов с саркоидозом и выполнили БАЛ. Не имелось никакого значительного различия в активности аминопептидазы в группе контроля и пациентов группы контроля и пациентов с саркоидозом (145.3±21.3, 188.3±40.1, 178.0±18.3 nmol/h, соответственно). Не имелось значительной корреляции между активностью серологической аминопептидазы и ЖБАЛ у пациентов с саркоидозом (r = 0.091, p > 0.05).

Экспрессия CD13/аминопептидазы N у АМ

Поскольку CD13/аминопептидаза N, как известно, экпрессируется на моноцитах / макрофагах (9), экспрессия CD13/аминопептидазы N в АМ была обнаружена с помощью вестерн-блоттинга. Когда 50 µg лизата АМ были разделены с помошью SDS-PAGE, CD13/аминопептидаза N, имеющая молекулярную массу приблизительно 150 kD, была обнаружена в группе контроля в очень низких уровнях. Лизат АМ у шести из семи пациентов с саркоидозом, содержал большее количество CD13. Увеличенная активность аминопептидазы в ЖБАЛ была обнаружена у шести пациентов с саркоидозом и соответствовала результатам экспрессии CD13/аминопептидазы N у АМ.

Хемотаксическая активность CD13/аминопептидазы N для Т-лимфоцитов

CD13/аминопептидаза N индуцирует хемотаксическую миграцию лимфоцитов в диапазоне концентрации от 10^-5 до 10^-1 U/ml. Хемотаксическая активность, индуцированная CD13 / аминопептидазой N в диапазоне концентрации от 10^-4 до 10^-2 U/ml была эквивалентена 50 ng/ml MIP-1. Анализ оказал, что действие CD13/аминопептидазы N было скорее хемотаксическим чем хемокинетическим. Поскольку имелось соответствие между хемотаксическим ответом и ферментативной активностью, мы исследовали связь хемотаксической активности CD13/аминопептидазы N с ее ферментативной активностью, используя бестатин, специфический ингибитор аминопептидаз. Ингибирование ферментативной активности CD13/аминопептидазы N бестатином на 96 % вело к инактивации на 93 % ее хемотаксической активности для лимфоцитов. Бестатин не ингибировал хемотаксическую активность MIP-1. CD13/аминопептидаза N также проявила хемотаксическая активность для очищенных CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов в диапазоне концентраций от 10^-4 до 10^-1 U/ml и 10^-3 до 10^-1 U/ml, соответственно, но ответ CD4+ T клеток был больше чем у CD8+ T клеток.

Влияние бестатина на ферментативную и хемотаксическую активность ЖБАЛ

ЖБАЛ 6 пациентов с саркоидозом, имевший высокую активность аминопептидазы и ЖБАЛ 3 здоровых индивидуумов группы контроля, обрабатывались бестатином и затем проверялсь на ферментативную и хемотаксическую активность. Обработка ЖБАЛ пациентов с саркоидозом бестатином приводила к ингибированию активности аминопептидазы в ЖБАЛ (от 85 до 93 %). Хемотаксическая активность для лимфоцитов была обнаружена в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом, но не у здоровых индивидуумов группы контроля и обработка ЖБАЛ пациентов с саркоидозом бестатином привела к ингибированию хемотаксической активности (от 43 до 74 %). Хемотаксическая активность MIP-1, который, как было показано, производится в легких при саркоидозе (25), не уменьшалась при обработке бестатином, указывая, что бестатин может быть специфическим ингибитором хемотаксической активности аминопептидазы в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом.

Обсуждение

Мы обнаружили значительно большую активность аминопептидазы в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом чем в группе контроля. Активность коррелировала с процентом лимфоцитов и отношением CD4+/CD8+ в ЖБАЛ, и, кроме того, активность была значительно выше у пациентов с саркоидозом с паренхиматозным вовлечением. Эти результаты говорят, что активность аминопептидазы в ЖБАЛ соответствует активности альвеолита, наблюдаемого при саркоидозе.

Мы установили, что CD13/аминопептидаза N является хемоаттрактантом для Т-лимфоцитов. Интересно, что хемотаксическая активность была больше для CD4+ чем для CD8+ T клеток. Мы не смогли обнаружить хемотаксис моноцитов или нейтрофилов CD13/аминопептидазой N. Ингибирование ферментативной активности CD13/аминопептидазы N бестатином приводило к ингибированию хемотаксической активности, что позволяет предположить, что ферментативная активность CD13/аминопептидазы N требуется для хемотаксической активности T-клеток. Недавно мы сообщили, что катепсин G и CAP37 / азуроцидин, которые являются нейтрофил-производными протеазами, являются факторами хемотаксиса для мононуклеарных клеток и нейтрофилов и их ферментативная активность требуются для хемотаксической активности (26, 27). Сообщалось, что тромбин, трипсин-подобная протеаза (альфа-амино-бета-оксипропионовая кислота), имеет хемотаксическую активность для моноцитов, комплексы тромбина с ингибиторами тромбина типа антитромбина III и гирудина показали меньшую хемотаксическую активность (28).

Мы показали, что CD13/аминопептидаза N является хемотаксисом для лимфоцитов в концентрации >10^{- 5} U/ml, для CD4+ и CD8+ в концентрации >10^-4 U/ml и >10^-3 U/ml, соответственно. Хотя процедура очистки CD4+ и CD8+ клеток может частично уменьшать реактивность клеток к хемоаттрактантам, в настоящее время мы не можем объяснить существующие различия относительно требуемых концентраций.

ЖБАЛ пациентов с саркоидозом имел высокую хемотаксическую активность для лимфоцитов по сравнению с группой контроля. Бестанин частично уменьшал его хемотаксическую активность. Эти результаты указывают, что CD13/аминопептидаза N ответственна, по крайней мере частично, за хемотаксическую активность лимфоцитов ЖБАЛ у пациентов с саркоидозом. Хотя различные хемотаксические факторы, включая IL-8, IL-15 и MIP-1 альфа и бета являются хемоаттрактантами для лимфоцитов (22), это исследование говорит, что CD13/аминопептидаза N может играть значительную роль в участии T-лимфоцитов как хемоаттрактантов при легочном саркоидозе.

Активизированные макрофаги имеют важную роль в инициировании и усилении иммунологических и воспалительных ответов при различных воспалительных болезнях легкого, включая саркоидоз (10, 29). При саркоидозе, Т-лимфоциты и макрофаги играют стержневую роль в организации воспалительного процесса. Было показано, что экспрессия CD13/ аминопептидазы N у макрофагов является маркером их зрелости или активации (4). В этом исследовании, CD13/аминопептидаза N была обнаружена у шести из семи пациентов с саркоидозом, чей ЖБАЛ имел высокую активность аминопептидазы, указывая, что альвеолярные макрофаги могут быть ответствены, по крайней мере частично, за активность аминопептидазы, обнаруженной в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом. Однако, в дальнейших исследованиях необходимо разъяснить механизм освобождения CD13/аминопептидазы N из клеточной мембраны при легочном саркоидозе.

Серологический уровень аминопептидазы у пациентов с саркоидозом не был повышен по сравнению с группой контроля. Семейство аминопептидаз главным образом состоит из лейцин аминопептидазы (E.C.3.4.11.1), CD13/аминопептидазы N (E.C.3.4.11.2) и цистил аминопептидазы (E.C.3.4.11.3) (30). L-лейцин-AMC, которая использовалась в этом исследовании как субстрат, чтобы обнаружить активность аминопептидазы, могла быть расщеплена всеми этими аминопептидазами (9). Недавние отчеты показали, что серологическая активность аминопептидазы главным образом может быть приписана CD13/аминопептидазе N (31). Это исследование показало, что экспрессия CD13 может быть обнаружена у АМ пациентов с саркоидозом. Эти результаты говорят, что аминопептидаза в ЖБАЛ может быть произведена в легком локально.

Было показано, что аминопептидаза и mRNA индуцируются IFN-gamma (3). IFN-gamma не был обнаружен в ЖБАЛ у пациентов с саркоидозом в этом исследовании (предел чувствительности 20 pg/ml). В другом исследовании, IFN-gamma был обнаружен в сконцентрированном в 5 или 10 раз ЖБАЛ у 12 из 21 пациента с подтвержденным саркоидозом (предел чувствительности 0.4 pg/ml) (33), предполагая, что уровень IFN-gamma может быть более низким чем предел чувствительности в нашем исследовании. Таким образом, все еще возможно, что Th1 цитокины являются ответственными за увеличение активности CD13 / аминопептидазы N в ЖБАЛ у пациентов с саркоидозом. Мы обнаружили, что ЖБАЛ, пациентов с активным легочным саркоидозом, имеет увеличенную активность CD13/аминопептидазы N на моноциты (неопубликованное наблюдение), указывая что фактор(ы), которые участвуют в экспрессии CD13/аминопептидазы N, могут присутствовать при легочном саркоидозе.

Уровни ангиотензинпревращающего фермента, который, как известно, производится эпителиоидными клетками гранулем, выше при клинически активной, чем при бездействующей болезни (34). Однако, в этом исследовании, не имелось никакого значительного увеличения серологических уровней АПФ у пациентов с паренхиматозным вовлечением, что соответствовало предыдущим отчетам, которые показали, что серологические уровни АПФ отражают степень поражения гранулемами всего организма, а не только степень вовлечения легкого, и что измерение серологических уровней АПФ более полезено при мониторинге активности болезни (35). Уровни CD13/аминопептидазы N в ЖБАЛ могут быть более специфическим маркером степени вовлечения легкого при саркоидозе чем серологический уровень АПФ.

Данные, представленные здесь дают возможность, что активность CD13/ аминопептидазы N может служить маркером активности альвеолита при саркоидозе и предполагают, что CD13/аминопептидаза N может участвовать в T-клеточном механизме развития этой болезни. Увеличенная активность аминопептидазы в ЖБАЛ наблюдается не только у пациентов с саркоидозом, но также и при других интерстициальных болезнях легкого типа идиопатического легочного фиброза, облитерирующего бронхиолита и сосудистых болезнях с интерстициальной пневмонией (неопубликованное наблюдение). Поэтому, возможно, что CD13/аминопептидаза N играет важную роль в привлечении лимфоцитов при различных интерстициальных болезнях легкого. Понимание регулирования производства и действия этого фермента может привести к новым способам контроля и лечения интерстициальных болезней легкого.