Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2006;47:1063-1068.

Увеличенные уровни CXCL9 и CXCL10 при саркоидозе глаз

Masaru Takeuchi, Keiko Oh-i, Jun Suzuki, Takaaki Hattori, Aya Takeuchi, Yoko Okunuki, Yoshihiko Usui, and Masahiko Usui
From the Department of Ophthalmology, Tokyo Medical University, Tokyo, Japan.

Резюме

Саркоидоз - хроническая мультисистемная гранулематозная болезнь, характеризованная накоплением активизированных CD4+ T-клеток и моноцитов / макрофагов в пораженных органах. Хемокины необходимы для транссудации лейкоцитов к участку воспаления. Наше исследование было предпринято, чтобы определить, уровни каких хемокинов увеличены в сыворотке пациентов с активным саркоидозом глаз.

В исследование были включены 17 пациентов с установленным саркоидозом глаз, 28 с подозреваемым саркоидозом глаз, 16 с болезнью Бехчета, 17 с болезнью Фогта-Коянаги-Харады и 18 здоровых индивидуумов. Уровни CCL2, CCL5, CXCL8, CXCL9 и CXCL10 в сыворотке были измерены с помощью проточной цитометрии. Кроме того, у пациентов с диагностированным или подозреваемым саркоидозом глаз, определялась корреляция уровней CXCL9 и CXCL10 с активностью болезнью глаз, присутствием двусторонней внутригрудной лимфаденопатии и результатами лабораторных исследований.

Уровни CXCL9 и CXCL10 в сыворотке были заметно увеличены у пациентов с диагностированным или подозреваемым саркоидозом глаз, по сравнению с пациентами с другими типами увеита и здоровыми индивидууами. Хотя CCL2 и CXCL8 были обнаружены в сыворотке всех пациентов, их уровни были чрезвычайно низкими, без существенных различий между группами. Увеличение уровней CXCL9 и CXCL10 при саркоидозе глаз коррелировало с активностью болезни глаз и уровнем АПФ и не было связанно с присутствием двусторонней внутригрудной лимфаденопатии, СОЭ, индексом лейкоцитов, уровнями IgG или лизоцима в сыворотке.

Наши результаты указывают, что серологические уровни CXCL9 и CXCL10 заметно увеличены у пациентов с саркоидозом глаз и коррелируют активностью болезни глаз и уровнем АПФ.

Введение

Саркоидоз - хроническая, мультисистемная, гранулематозная болезнь, которая характеризуется клеточным иммунным ответом на разнообразные антигены (1). Этиология саркоидоза остается неизвестной, возможно из-за разнообразия проявлений болезни и отсутствия четких диагностических критериев. Болезнь глаз может быть начальным проявлением саркоидоза и может приводить к серьезному ухудшению зрения и даже слепоте. Никакие специфические внеглазные проявления саркоидоза не были связаны с развитием поражения глаз или увеита (2, 3).

Хемокины являются семейством цитокинов, участвующих в транссудации лейкоцитов к участку воспаления (4). CCL2/MCP-1 является фактором хемотаксиса моноцитов (5), CXCL8/IL-8 является хемоаттрактантом нейтрофилов (6). Сообщалось, что уровни CCL2 и CXCL8 были увеличены в ЖБАЛ и сыворотке пациентов с активным легочным саркоидозом (7-10). Также было показано, что уровни CCL3/MIP-1alpha, CCL4/MIP-1beta и CCL5/RANTES увеличены в ЖБАЛ пациентов с легочным саркоидозом (11-13). Вследствие того, что CCL3 и CCL5 имеют общий рецептор (CCR5), который сильно экспрессирован на Th1 клетках и что экспрессия мРНК CCR5 в ЖБАЛ пациентов с легочным саркоидозом увеличена, предполагалось, что эти хемокины участвуют в привлечении Th1 клеток из периферического кровообращения к гранулемам при легочном саркоидозе (14,15).

CXCL9/MIG и CXCL10/IP-10 имеют подобную структуру и биологические функции (16,17) и участвуют в селективном привлечении лимфоцитов при саркоидозе. Рецептор CXCL9 и CXCL10, CXCR3 селективно экспрессирован на клетках памяти и активизированных T-клетках, особенно на Th1 клетках (18,19). Сообщалось, что CXCL9 и CXCL10 играют важную роль в патогенезе воспалительных и аутоиммуннных болезней, стимулируя привлечение активизированных Th1 клеток (19,20). Увеличенное число CD4+ T-клеток, экспрессирующих CCR5 и CXCR3, было обнаружено в ЖБАЛ пациентов с легочным саркоидозом. Также была обнаружена положительная корреляция между числом T-клеток, экспрессирующих Th1 цитокины и уровнями CXCR3 и CXCL10 в ЖБАЛ этих пациентов (21,22).

В этом исследовании мы хотели выяснить, увеличены ли серологические уровни хемокинов, включая CCL5, CXCL9 и CXCL10, участвующих в привлечении Th1 клеток у пациентов с активным саркоидозом глаз, по сравнению с уровнями этих хемокинов у здоровым индивидуумов или у пациентов с другими типами увеита.

Пациенты

В исследование были включены 17 пациентов с установленным саркоидозом глаз, 28 с подозреваемым саркоидозом глаз, 16 с болезнью Бехчета, 17 с болезнью Фогта-Коянаги-Харады и 18 здоровых инливидуумов. Саркоидоз глаз был диагностирован в соответствии с критериями Japanese Committee for Diffuse Lung Diseases (23), которые требуют наличия гистологического или клинического диагноза в дополнение к типичным офтальмологическим проявлениям саркоидоза, включая комбинацию гранулематозного ирита с сальными преципитатами или узелками радужной оболочки, трабекулярные узелки, конусообразную периферическую переднюю синехию, помутнения стекловидного тела в виде ''снежных комьев'' или ''нитки жемчуга'', сетчаточный периваскулит и ретинохороидальные очаговые экссудаты.

Гистопатологические исследования саркоидоза обычно проводятся при конъюнктивальной или трансбронхиальной биопсии легкого (TBLB). Клинический диагноз устанавливается, если клинические данные подтверждены данными диагностических тестов. Для этого необходимо проведение шести исследований, включая: 1) отрицательную туберкулиновую кожную пробу; 2) повышенный уровень сывороточного гамма-глобулина; 3) повышенный уровень сывороточного АПФ; 4) повышенный уровень сывороточного лизоцима; 5) положительная сцинтиграфия с 67Ga; и 6) положительный анализ ЖБАЛ. Клинический диагноз считается установленным, если более 3 из 6 диагностических экспертиз дают положительный результат, включая 1) или 3) или обе. Пациенты с подозреваемым саркоидозом глаз имели проявления, типичные для саркоидоза, но не выполняли вышеперечисленные критерии.

Все пациенты имели продолжительное воспаление глаз и у них проводилась терапия местными кортикостероидами. У 3 из 17 пациентов с саркоидозом глаз, у 1 из 28 пациентов с подозреваемым саркоидозом глаз, у 3 из 16 пациентов с болезнью Бехчета и у 7 из 17 с болезнью Фогта-Коянаги-Харады, проводилось лечение системными кортикостероидами. Иммуносупрессоры, такие как циклоспорин и метотрексат, не использовались ни у одного пациента. Все пациенты, имевшие любые системные осложнения, требующие терапии, были исключены из исследования.

Протокол исследования соответствовал Хельсинкской Декларации и был одобрен Internal Review Board of Tokyo Medical University. Информированое согласие было получено у каждого участника исследования.

Результаты

Уровни CCL2, CXCL8, CXCL9 и CXCL10

Уровни CCL2, CCL5, CXCL8, CXCL9 и CXCL10 в сывортоке пациентов с саркоидозом глаз, подозреваемым саркоидозом глаз, болезнью Бехчета и болезнью Фогта-Коянаги-Харады были сравнению со здоровыми индивидуумами. Уровни CCL5 были невыявляемы во всех серологических образцах, исследованных с помощью проточной цитометрии. Уровни CXCL9 были самыми высокими у пациентов с саркоидозом глаз, затем, в порядке уменьшения, у пациентов с подозреваемым саркоидозом глаз и у пациентов с болезнью Бехчета (2461 ± 1489, 1357 ± 1538 и 1143 ± 1627 pg/mL, соответственно), но статистически значимое различие наблюдалось только между пациентами с саркоидозом глаз и здоровыми индивидууами. Уровни CXCL10 в сыворотке также были значительно выше (P < 0.05) у пациентов с саркоидозом глаз, подозреваемым саркоидозом глаз, болезнью Бехчета (1708 ± 769, 1162 ± 702 и 954 ± 534 pg/mL, соответственно) по сравнению со здоровыми индивидуумами (328.1 ± 273 pg/mL). Кроме того, средний уровень CXCL10 в сыворотке пациентов с саркоидозом глаз, был значительно выше, чем у пациентов с болезнью Бехчета (P < 0.05). Хотя CCL2 и CXCL8 были обнаружены в сыворотке всех пациентов, уровни были чрезвычайно низкими и статистически значимого различия между группами пациентов и здоровыми индивидуумами не наблюдалось.

Связь между уровнями CXCL9 и CXCL10 и двусторонней внутригрудной лимфаденопатией

Хотя, согласно критериям, используемым в этом исследовании, присутствие двусторонней внутригрудной лимфаденопатии на рентгенограмме не является необходимым для диагностирования саркоидоза глаз, возможно, что увеличение уровней CXCL9 и CXCL10 при саркоидозе глаз, наблюдаемое в этом исследовании, могут быть связаны с легочной болезнью. Поэтому, мы сравнили уровни CXCL9 и CXCL10 в сыворотке пациентов с диагностированным или подозреваемым саркоидозом глаз, с двусторонней внутригрудной лимфаденопатией (n = 20) и без двусторонней внутригрудной лимфаденопатии (n = 25).

Средний уровень CXCL9 в сыворотке был немного выше у пациентов с саркоидозом глаз с двусторонней внутригрудной лимфаденопатией, чем у пациентов с саркоидозом глаз без двусторонней внутригрудной лимфаденопатии. Однако, статистически значимых различий не наблюдалось. Средний уровень CXCL10 в сыворотке у пациентов с саркоидозом глаз с двусторонней внутригрудной лимфаденопатией был почти таким же, как у пациентов с саркоидозом глаз без двусторонней внутригрудной лимфаденопатии.

Уровни CXCL9 и CXCL10 у пациентов с саркоидозом глаз с активной болезнью и в ремиссии

Поскольку увеличение уровней CXCL9 и CXCL10 в сыворотке пациентов с саркоидозом глаз не было связано с присутствием двусторонней внутригрудной лимфаденопатии, мы исследовали связь уровней CXCL9 и CXCL10 с активностью саркоидоза глаз. Уровни CXCL9 и CXCL10 были измерены у 14 пациентов с саркоидозом глаз с активной болезнью и в ремиссии. Среднее время достижения ремиссии после активной болезни было 1136 дней. Как и ожидалось, серологические уровни CXCL9 и CXCL10 были значительно выше при активной болезни, чем в ремиссии, указывая, что увеличение уровней CXCL9 и CXCL10 в сыворотке связано с активностью болезни глаз.

Связь между уровнями CXCL9 и CXCL10 в сывортке и другими маркерами активности болезни

Мы также исследовали связь между уровнями CXCL9 и CXCL10 в сывортке с другими маркерами активности болезни: реакцией оседания эритроцитов, индексом лейкоцитов, серологическими уровнями IgG, АПФ и лизоцима у пациентов, с диагностированным с или подозреваемым саркоидозом глаз (n = 45).

Уровни CXCL9 и CXCL10 в сыворотке коррелировали с уровнем АПФ (rs = 0.62, P = 0.0004; rs = 0.56, P = 0.0014, соответственно) и уровни CXCL9 в сыворотке также коррелировали с уровнем лизоцима (rs = 0.82, P = 0.0000). Статистически значимой и сильной корреляции (rs > 0.5, P < 0.05) не наблюдалась между уровнями CXCL9 и CXCL10 и другими маркерами активности болезни. Как и ожидалось, статистически значимая корреляция была отмечена между уровнями CXCL9 и CXCL10 (rs = 0.70, P = 0.0000). Уровни лизоцима также коррелировали с уровнями IgG и АПФ (rs = 0.64, P = 0.0034; rs = 0.71, P = 0.0006, соответственно), но корреляции между уровнями IgG и АПФ отмечено не было (rs = 0.33, P = 0.08).

Характеристики пациентов с подозреваемым саркоидозом глаз с высокими уровнями CXCL9 и CXCL10

Поскольку некоторые из пациентов с подозреваемым саркоидозом глаз имели более высокие уровни CXCL9 или CXCL10, чем пациенты с диагностированным саркоидозом глаз, мы впоследствии исследовали характеристики этих пациентов.

6 пациентов с подозреваемым саркоидозом глаз имели уровни CXCL10 более высокие, чем средний уровень CXCL10 у пациентов с диагностированным саркоидозом глаз. Среди них, 2 пациента также имели уровни CXCL9 выше, чем средний уровень CXCL9 у пациентов с диагностированным саркоидозом глаз. Все 6 пациентов имели активный узелковый увеит, типичный для саркоидоза и имели отрицательную туберкулиновую кожную пробу. Кроме того, пациенты с более высокими уровнями CXCL9 и АПФ, имели высокие уровни CXCL10 в сыворотке, что можно было предсказать, исходя из предыдущего анализа.

Обсуждение

Наше исследование показало, что уровни CXCL9 и CXCL10 в сыворотке заметно увеличены у пациентов с саркоидозом глаз по сравнению со здоровыми индивидууами и пациентами с другими типами увеита и что увеличенные серологические уровни CXCL9 и CXCL10 у пациентов с саркоидозом глаз не были связанны с присутствием двусторонней внутригрудной лимфаденопатии, но коррелировали с активностью болезни глаз и уровнем АПФ. Эти результаты также предлагают роль CXCL9 и CXCL10 в механизмах, которые участвуют в миграции активизированных Th1 клеток к глазам и развитию саркоидных гранулем.

Недавние исследования указали на важную роль CXCL9, CXCL10 и CXCR3 в патофизиологии воспалительных и аутоиммуннных болезней (20), ревматоидного артрита, неспецифического язвенного колита (24), болезни Грейвса (25) и рассеянного склероза (26). Увеличенные белковые уровни CXCL10 и увеличенная экспрессия мРНК CXCL10 в ЖБАЛ были обнаружены у пациентов с легочным саркоидозом по сравнению со здоровыми инливидуами (21,27). Положительная корреляция также была обнаружена между уровнем CXCL10 и числом CD45R0+/CD4+ клеток в ЖБАЛ. Однако, уровни CXCL9 и CXCL10 в сыворотке при саркоидозе никогда не изучалась.

В этом исследовании, увеличение уровней CXCL9 и CXCL10 в сыворотке пациентов с диагностированным или подозреваемым саркоидозом глаз не было связанно с присутствием двусторонней внутригрудной лимфаденопатии. Учитывая потенциальный риск проведения инвазивных исследований у пациентов без легочных симптомов, мы не исследовали наличие саркоидных повреждений в легих этих пациентов, имевших двустороннюю внутригрудную лимфаденопатию. Возможно, что некоторые из них имели легочные повреждения, а некоторые нет. Поэтому, мы предполагаем, что уровни CXCL9 и CXCL10 в сыворотке были увеличены по крайней мере у пациентов с активной болезнью глаз, независимо от наличия бессимптомных легочных повреждений.

У всех пациентов с саркоидозом глаз проводилось лечение местными стероидами, причем у 3 пациентов также проводилась системная терапия. Несмотря на системную терапию, уровни CXCL9 в сыворотке были 1529, 1701 и 3884 pg/mL. Соответственно, уровни CXCL10 в сыворотке были 2227, 3151 и 1698 pg/mL. Средние уровни у этих пациентов (CXCL9, 2371 pg/mL; CXCL10, 2356 pg/mL) были в пределах среднего отклонения по всей группе (CXCL9, 2461 ± 1489 pg/mL, CXCL10, 1708 ± 769 pg/mL). Поскольку пациенты с саркоидозом, леченные системными стероидами, имелии более серьезную болезнь глаз, возможно, что влияние стероидов на серологические уровни хемокинов могут блокироваться при серьезной болезни. Мы обнаружили, что серологические уровни CXCL9 и CXCL10 зависели от активности болезни. У одного пациента уровень CXCL9 уменьшился с 1529 pg/mL в острой фазе болезни до 643.8 pg/mL в ремиссии. У другого пациента уменьшение произошло от 1701 pg/mL до 525 pg/mL, в то время как уровень CXCL10 у этих пациентов уменьшился с 2227 до 1112 pg/mL и с 3151 до 1144 pg/mL, соответственно.

CXCL9 и CXCL10 - члены семейства C-X-C хемокинов. Они стимулируют хемотаксис стимулированных человеческих T-лимфоцитов и, как полагают, участвуют в развитии Th1 иммунного ответа, которые стимулируются IFN-gamma и ингибируется IL-4. В этом исследовании, уровни CXCL10 в сыворотке были увеличены не только у пациентов с диагностированным или подозреваемым саркоидозом глаз, но также у пациентов с болезнью Бехчета. Хотя саркоидоз характеризуется персистирующим накоплением макрофагов и активизированных Th1 клеток, а болезнь Бехчета, как известно, также являются Th1 болезнью (28,29), полученные нами результаты, что уровни CXCL10 в сыворотке были выше при саркоидозе глаз, чем при болезни Бехчета и что серологические уровни CXCL9 были увеличены при саркоидозе глаз, но не при болезни Бехчета говорят, что Th1 клетки, экспрессирующие CXCR3, который является рецептором для CXCL9 и CXCL10, могут быть более важными для развития повреждений глаз при саркоидозе, чем при болезни Бехчета.

В рамках исследования мы также измерили серологические уровни IFN-gamma, однако, IFN- gamma был обнаружен только у 3 пациентов с саркоидозом глаз, у 2 пациентов с подозреваемым саркоидозом глаз, у 2 пациентов с болезнью Бехчета и у 4 пациентов с болезнью Фогта-Коянаги-Харады. У остальных пациентов уровни IFN- gamma были невыявляемы (менее 4 pg/mL). Поскольку уровни располагались от 4.3 до 31.9 pg/mL, статистический анализ не мог быть выполнен.

В этом исследовании, уровни CCL5 были невыявляемы, уровни CCL2 и CXCL8 были крайне низкими и никаких различий между пациентами не наблюдались. Уровни CCL5 были увеличены в ЖБАЛ пациентов с легочным саркоидозом (12), но о серологических уровнях ранее не сообщалось. Сообщалось, что уровни CCL2 и CXCL8 были увеличены в ЖБАЛ и сыворотке пациентов с активным легочным саркоидозом (7-10). Эти несоответствия могут происходить из-за различия в методологии исследований. Кроме того, возможно, что различия в уровнях CCL2 и CXCL8 в сыворотке при легочном саркоидозе и саркоидозе глаз, могут отражать специфику повреждения ткани, хотя саркоидные гранулемы имеют одинаковую структуру и в легком и в глазах.

Среди исследованых маркеров активности саркоидоза, только АПФ коррелировал с уровнями CXCL9 и CXCL10 в сыворотке (rs = 0.62, P = 0.0004; rs = 0.56, P = 0.0014, соответственно). Кроме того, АПФ был высоким у 4 из 6 пациентов с подозреваемым саркоидозом глаз, у которых уровень CXCL10 в сыворотке был выше, чем средний уровень CXCL10 в сыворотке у пациентов с диагностированным саркоидозом глаз. Среди этих 4 пациентов с подозреваемой болезнью, 2 также имели уровни CXCL9 в сыворотке выше, чем средний уровень CXCL9 в сыворотке у пациентов с диагностированным саркоидозом глаз.

Недавние исследования сообщили, что серологические уровни IL-12 p40, который стимулирует дифференцирование нативных Th клеток в Th1 клетки, значительно выше при легочном саркоидозе, чем у здоровых индивидуумов (30) и хорошо коррелируют с серологическими уровнями АПФ и лизоцима (31). Хорошая корреляция уровней CXCL9 и CXCL10 с АПФ (CXCL9: rs = 0.62, P = 0.0004; CXCL10: Rs = 0.56, P = 0.0014) может быть связана с Th1 иммунным ответом, который наблюдается при саркоидозе глаз.