American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine Vol 172. pp. 1290-1298, (2005)

Роль CXCR6 и его лиганда CXCL16 в патогенезе T-клеточного альвеолита при саркоидозе

Carlo Agostini, Anna Cabrelle, Fiorella Calabrese, Michela Bortoli, Elisa Scquizzato, Samuela Carraro, Marta Miorin, Bianca Beghe, Livio Trentin, Renato Zambello, Monica Facco and Gianpietro Semenzato
Departments of Clinical and Experimental Medicine, Clinical Immunology and Hematology Branches, Division of Pneumology and Institute of Pathology, Padua University School of Medicine, Padua, Italy

Реферат

Введение: экспрессия рецепторов определяет спектр действий хемокинов на иммунокомпетентные клетки. Ранее мы показали, что рецептор CXCR3 экспрессирован у Th1 клеток в легких пациентов с саркоидозом. Цель: оценка роли Bonzo/CXCR6 и его лиганда CXCL16 в патогенезе саркоидоза. Методы: иммунокомпетентные клетки в легких пациентов с саркоидозом были оценены с помощью проточной цитометрии, конфокальной микроскопии а также с помощью иммуногистохимических, молекулярных и функциональных исследований. Результаты: Th1 клетки, изолированные из ЖБАЛ пациентов с Т-клеточным саркоидным альвеолитом, коэксперссировали CXCR3 и CXCR6. Иммуногистохимический анализ ткани легкого показал, что CXCR6+ T-клетки находились в легочной интерстиции и окружали центральное ядро саркоидной гранулемы. Лиганд CXCR6, CXCL16, экспрессировался макрофагами, которые содержались в саркоидной ткани и/или формировали ядро саркоидной гранулемы. С функциональной точки зрения, саркоидные Th1 клетки в тестах миграции реагировали на CXCL10 и CXCL16. Исследования кинетики in vitro показали, что хотя CXCR3 индуцировался IL-15 и IL-18, индукция CXCR6 происходила медленно (8 дней) и регулировалась IL-15. Заключение: T-клетки, коэкспрессирующие CXCR3 и CXCR6 действуют согласованно с соответствующими лигандами и Th1 воспалительными цитокинами при саркоидном альвеолите и при гранулематозной стадии болезни.

Введение

Результаты недавних исследований продолжают расширять наши знания о сети взаимодействий между иммунокомпетентными клетками, которые определяют патогенеза саркоидоза (5-7). Антиген(ы), который является триггером саркоидоза, вызывает приток клонов Th1 клеток и макрофагов к участкам продолжающегося воспаления. Хемокины и их рецепторы являются ответственными за привлечение T-клеток к участкам саркоидного воспаления (8-10). В частности, было показано, что хемокин IP-10/CXCL10, который производится в ответ на IFN-gamma, является критически важным в рекрутирование Th1 клеток в легкие при саркоидозе (8). Легочные макрофаги - главный клеточный источник этой молекулы. Они секретируют большое количество CXCL10, который, взаимодействуюя со специфическими рецепторами, которые экспрессируются Th1 клетками (CXCR3), усиливает миграционную способность саркоидных T-клеток и вносит вклад в формирование структуры гранулемы. Другим рецептором хемокина у высоко поляризованных Th1 T-клеток является Bonzo/CXCR6. Взаимодействуя с его лигандом CXCL16, этот рецептор является медиатором Th1 воспаления (11-13).

В этом исследовании мы оценили действительно ли Th1 клетки при легочной саркоидозе коэкспрессируют рецепторы CXCR3 и CXCR6. Используя иммуногистохимические тесты, проточную цитометрию и конфокальную микроскопию, мы показали, что CD4+ T-клетки, изолированные из ЖБАЛ пациентов с саркоидозм, коэкспрессируют обе этих молекулы. Кроме того, мы обнаружили, что Bonzo/CXCR6 и CXCL16 стимулируют мощную миграционную активность саркоидных CD4+ T-клеток in vitro. Лиганд CXCR6, CXCL16, экспрессировался легочными макрофагами, эпителиоидными клетками и эпителиальными клетками, формирующими центральное ядро саркоидной гранулемы.

Пациенты

В исследование были включены 18 пациентов с активным саркоидозом (8 мужчин, 10 женщин; возраст от 35 до 72 лет, 3 курящих, 15 не курящих). Активность болезни была определена на основании следующих критериев: (1) лимфоцитарный альвеолит (> 20 x 10³ лимфоцитов / мл), (2) положительный результат сцинтиграфии с цитратом галлия-67, (3) отношение CD4/CD8 в ЖБАЛ более 5.0 (14).

14 образцов ЖБАЛ было получено у пациентов с бездействующей болезнью, которая разрешилась спонтанно или после терапии. 6 образцов ЖБАЛ было получено у 6 здоровых взрослых (4 мужчины и 2 женщины; средний возраст 32.5 ± 4.3 лет) и у 4 пациентов без болезни легкого, которые имели кашель.

Результаты

Число клеток в ЖБАЛ (норма 115,500-195,500 клеток / мл) было значительно выше у пациентов с активным саркоидозом по сравнению с пациентами с бездействующей болезнью (237,446 ± 57,216 против 102,042 ± 27,380; p < 0.001). Абсолютное число лимфоцитов было выше у пациентов с активной болезнью (62,926 ± 11,060) чем у пациентов с бездействующей болезнью (8,343 ± 1,467; p < 0.001). Вследствие увеличения абсолютного числа CD4+ T-клеток, отношение CD4/CD8 в ЖБАЛ было значительно выше у пациентов с активной болезнью (6.47 ± 1.28) по сравнению с пациентами с бездействующей болезнью (2.1 ± 0.29; p < 0.001) и группой контроля (1.7 ± 0.34; p < 0.001).

Экспрессия CXCR6 у саркоидых и нормальных T-клеток

Проточная цитометрия показала, что у пациентов с саркоидозом, которые имеют T-клеточный альвеолит более высокой интенсивности, более 98 % T-лимфоцитов являются CD4+/CD45R0+/IL-12Rbeta2+ клетками, экспрессирующих CXCR3 (CXCR3+ клетки). Средний процент CXCR6+ T-клеток был 49.25 ± 3.06 % у пациентов с активной формой болезни и 20.53 ± 2.90 % у пациентов с бездействующей болезнью (p < 0.01). Нормальные легочные T-клетки показали очень низкую экспрессию CXCR6 (средний процент 5.68 ± 0.81 %).

Интересно, что T-клетки пациентов с активным саркоидозом показали интенсивность экспрессии CXCR6 параллельную степени T-клеточного альвеолита. T-клетки пациентов с активной болезнью, пациентов с бездействующим саркоидозом и группы контроля показали среднюю интенсивность флюоресценции 12.86 ± 3.65, 2.17 ± 0.50, и 1.47 ± 0.55, соответственно (p < 0.001). Однако, небольшое число CD8+ T-клеток, обнаруженных в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом, также экспрессировали CXCR6, хотя их плотность была значительно более низкой, чем плотность CD4+ T-клеток.

Чтобы оценить, коэкспрессированы ли CXCR6 и CXCR3 у саркоидных T-клеток, на очищенных T-клетках ЖБАЛ была выполнена конфокальная микроскопия. T-клетки с очевидной поверхностнй экспрессией CXCR3 также демонстрировали высокую интенсивность экспрессии CXCR6.

Иммуногистохимический анализ экспрессии CXCR6 и CXCL16 на участках активности болезни

Иммуногистохимический анализ подтвердил высокую экспрессию CXCR6 в легочной ткани пациентов с активным саркоидозом. Интересно, что T-клетки, окружающие центральное ядро гранулемы в ткани легкого пациентов с хроническим, рефрактерным саркоидозом, также были CXCR6+.

Иммуногистохимический анализ с антителами к CXCL16 был выполнен, чтобы определить клеточный источник этого хемокина в саркоидных тканях. Центральное ядро саркоидной гранулемы состояло из множества моноцитов / макрофагов в различных состояниях активации и дифференцирования, а также из эпителиоидных клеток и многоядерных гигантских клеток. CXCL16 преимущественно экспрессировался макрофагами, многоядерными гигантскими клетками и эпителиоидными клетками, локализованными внутри гранулемы. Интересно, что иммуногистохимический анализ нативных клеток, полученных у трех пациентов с рефрактреным саркоидозом и легочным фиброзом, у которых была проведена трансплантация легкого, показал, что макрофаги в фиброзной стадии болезни в основном были CXCL16-, принимая во внимание, что альвеолярные эпителиальные клетки демонстрировали сильную реактивность к CXCL16.

Молекулярный анализ экспрессии CXCR6 и CXCL16

Анализ экспрессии мРНК CXCR6 у T-клеток ЖБАЛ с помощью ПЦР показал, что экспрессия мРНК CXCR6 была выше при активном саркоидозе (20.65 ± 5.11), чем у нормальных T-клеток (0.67 ± 0.30; p < .01). Кроме того, анализ экспрессии мРНК CXCR6 у макрофагов ЖБАЛ показал, что экспрессия мРНК CXCL16 была выше при активном саркоидозе (72.26 ± 8.02) чем у нормальных макрофагов (30.40 ± 1.75; p < 0.05).

CXCR6 как медиатор миграции саркоидных T-клеток

Чтобы охарактеризовать биологические свойства CXCR6 и CXCR3, была оценена миграционная способность T-клеток, изолированных из ЖБАЛ пациентов с саркоидозом с T-клеточным альвеолитом, в ответ на CXCL16 и CXCL10. CXCR6+ T-клетки демонстрировали интенсивную миграцию в ответ на CXCL16, предполагая, что легочные T-клетки при саркоидозе экспрессируют функциональный CXCR6 рецептор. Миграционная способность в ответ на CXCL16 была связана с ответом на CXCL10.

Модуляция экспрессии CXCR3 и CXCR6 у T-клеток периферической крови, подвергнутых воздействию саркоидных цитокинов in vitro

Чтобы определить механизмы, ведущие к увеличению экспрессии CXCR3 и CXCR6 у саркоидных T-клеток, T-клетки, выделенные из периферической крови четырех пациентов с активным саркоидозом, были культивированы в присутствии цитокинов, которые активно производятся в легком при саркоидозе, включая IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 и IFN- gamma (16, 17). Интенсивность экспрессии CXCR3 и CXCR6 была оценена с помощью проточной цитометрии после культивировании в присутствии вышеупомянутых цитокинов в течение 2, 18 и 24 часов и после продолжительного культивирования в течение 8 дней. Экспрессия CXCR3 у Т-клеток периферической крови увеличилась через 18 часов инкубации с IL-15 и IL-18 и сохранялась через 24 часа и 8 дней после инкубации.

Экспрессия CXCR6 у Т-клеток периферической крови без стимуляции цитокинами была очень низкой и не увеличивалась после воздействия на T-клетки всех вышеупомянутых цитокинов в экспериментах короткой продолжительности (2-24 часа). Однако, экспрессия CXCR6 наблюдалась после стимуляции 400 U/ml IL-2 через 8 дней. Когда периферические T-клетки были культивированы с IL-15, через 8 дней наблюдалась высокая экспрессия CXCR6. Эффект IL-15 на экспрессию CXCR6 был более сильным, чем у IL-2. Однако, экспрессия CXCR6 у саркоидных T-клеток не увеличивалась при дополнительной стимуляции IL-2, предполагая, что IL-15 способен производить максимальную активацию саркоидных T-клеток, как ранее сообщалось нашей группой. Слабое увеличение экспресии CXCR6 наблюдалось после инкубации с IL-18 и IFN-gamma через 8 дней. Однако, никакого эффекта на экспрессию CXCR6 не наблюдалось, когда T-клетки периферической крови культивировались только в присутствии IL-12. Интересно, что интенсивность экспрессии CXCR6 увеличивалась, когда T-клетки, стимулированные IL-2, дополнительно стимулировались IL-12, IL-18 или IFN-gamma (средняя интенсивность флюоресценции, 70.4, 75.4, и 78.3, соответственно).

Обсуждение

В нашем исследовании получены данные, что взаимодействия между CXCR6 и CXCL16 являются критически важными для привлечения Th1 клеток в саркодные ткани. Мы также показали, что T-клетки, коэксперссирующие CXCR3 и CXCR6 действуют скоординироованно с соответствующими лигандами и Th1 воспалительными цитокинами на участках саркоидного воспаления.

Известно, что CXCR6 экспрессируется Th1 и цитотоксическими Tc1 клетками, но не Th2 и Tc2 клетками и Bonzo был предложен как маркер, позволяющий дифференцировать поляризацию Th1 клеток in vitro и in vivo (11-13). Прайминг нативных T-клеток дендритными клетками стимулирует экспрессию CXCR6 на T-клетках и IL-12, который активно производится в легком при саркоидозе, увеличивает активацию Т-клеток (11). Мы наблюдали, что легочные T-клетки пациентов с острым саркоидозом, имеют увеличенную экспрессию Bonzo. Кроме того, этот рецептор является функционально активным, поскольку что легочные T-клетки реагировали на лиганд в исследованиях хемотаксиса. Феномен привлечения Bonzo+ T-клеток к участкам воспаления не может рассматриваться специфическим для саркоидоза. Фактически, CXCR6 + T-клетки наблюдаются в тканях, пораженных хроническим воспалением при ревматоидном артрите (11), при воспалительной болезни клапанов сердца (18) и при воспалительной болезни печени (19), предполагая, что Bonzo является общим фактором, определяющим трафик Th1/Tc1 лимфоцитов.

Интересно, что CXCR6+ T-клетки были локализованы в области, окружающей центральное ядро гранулемы, указывая, что этот рецептор является важным для формирорвания структуры гранулемы. Unutmaz с коллегами (20), в исследовании экспрессии Bonzo у мышей, используя аденовирус, несущий ген зеленого флуоресцирующего белка, показали что экспрессия зеленого флуоресцирующего белка у CD4+ T-клеток была ограничена субпопуляцией CD44+ T-клеток, предполагая, что Bonzo экспрессирован у этой субпопуляции клеток памяти. Поскольку имеются данные, указывающие, что взаимодействие между CD44 и остеопонтином является важным для развития Th1 гранулемы и в животных моделях и при саркоидозе (21), в нашей лаборатории проводится исследование имеющее целью определить, участвует ли персистирующая секреция цитокинов, которая происходит в легком при саркоидозе (частично воспроизведенная в нашем исследовании при культивировании в течение 8 дней) в привлечении CD44+/CXCR6+ T-клеток и формировании гранулемы.

CXCL16 - первый хемокин, у которого была обнаружена активность рецептора скавенджера (22). CXCL16 может быть экспрессирован в растворимой и трансмембранной форме на дендритных клетках и макрофагах. Кроме того, он связывается с CXCR6 и регулирует миграцию активизированных Th1 и Tc1 клеток (23). Он действует идентично рецептору скавенджера SR-PSOX, который участвует в поглощении окисленных липопоротеинов низкой плотности. В растворимой форме, CXCL16 - хемоаттрактант активизированных CD4+ и CD8+ T-клеток, действующий посредством сцепления с CXCR6. Активность растворимого CXCL16 сильно регулируется ADAM10, членом семейства протеаз ADAM (24). Кроме того, недавние исследования показали, что , что SR-PSOX/CXCL16 не только привлекает T-клетки и естественные киллеры к дендритным клеткам, но также и поддерживает их устойчивую адгезию с клетками, экспрессирующими CXCR6 (22). С молекулярной точки зрения, CXCL16 - мощный активатор ядерного фактора NF-kappaB и стимулирует kappaB-зависимую транскрипцию провоспалительных генов (25). Поскольку воспаление при саркоидозе связано с местной активацией NF-kappaB (26, 27), возможно, что CXCL16 скорее может участвовать в механизмах, ведущих к местной активации T-клеток, чем участвует в усилении миграции T-клеток.

Наши иммуногистологические данные говорят, что саркоидные эпителиальные клетки могут быть клеточным источником CXCL16. Имеет ли экспрессия эпителиальных клеток положительный или отрицательный эффект на местную микросреду, пока не известно. Поскольку трансмембранная форма CXCL16 имеет антимикробную активность (28), возможно, эпителиальные клетки, экспрессирующие CXCL16, могут участвовать во врожденном иммунном ответе против неизвестного саркоидного антигена, который может участвовать в патогенезе болезни (29). Несколько исследований сообщили, что по крайней мере некоторые пациенты с саркоидозом имели болезнь, которая могла быть инициирована микобактериальной инфекцией (30). Шведские исследователи считают, что риккетсии могут участвовать в патогенезе саркоидоза (31). Кроме того, Японские исследователи показали, что Propionibacterium acnes вызывают гранулематозную реакцию при введении сенситизированным крысам и кроликам и могут участвовать в развитии болезни (32-34). Необходимо выяснить, имеют ли саркоидные эпителиальные клетки, которые экспрессируют CXCL16, антибактериальную активность против этих патогенов.

Другая возможность состоит в том, что трансмембранная и растворимая форма CXCL16, которая производится местными антигенпрезентирующими клетками и саркоидными эпителиальными клетками, могут иметь патологический эффект на местную микросреду. Известно, что у пациентов с фиброзом происходит прогрессирующая гибель эпителиальных клеток вследствие апоптоза. Необходимо выяснить, связана ли экспрессия CXCL16 с индуцированием апоптоза эпителиальных клеток. Почти все CXCR6+ Tc1 клетки содержат измененный гранзим А и демонстрируют цитотоксический фенотип. Таким образом, имеется возможность, что эпителиальные клетки, которые обеспечивают непрерывное привлечение CXCR6+ Tc1 клеток, могут вносить вклад в создание местной среды, которая приводит к апоптозу эпителиальных клеток.