Thorax 2004;59:408-413

Вовлечение дендритных клеток при саркоидозе

M Ota, R Amakawa, K Uehira, T Ito, Y Yagi, A Oshiro, Y Date, H Oyaizu, T Shigeki, Y Ozaki, K Yamaguchi, Y Uemura, S Yonezu and S Fukuhara
First Department of Internal Medicine, Kansai Medical University, 10-15 Fumizono-cho, Moriguchi, Osaka 570-8506, Japan Surgical Pathology, Kansai Medical University, 10-15 Fumizono-cho, Moriguchi, Osaka 570-8506, Japan Department of Internal Medicine, Hyogo Prefectural Amagasaki Hospital, 1-1-1 Daimotsu-cho, Amagasaki, Hyogo 660-0828, Japan

Реферат

Введение: саркоидоз - системная гранулематозная болезнь неизвестной этиологии. Было предположено, что поляризация клеток T-хелпер связана с патофизиологией саркоидоза, но механизм смещения иммуного ответа в сторону Th1 не был объяснен. Дендритные клетки (DCs), как известно, регулируют иммунный ответ. Исследование было выполнено, чтобы определить, вовлечены ли DCs в этиологию саркоидоза.

Методы: было проанализировано число DCs в периферической крови у 24 пациентов с саркоидозом и материалы биопсии четырех пациентов были окрашены с использованием моноклональных антител.

Результаты: число миелоидных и лимфоидных субпопуляций DCs было значительно уменьшено и в гранулемах пациентов с саркоидозом были найдены зрелые DCs. T-клетки, производящие интерферон-гамма, были обнаружены в саркоидной гранулеме, также как и T-клетки, производящие IL-4. Двойное окрашивание экземпляра биопсии, использующего анти-фасцин и анти-CD3 антитела показало анатомическое взаимодействие между DCs и T-клетками.

Заключение: наши результаты говорят, что субпопуляции DCs могут мигрировать в вовлеченные ткани, способствуя формированию гранулем при саркоидозе. Вероятно, миграция DCs может регулировать ответ Т-клеток при саркоидозе, по крайней мере в гранулематозных повреждениях.

Саркоидоз - системная гранулематозная болезнь, этиология которой остается неизвестной. При саркоидозе формируются структуры, состоящие из эпителиоидных клеток, фибробластов и нескольких типов иммунных клеток, таких как T-клетки и гистиоциты / макрофаги. Было показано, что гранулематозное воспаление при саркоидозе характеризуется местным смещением баланса в сторону Th1. Однако, остается неясным, как этот доминирующий Th1 ответ индуцируется в процессе формирования гранулемы.

В иммунной системе, дендритные клетки (DCs) являются специализированными антиген-презентирующими клетками (APCs) и играют центральную роль в инициировании и регулировании T-клеточного ответа (2,3). В периферической крови человека было идентифицировано две основных субпопуляции предшественников DCs (4): субпопуляция CD11c+ имеет миелоидное происхождение, в то время как CD11c- плазмацитоидная субпопуляция, также называемая клетками, продуцирующими интерферон альфа /бета (4-7), имеет лимфоидное происхождение. Субпопуляции DCs могут мигрировать в различные ткани, включая лимфоидную ткань, поэтому они расцениваются как циркулирующий пул тканевых DCs (8,9).

Недавнее исследование DCs предположило, что различные субпопуляции по-разному DCs регулируют T-клеточный ответ. CD11c+ способны к поляризации нативных CD4+ T-клеток к Th1 клеткам, производящим IFN-g, в ответ на интерлейкин-12, в то время как CD11c- стимулируют Th2 клетки, производящие IL-4, в ответ на IL-3 (10,11). Появляются свидетельства, что DCs играют важную роль при различных болезнях. Действительно, недавно мы сообщили, что при первичном синдроме Сьёгрена, субпопуляция CD11c + уменьшена из-за селекции трафика клеток из периферической крови в слюнные железы, что предполагает, что DCs вносят существенный вклад в патофизиологию синдрома Сьёгрена (12). Кроме того, привлечение DCs из крови к гранулематозным повреждениям происходит при легочном туберкулезе, предполагая, что DCs также играют определенную роль при этой болезни (13). Эти результаты побудили нас исследовать вопрос, вовлечены ли DCs в патогенез саркоидоза.

Пациенты

Двадцать четыре пациента с саркоидозом (8 мужчин и 16 женщин) которые поступили в нашу клинику между маем 2000 г. и февралем 2002 г., были привлечены в исследование. У всех пациентов саркоидоз был диагностирован клинически и/или гистологически. Стадия болезни классифицировалась согласно системы рентгенологических стадий Вурма (14,15). Во премя исследования, у четырех пациентов проводилось лечение кортикостероидами; остальные 20 пациентов не получали кортикостероиды. Группа контроля состояла из 24 добровольцев, согласованных по возрасту и полу.

Результаты

Численность субпопуляций DCs

Индекс белых клеток крови (WBC) был в пределах нормы (3000-8000 клеток / µl) у 22 из 24 пациентов. Два пациента (номер 1 и 8) имели немного увеличенный индекс WBC. Не имелось никаких существенных различий по индексу WBC между пациентами и группой контроля. Однако, общее количество DCs в периферической крови у пациентов с саркоидозом было значительно уменьшено по сравнению с группой контроля (саркоидоз: 3034 клеток/ml (диапазон 429-7360); группа контроля: 27 434 клеток/ml (диапазон 9775-66 580); p < 0.001). Численность субпопуляций CD11c + и CD11c- также была значительно уменьшена у пациентов с саркоидозом (CD11c+: саркоидоз: 1883 клеток/ml (диапазон 75-5160); группа контроля: 14 118 клеток/ml (диапазон 2426-36 366), p < 0.001; CD11c-: саркоидоз: 1150 клеток/ml (диапазон 215-3112); группа контроля: 13 278 клеток/ml (диапазон 3470-43 410); p < 0.001). Хотя у 4 из 24 пациентов во время исследования проводилось лечение кортикостероидами, подобные результаты также наблюдались у 20 пациентов, которые не получали кортикостероиды (полный индекс DCs в периферической крови: 3412 клеток/ml; CD11c+ клетки: 2148 клеток/ml; CD11c-: 1259 клеток/ml).

Иммуногистохимическое окрашивание саркоидной гранулемы

Было выполнено окрашивание эозином / гематоксилином и иммуногистохимическое окрашивание биоптатов кожи двух пациентов с саркоидозом (номер 1 и 2) и лимфатического узла двух других пациентов (номер 3 и 4). У всех четырех пациентов были получены подобные результаты. Гистологическая экспертиза показала паттерн, типичный для саркоидной гранулемы, эпителиоидное ядро, окруженное слоем лимфоцитов, с большим количеством CD4+ клеток и меньшим числом CD8+ клеток. Множество фасцин-положительных (специфический маркер зрелых DCs) мононуклеарных клеток также было найдено в этом слое, также как LAMP-положительных клеток (другой специфический маркер DCs) и HLA-DR положительных клеток. Двойное окрашивание анти-фасцин и анти-HLA-DR антителами показало, что фасцин-положительные клетки в основном были HLA-DR положительными. Однако, также были обнаружены HLA-DR положительные и фасцин-отрицательные клетки. С другой стороны, двойное окрашивание анти-фасцин и анти-CD3 антителами показало, что многие CD3+ клетки контактировали с фасцин-положительными мононуклеарными клетками, предполагая, что DCs функционально взаимодействуют с T-клетками в гранулематозных повреждениях при саркоидозе.

Мы также обнаружили, что многие клетки в окружении ядра гранулемы производили IFN-g. Существенное число клеток, производящих IL-4, также были обнаружены не только в окружении, но и внутри эпителиоидного ядра гранулемы. Двойное окрашивание для IL-4 и CD3 показало существование трех типов клеток: IL-4+ CD3+ клетки, IL-4+ CD3- клетки и IL-4- CD3+ клетки.

Обсуждение

В последнее время накоплены данные, что при воспалительных состояниях, подобных инфекциям, в ответ на сигналы опасности в виде цитокинов и хемокинов, происходит инфильтрация тканей дендритными клетками (2,3). Поэтому мы выдвинули гипотезу, что при саркоидозе, DCs мигрируют из периферической крови к гранулематозным повреждениям, где они накапливаются, таким образом уменьшая число DCs в периферической крови. В поддержку этой гипотезы мы обнаружили, что у пациентов с саркоидозом число DCs в периферической крови было значительно уменьшено. Это уменьшение было результатом существенного уменьшения и миелоидой субпопуляции CD11c+ и лимфоидной субпопуляции CD11c-. Гистологически, множество фасцин-положительных и HLA-DR-положительных клеток и фасцин-положительных и LAMP-положительных клеток было найдено в лимфоцитарном окружении гранулемы, но не в ее эпителиоидном ядре.

На основании этих результатов мы заключили, что множество зрелых DCs проникло только в лимфоцитарное окружение саркоидной гранулемы. Уменьшение числа незрелых DCs в периферической крови и накопление зрелых DCs в гранулеме предполагает, что процесс созревания DCs происходит в течение их движения из крови к гранулеме, или по достижении гранулемы. Предыдущие исследования предположили присутствие DCs в саркоидных гранулематозных повреждениях из-за обнаружения S-100-положительных клеток (18). Однако, белок S-100 не является высоко специфическим маркером DCs. Наше исследование показало, что DCs проникают в саркоидные гранулемы человека. Недавно мы показали, что привлечение субпопуляций DCs к воспалительным повреждениям может происходить у пациентов с туберкулезом (13). Однако, субпопуляции DCs, численность которых преобладающе уменьшается в периферической крови и степень уменьшения, отличается между туберкулезом и саркоидозом. При туберкулезе, число миелоидых DCs, но не лимфоидных DCs, значительно уменьшено в периферической крови, принимая во внимание, что при саркоидозе численность обех субпопуляций DCs значительно уменьшена, предполагая различный уровень вовлечения DCs в патофизиологию этих двух болезней.

В модели саркоидоза у мышей, число предшественников CD11c+ в периферической крови было увеличено и предшественники DCs мигрировали из периферической крови к индуцированным Propionibacterium acnes гранулемам в печени (19). Эти данные отличается от результатов нашего исследования. Это несоответствие может отражать различные условия исследования; исследование (19) наблюдало острую стадию формирования гранулем, индуцированного бактериальной инфекцией, в то время как мы исследовали стабильную хроническую болезнь.

Мы обнаружили множество T-клеток, производящих IFN-g, главным образом в лимфоцитарном окружении гранулемы. Они могли быть CD4+ или CD8+ клетками, потому и CD4+ и CD8+ T-клетки были обнаружены в окружении гранулемы. Предыдущие исседования показали, что Th1 клетки, производящие IFN-g, преобладающе накапливаются в саркоидных гранулематозных повреждениях, подчеркивая важность Th1, но не Th2 ответа при саркоидозе (1, 20-23). Однако, в эпителиоидном ядре гранулемы мы также обнаружили существенное число CD3+ клеток, производящих IL-4. Это указывает на присутствие Th2 клеток или T-клеток цитотоксического типа 2 (Tc2), и предполагает определенную функциональную роль этих клеток. Было предположено, что Th2 клетки могут играть важную роль в легочном фиброзе у пациентов с саркоидозом (24). Однако, все пациенты в этом исследовании, продемонстрировали присутствие T-клеток, производящих IL-4, несмотря на отсутствие легочного фиброза. Одна из возможностей состоит в том, что T-клетки, производящие IL-4, являются механизмом обратной связи, который уменьшает Th1 ответ, потому что IL-4, как известно, противодействует производству IFN-g (10). Интересно, что в гранулеме также были обнаружены CD3 клетки, производящие IL-4, особенно в эпителиоидном ядре. Они могли бы быть тучными клетками, которые, как известно, присутствуют в гранулематозных тканях (25).

DCs играют существенную роль в индукции антиген-специфического T-клеточного ответа (2,3). В рамках парадигмы DC1/DC2, DC1 (миелоидые DCs) дифференцируют нативные T-клетки в Th1 клетки, в то время как DC2 (лимфоидные DCs) дифференцируют нативные T-клетки в Th2 клетки (10). Поэтому возможно, что T-клетки, производящие IFN-g, и T-клетки, производящие IL-4, найденные в саркоидной гранулеме, производятся при взаимодействии с DCs 1 и DCs 2, соответственно. Действительно, двойное окрашивание анти-фасцин и и анти-CD3 показало анатомическое взаимодействие между DCs и T-клетками в лимфоцитарном окружении саркоидной гранулемы. Необходимы дальнейшие исследования профиля экспрессии различных цитокинов и других молекул, чтобы более точно объяснить природу взаимодействия между этими типами клеток.