Участие домена рецептора дискоидина 1 в ухудшении легочного саркоидоза

American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. Vol. 33, pp. 565-573, 2005

Участие домена рецептора дискоидина 1 в ухудшении легочного саркоидоза

Wataru Matsuyama, Hideo Mitsuyama, Masaki Watanabe, Yuko Shirahama, Ikkou Higashimoto, Mitsuhiro Osame and Kimiyoshi Arimura
Division of Respiratory Medicine, Respiratory and Stress Care Center, Kagoshima University Hospital, Kagoshima, Japan

Реферат

Прогноз саркоидоза с легочными инфильтратами отличается в каждом отдельно взятом случае. Сообщалось, что некоторые цитокины вносят вклад в ухудшение саркоидоза, однако, детальный механизм полностью объяснен не был. Рецептор домена дискоидина 1 (DDR1) - рецептор тироксин киназы, активизированный коллагеном и связанный с производством цитокинов воспалительными клетками. Ранее мы сообщали о функциональной экспрессии DDR1 на CD14+ клетках жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ) in vivo. В этом исследовании мы выдвинули гипотезу, что DDR1 может быть связан с ухудшением легочного саркоидоза. Мы ретроспективно исследовали 33 пациента с саркоидозом с легочными инфильтратами и обнаружили, что пациенты с ухудшением легочного саркоидоза, имели значительно более высокую экспрессию DDR1 у CD14+ клеток ЖБАЛ, преобладающе изоформы DDR1b. Активация DDR1 вызывала производство хемоаттрактанта моноцитов MCP-1 и матриксной металлопротеиназы-9 (MMP-9) у активизированных p38 MAPK CD14+ клеток ЖБАЛ пациентов с ухудшением саркоидоза. Активация DDR1 также индуцировала транслокацию NF-kappaB у CD14+ клеток ЖБАЛ у пациентов с ухудшением легочного саркоидоза. Ингибитор NF-kappaB ингибировал производство MCP-1 и MMP-9. Мы предполагаем, что DDR1 связан с ухудшением легочного саркоидоза.

Введение

Легочный саркоидоз - системная болезнь неизвестной этиологии, характеризованная присутствием неказеозных гранулем (1). Легкие и внутригрудные лимфатические узлы поражаются у 90 % пациентов с легочным саркоидозом. Хотя разрешение воспалительного процесса происходит спонтанно в 80 % случаев, ухудшение происходит в 10-20 % случаев (1-3). Считается, что при прогрессе легочного саркоидоза, хемокины, такие как хемоаттрактант моноцитов MCP-1 (4), и коллагеназы, например матриксная металлопротеиназа 9 (MMP-9), вносят вклад в необратимое ремоделирование архитектуры легкого (4, 5). Однако, детальный молекулярный механизм, который ведет к ухудшению легочного саркоидоза, полностью объяснен не был.

Рецептор домена дискоидина 1 (DDR1) - рецептор тироксин киназы, активизируется при сцеплении с его лигандом, коллагеном (6, 7). DDR1 имеет уникальную внеклеточную область, которая является гомологичной дискоидину 1 у миксомицетов Dictyostelium discoideum (8). DDR1 экспрессирован в нормальных тканях, легком, почках, толстой кишке и мозге также в клетках опухоли эпителиального происхождения, например в карциноме молочной железы, яичников и легкого (8). Альтернативный сплайсинг гена DDR1 может производить 5 изоформ DDR1 (a, b, c, d и e) (8, 9). Ранее мы сообщили, что экспрессия двух изоформ DDR1, DDR1a и DDR1b, может быть индуцирована in vitro у лейкоцитов человека. Исследования in vivo показали, что проникающие в ткань мононуклеарные клетки, особенно макрофаги, были позитивными для мРНК DDR1 (10). Изоформы DDR1a и DDR1b отличаются друг от друга вставкой 111 bp в пределах рамки считывания, которая кодирует дополнительный пептид 37-aa в юкстамембранном регионе. Вставка 37-aa в изоформе DDR1b содержит мотив LXNPXY (8). Кроме того, недавно мы обнаружили, что при идиопатическом легочном фиброзе, активация DDR1, наиболее вероятно изоформы DDR1b, приводит к дозозависмому увеличению производства MCP-1 и MMP-9 CD14+ клетками ЖБАЛ при стимуляции активизированной митогеном p38 протеинкинзой (MAPK) (11).

Ухудшение легочного саркоидоза связано с производством, накоплением и протеолизом внеклеточного матрикса легкого (2, 12), который содержит большое количество лиганда DDR1, коллагена (13). Поэтому, мы выдвинули гипотезу, что DDR1 может быть связан с прогнозом легочного саркоидоза и исследовали экспрессию DDR1 у пациентов с легочным саркоидозом. Мы обнаружили, что CD14+ клетки ЖБАЛ пациентов с ухудшением легочного саркоидоза, экспрессируют DDR1 с преобладанием изоформы DDR1b, принимая во внимание, что изоформа DDR1a преобладала у пациентов со стабилизацией или улучшением легочного саркоидоза. Активация DDR1 у пациентов с ухудшенным легочного саркоидоза вызвала производство MCP-1 и MMP-9 с участием p38 MAPK.

Пациенты

В исследование были включены 33 пациента с подтвержденным легочным саркоидозом, у которых степень поражения легкого была оценена в нашей клинике с помощью КТ в период с 1995 до 2003 г. Для постановки диагноза использовались критерии ATS/ERS/WASOG (2, 3); обнаружение неказеозных гранулем; отсутствие микобактериальной инфекции; отсутствие воздействия аэтоконтаминантов или лекарственных средств, способных производить гранулематозные болезни. Гистологическое подтверждение саркоидоза было получено при бронхиальной и трансбронхиальной биопсии у 27 пациентов, при средостенной биопсии у 3 пациентов и при открытой биопсии легкого у 3 пациентов. Пациенты с только двусторонней внутригрудной лимфаденопатией (стадия I) и с легочным фиброзом (стадия IV) были исключены из исследования, потому что спонтанная ремиссия обычна в стадии I и не наблюдается в стадии IV (2). Чтобы оценить изменения, через 3, 6, 12, 15, 18 и 24 месяцев были проведены рентгенограмма, исследование функции легких и исследование газов артериальной крови. В начале иследования, ни у одного пациента не проводилось лечение кортикостероидами. Рентгенограммы и результаты исследования функции легких сравнивались с первоначальными данными и классифицировались как улучшение (группа 1), стабилизация (группа 2) или ухудшение (группа 3). Классификация производилась радиологом и пульмонологом вслепую, без знания любых клинических данных пациентов. В группу контроля были включены 14 здоровых добровольцев (средний возраст 57.8 ± 17.8 лет; отношение мужчины/женщины 6/8). Все пациенты и добровольцы дали письменное информированное согласие на участие в исследовании. Исследование было одобрено Kagoshima University Faculty of Medicine Committee on Human Research.

Результаты

Клинические особенности

У 12 пациентов наблюдалось улучшение (группа 1), у 8 стабилизация (группа 2) и 13 пациентов ухудшились (группа 3). Процент лимфоцитов и нейтрофилов был значительно выше и процент макрофагов был значительно ниже у пациентов с саркоидозом чем в группе контроля. Не имелось существенных различий клеточного состава ЖБАЛ в группе 1, группе 2 и группе 3. Кортикостероидная терапия была начата у всех пациентов в группе 3, у половины пациентов в группе 2, из-за ухудшения симптомов, не связанных с легочным саркоидозом и ни у одного пациента в группе 1. Процент DDR1+ клеток был значительно выше в группе 3, чем в других группах. Не имелось существенного различия в проценте DDR1+ клеток между пациентами с рентгенографической стадией II и III (стадия II: 18.2 ± 8.9 %, стадия III: 16.1 ± 9.9 %). Не имелось существенного различия по уровню другого рецептора коллагена, бета1 интегрина (20) между группами пациентов. Уровни MCP-1 и MMP-9 в ЖБАЛ были значительно выше в группе 3, чем в других группах пациентов и группе контроля. Уровни MCP-1 и MMP-9 в ЖБАЛ в группе 3, имели положительную корреляцию с процентом DDR1+ клеток в ЖБАЛ (MCP-1: r = 0.675; P < 0.001. MMP-9: r = 0.619; p < 0.001). Также, уровень MCP-1 в ЖБАЛ имел существенную корреляцию с MMP-9 в группе 3 (r = 0.632; p < 0.001).

CD14+ клетки ЖБАЛ у пациентов с ухудшением саркоидоза

Общее количество DDR1 у CD14+ клеток ЖБАЛ было наибольшим в группе 3. DDR1b был преобладающей изоформой в этой группе пациентов, принимая во внимание, что DDR1a был преобладающей изоформой в других двух группах. В группе 3, общее количество DDR1 и относительное количество DDR1b было значительно выше, чем в других двух группах (p < 0.01). В группе 3 пациентов, относительное количество DDR1b было значительно выше, чем относительное количество DDR1a (p < 0.01).

Иммуногистохимический анализ экспрессии DDR1

Воспалительные клетки в саркоидных повреждениях пациентов группы 3 положительно окрашивались для DDR1. Многоядерные гигантские клетки также полопжительно окрашивались для DDR1. Образцы тканей трех разных пациентов группы 3 показали одинаковые результаты.

Стимуляция DDR1, индуцированная коллагеном и p38 MAPK фосфорилированием

p38 MAPK фосфорилирование вызывало стимуляцию DDR1 у CD14+ клеток ЖБАЛ в группе 3, но не в других группах пациентов. Результаты стимуляции коллагеном были аналогичными. Уровень фосфорилирования был значительно выше в группе 3, чем в других группах.

Активация DDR1 увеличивает производство MCP-1 CD14+ клетками ЖБАЛ у пациентов с ухудшением саркоидоза

Стимуляция DDR1 коллагеном и p38 MAPK, значительно увеличивает производство MCP-1 CD14+ клетками ЖБАЛ в группе 3. В предварительных экспериментах, мы культивировали CD14+ клетки в течение различного времени (4, 8, 12, 24, 36 и 48 часов) и обнаружили, что культивирование в течение 24 ч является оптимальным, потому что уровни MCP-1 в группе 3 достигли максимума через 24 ч и оставались увеличенными. В других группах, стимуляция не увеличивала производство MCP-1. Производство MCP-1 ингибировалось ингибитором p38 MAPK, SB203580.

Стимуляция DDR1 вызвала производство MMP-9 CD14+ клетками ЖБАЛ у пациентов с ухудшением саркоидоза

Стимуляция DDR1 также вызвала производство MMP-9 CD14+ клетками ЖБАЛ пациентов группы 3. В предварительных экспериментах, мы культивировали CD14+ клетки в течение различного времени (4, 8, 12, 24, 36 и 48 часов) и обнаружили, что культивирование в течение 24 ч является оптимальным, потому что уровни MMP-9 достигли максимума через 24 ч и вернулись начальным уровням через 48 ч, принимая во внимание, что уровни MMP-2 и тканевых ингибиторов металлопротеиназы (TIMPs) не изменялись. MMP-9 производился CD14+ клетками ЖБАЛ. Производство MMP-9 ингибировалось ингибитором p38 MAPK, SB203580. Стимуляция DDR1 не вызывала увеличения производства MMP-2, TIMP-1 или TIMP-2 CD14+ клетками ЖБАЛ в других группах пациентов или в группе контроля.

Активация DDR1 у клеток ЖБАЛ пациентов с ухудшением легочного саркоидоза вызвала транслокацию NF-kappaB

Активация DDR1 у CD14+ клеток ЖБАЛ пациентов с ухудшением легочного саркоидоза вызывала транслокацию NF-kappa. Эта транслокация не происходила в других группах. В предварительных экспериментах, мы исследовали транслокацию NF-kappaB через 3, 6, 9 и 12 часов и обнаружили, что транслокация достигла максимума через 6 часов и затем уменьшалась. Транслокация ингибировалась ингибитором p38 MAPK. Эксперимент был повторен с образцами 5 различных пациентов и были получены подобные результаты.

Производство MCP-1 и MMP-9 клетками ЖБАЛ пациентов с ухудшением легочного саркоидоза является NF-kappaB-зависимым

Индуцированное DDR1 производство MCP-1 и MMP-9 клетками ЖБАЛ пациентов с ухудшением легочного саркоидоза ингибировалось ингибитором NF-kappaB, CAPE. Диметилсульфоксид не ингибировал производство MCP-1 или MMP-9.

Кортикостероиды ингибируют индуцированное DDR1 производство цитокинов CD14+ клетки ЖБАЛ но не изменяют экспрессию или паттерн изоформ DDR1

Кортикостероиды часто используются при лечении пациентов с ухудшением легочного саркоидоза. Поэтому, мы исследовали влияние коллагена и кортикостероидов на индуцированное DDR1 производство цитокинов CD14+ клетками ЖБАЛ пациентов группы 3. Инкубация CD14+ клеток ЖБАЛ с дексаметазоном, значительно уменьшила индуцированное DDR1 производство MCP-1 и MMP-9 CD14+ клетками ЖБАЛ пациентов группы 3. В предварительных экспериментах, мы производили инкубацию CD14+ клеток ЖБАЛ с различными концентрациями дексаметазона (0.01, 0.1, 0.5 и 1 µM) и обнаружили, что концентрация 0.1 µM была оптимальной, поскольку подавляющий эффект был максимальным при этой концентрации. Инкубация с дексаметазоном и коллагеном не показала никакого влияния на экспрессию или паттерн экспрессии изоформ DDR1 во всех группах пациентов.

Обсуждение

Это первое сообщение, описывающее роль DDR1 при легочном саркоидозе. Прогноз легочного саркоидоза отличается в различных рентгенографических стадиях. Спонтанная ремиссия происходит в 40-70 % (стадия II) и в 10-20 % (стадия III), принимая во внимание, что у других пациентов происходит стабилизация болезни или ухудшение (2). Однако, молекулярные механизмы ухудшения не были полностью объяснены. Наше исследование показало, что пациенты с ухудшением легочного саркоидоза имели высокую экспрессию DDR1 с преобладанием изоформы DDR1b, по сравнению с пациентами с улучшением или стабилизацией легочного саркоидоза. Кроме того, инкубация CD14+ клеток ЖБАЛ с коллагеном, который является лигандом DDR1 (7), не влияла на экспрессию DDR1 или паттерн экспрессии изоформ DDR1. Конечно, мы не можем отрицать возможное существование других факторов, которые могут регулировать экспрессию DDR1. Однако, мы полагаем, что DDR1b участвует в ухудшении легочного саркоидоза. Поскольку DDR1b , но не DDR1a, имеет участок сцепления с Shc, адапторным белком, который имеет разнообразные действия при передаче клеточных сигналов (21), эта изоформа может передавать сигналы ядру (22). Кроме того, изоформа DDR1b была связана с производством цитокинов (11), которые связаны с патогенезом легочного саркоидоза (4, 12). Поскольку возможности нашего исследования не позволяют сделать категорические заключения, необходимы дальнейшие исследования, чтобы оценить прогностическую ценность DDR1 при легочном саркоидозе.

Наше исследование показало, что активация DDR1 вызвала производство MCP-1 и MMP-9 у CD14+ клеток ЖБАЛ у пациентов с ухудшением легочного саркоидоза. Кроме того, процент DDR1+ клеток ЖБАЛ имел существенную положительную корреляцию с уровнями MCP-1 и MMP-9 в ЖБАЛ. Сообщалось о связи уровней MCP-1 и MMP-9 с клиническими особенностями легочного саркоидоза. При легочном саркоидозе, уровни MMP-9 в мокроте сильно коррелировали с отношением CD4/CD8 в ЖБАЛ и диффузионной способностью (12). Фактически, пациенты с легочным саркоидозом с легочным фиброзом имеют высокие уровни MMP-9 в ЖБАЛ (5). Матриксные металлопротеиназы (MMPs) - семейство цинк- и кальций-зависимых эндопептидаз, способных к протеолитической деградации многих компонентов внеклеточного матрикса (23). Тканевый ингибитор металлопротеиназы-1 (TIMP-1) - эндогенный ингибитор MMPs (24). При болезнях легкого, MMPs связаны с восстановлением бронхиального эпителия (25). Считается, что дисбаланс между MMPs и TIMPs вносит вклад в развитие интерстициальных болезней легкого (26). При легочном саркоидозе, этот дисбаланс связан с цитотоксическими CD8+ T-лимфоцитами и повреждением ткани (12). В легком, альвеолярные макрофаги, которые могут экспрессировать эндогенный DDR1 (11), являются главным клеточным источником MMP-9 (27). С другой стороны, MCP-1 принадлежит суперсемейству C-C хемокинов, которые участвуют в привлечении и активировании лейкоцитов в течение процесса воспаления, включая моноциты, незрелые дендритные клетки, базофилы, естественные киллеры и субпопуляции T-лимфоцитов (28). Передача сигнала MCP-1 происходит через рецептор CCR2 (29). MCP-1 производится различными типами клеток. Сообщалось, что в легком, мРНК MCP-1 экспрессирована у эпителиальных клеток, макрофагов и эндотелиальных клеток (30), которые экспрессируют эндогенный DDR1 (11, 31). Экспрессия MCP-1 изучалась в ЖБАЛ при интерстициальных болезнях легкого, но, до недавнего времени, эти исследования преобладающе проводились при фиброзирующем альвеолите (30), чем при саркоидозе (32). Сообщалось об увеличении уровней MCP-1 у пациентов с саркоидозом (33). Кроме того, сообщалось об увеличении уровней MCP-1 в ЖБАЛ у пациентов с легочным саркоидозом с рентгенографической стадией II и у пациентов с персистирующим и рекуррентным легочным саркоидозом и предполагалось, что MCP-1 связан с формированием гранулем или альвеолитом при легочном саркоидозе (4, 34). Сообщалось, что DDR1 был необходимым фактором для производства MMP-9 (35). Активация DDR1 может стимулировать производство MCP-1 макрофагами посредством p38 MAPK (11, 17). Мы предполагаем, что DDR1 связан с молекулярным патогенезом ухудшения легочного саркоидоза.

Хотя были проведены многочисленные исследования профиля цитокинов при легочном саркоидозе, относительно передачи клеточных сигналов при легочном саркоидозе известно мало. Сообщалось о роли NF-kappaB при легочном саркоидозе. При легочном саркоидозе, активность гамма-рецептора пролифератора-активатора пероксисом (PPAR-gamma) является слишком низкой, чтобы подавить активность NF-kappaB (36); В свою очередь, увеличенная активность NF-kappaB, связана с увеличенным производством цитокинов клетками ЖБАЛ (37). Активация DDR1 может стимулировать производство хемокинов стимулированными форболмиристатацетатом THP-1 клетками, которые имеют характеристики макрофагов (38), в зависимости от уровня NF-kappaB (17). Наше исследование показало, что активация DDR1 у клеток ЖБАЛ пациентов с ухудшением легочного саркоидоза, вызывала существенное усиление транслокации NF-kappaB. Кроме того, производство MCP-1 и MMP-9 при активации DDR1 является NF-kappaB-зависимым. Поэтому, мы полагаем, что DDR1 может быть одной из молекул передачи сигналов NF-kappaB при легочном саркоидозе. Наше исследование также показало, что активацию DDR1 вызвало p38 MAPK фосфорилирование. Относительно роли p38 MAPK при легочном саркоидозе известно мало. p38 MAPK связан с производством нескольких цитокин, например MCP-1 (17), который связан с ухудшением легочного саркоидоза. Мы не можем утверждать, что p38 MAPK является важным фактором при ухудшении легочного саркоидоза, однако, мы не можем отрицать возможную связь p38 MAPK с ухудшением легочного саркоидоза, поэтому необходимы дальнейшие исследования.

Кортикостероиды часто используются при ухудшении легочного саркоидоза (1). В нашем исследовании, инкубация CD14+ клеток ЖБАЛ с кортикостероидами не влияла на степень или паттерн экспрессии DDR1, однако, кортикостероиды ингибировали индуцированное DDR1 производство MCP-1 и MMP-9 CD14+ клетками ЖБАЛ пациентов группы 3. Известно, что кортикостероиды могут ингибировать передачу внутриклеточных сигналов, которые активизируют NF-kappaB (39, 40). Поэтому, мы полагаем, что кортикостероиды могут ингибировать внутриклеточный сигнал DDR1, который активизирует NF-kappa B. Исследование передачи сигнала DDR1 в присутствии или отсутствии кортикостероидов могло бы быть полезным при разъяснении природы внутриклеточной передачи сигнала DDR1 при легочном саркоидозе.

Поверхностные клеточные рецепторы, такие как бета1-интегрины, являются другим известным рецептором коллагена и лигирование бета1интегрина может стимулировать экспрессию провоспалительных цитокинов у моноцитов (20). Однако, экспрессия интегринов является низкой или невыявляемой на макрофагах (41, 42), предполагая присутствие других рецепторов коллагена, которые могут стимулировать производство цитокинов макрофагами. Действительно, наше исследование показало существенное различие уровней экспрессии DDR1 между пациентами с ухудшенным легочного саркоидоза и другими группами, принимая во внимание, что не имелось существенных различий в проценте бета1-интегрин-позитивных альвеолярных макрофагов. Поэтому, мы полагаем, что вклад DDR1 в ухудшение легочного саркоидоза больше, чем вклад бета1-интегринов.

Наше исследование обнаружило участие DDR1 в ухудшении легочного саркоидоза. Для легочного саркоидоза в Азии, человеческий лейкоцитарный антиген DRB1, влияет на риск развития саркоидоза и прогресса болезни (43) и связан с риском персистирующего саркоидоза (44). Локус гена человеческого лейкоцитарного антигена DRB1 (6p21.3, Online Mendelian Inheritance inMan [OMIM] no. 142,857) очень близко расположен с DDR1 (6p21.3OMIM no. 600,408) (45). Кроме того, локус гена BTNL-2 (BTNL-2, 6p21.3, OMIM no. 606,000), также близко расположен к DDR1 и связан с риском развития саркоидоза в Европе (46). Поэтому, мы полагаем, что DDR1 может быть связан с патогенезом легочного саркоидоза. Целью наших будущих исследований будет связь DDR1 с патогенезом легочного саркоидоза.