Am. J. Respir. Crit. Care Med., Volume 158, Number 2, August 1998, 589-596

Высокая экспрессия марганцевой супероксиддисмутазы, но не медно-цинковой супероксиддисмутазы в гранулемах при легочном саркоидозе и аллергическом альвеолите

ESSI LAKARI, PAAVO PAAKKO, and VUOKKO L. KINNULA
Departments of Internal Medicine and Pathology, University of Oulu, and Oulu University Hospital, Oulu, Finland

Реферат

Роль механизмов антиоксидантной защиты в патогенезе гранулематозных болезней легкого у человека остается открытой для исследования. Мы исследовали иммунореактивность двух важных внутриклеточных антиоксидантных ферментов, марганцевой супероксиддисмутазы (MnSOD) и медно-цинковой супероксиддисмутазы (CuZnSOD) при легочном саркоидозе и аллергическом альвеолите. В гистологически нормальном легком, экспрессия MnSOD была переменной, главным образом в клетках бронхиального эпителия, альвеолярного эпителия, особенно у пневмоцитов типа II и альвеолярных макрофагов. CuZnSOD имела наиболее заметную иммунореактивность в бронхиальном эпителии. Биопсия, проведенная у 22 пациентов с легочным саркоидозом и у 10 с аллергическим альвеолитом показала, что MnSOD окрашивалась в гранулемах при обеих болезнях в 60-100 % гранулем. Вестерн-блоттинг клеток бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), показал значительно более высокое количество MnSOD при саркоидозе и аллергическом альвеолите, чем в группе контроля. Иммуногистохимическое исследование клеток БАЛ показало положительную иммунореактивность MnSOD у макрофагов, но не у лимфоцитов. Напротив, CuZnSOD не была индуцирована при любой из этих болезней. Мы заключаем, что при легочном саркоидозе и аллергическом альвеолите наблюдается высокая экспрессия MnSOD в гранулемах, главным образом у альвеолярных макрофагов, возможно индуцированная цитокинами в процессе формирования гранулемы.

Введение

Патогенез гранулематозных болезней связан со сложными клеточными иммунными реакциями. Основные типы клеток, вовлеченные в формирование гранулемы - CD4+ T-лимфоциты, альвеолярные макрофаги, моноциты и эпителиальные клетки (1). Привлечение и активация воспалительных клеток и лимфоцитов и роль различных цитокинов в патогенезе гранулематозных болезней исследованы относительно хорошо (2), принимая во внимание, что возможная роль свободных радикалов или клеточных механизмов антиоксидантной защиты при формировании гранулемы практически не исследованы (5), и только одно исследование было проведено на клетках человека (6).

Активация воспалительных клеток приводит к генерации свободных радикалов (7, 8). Реактивные метаболиты кислорода и цитокины, как известно, индуцируют марганцевую супероксиддисмутазу (MnSOD) в различных клетках. Этот митохондриальный фермент индуцируется воспалительными цитокинами, такими как фактор некроза опухоли альфа (TNF-alpha), интерлейкин-1 (IL-1), интерлейкин -6 (IL-6) (9), высоким уровнем кислорода в легких у подвергнутых гипероксии животных (17- 19) и при изменении состояния клеточного окислительно-восстановительного потенциала. Медно-цинковая супероксиддисмутаза (CuZnSOD) не индуцируется цитокинами или гипероксией в той же степени, как MnSOD (15, 16, 20).

Экспрессия mRNA MnSOD обычно низкая в нормальном легком и высокая у альвеолярных пневмоцитов типа II, альвеолярных макрофагов, интерстициальных фибробластов и в висцеральной плевре подвергнутых гипероксии крыс (19, 21). CuZnSOD была экспрессирована у альвеолярных эпителиальных клеток, фибробластов и капиллярных эндотелиальных клеток у крыс (19). Оба эти фермента слабо экспрессированы в бронхиальном эпителии человека (24), у альвеолярных пневмоцитов типа II и макрофагов у человека (25). Согласно недавним исследованиям, активность CuZnSOD была уменьшена в эпителии пациентов с астмой (26, 27). Нам не известны исследования, где производилась оценка MnSOD и CuZnSOD при доброкачественных легочных паренхиматозных болезнях. Вероятно, MnSOD может быть индуцирована в легком человека, когда воспалительные клетки находятся в состоянии активации.

Мы исследовали экспрессию MnSOD и CuZnSOD при легочном саркоидозе и аллергическом альвеолите, которые представляют гранулематозные болезни с типичной гистологией и сохранением архитектуры легкого. Кроме того, эти клинические объекты представляют ситуации, где воспалительные клетки активизируются TNF-alpha и IL-1 одновременно. Экспрессия MnSOD и CuZnSOD были оценены количественно. Кроме того, проводилось иммуногистохимическое исследование и Вестерн-блоттинг клеток БАЛ, чтобы сравнить экспрессию этих ферментов в здоровом легком, при саркоидозе и аллергическом альвеолите и сравнивать индукцию этих ферментов у легочных лимфоцитов и альвеолярных макрофагов.

Пациенты

Случаи гистологически подтвержденного саркоидоза и аллергического альвеолита были идентифицированы из файлов Department of Pathology, Oulu University Hospital в период 1982-1996 г. Тридцать два пациента (15 женщин и 17 мужчин) с саркоидозом (n = 22) и аллергическим альвеолитом типа ''легкое фермера'' (n = 10) были включены в исследование. Диагноз у всех пациентов был основан на микроскопической оценке, использующей гистологические критерии, сформулированные Dail и Hammar (28). У двух пациентов проводилось лечение оральными кортикостероидами, четыре пациента получали ингаляционные кортикостероиды до проведения биопсии. Все пациенты имели саркоидоз или аллергический альвеолит с паренхиматозным вовлечением, как главную причину проведения биопсии легкого. Биопсия лимфатического узла была проведена при медиастиноскопии из-за увеличения внутригрудных лимфатических узлов у четырех пациентов и паренхиматозного вовлечения у двух пациентов.

Результаты

MnSOD и CuZnSOD в нормальном легком

Иммунореактивность MnSOD у альвеолярных макрофагов была слабо положительна. Слабая положительная иммунореактивность также была обнаружена у кубических клеток альвеолярного эпителия, у альвеолярных пневмоцитов типа II интенсивность окрашивания была умеренной в одном и слабой в двух случаях. Две биопсии не показали иммуногистохимического окрашивания MnSOD у пневмоцитов. Клетки БАЛ здоровых индивидуумов группы контроля показали слабую иммунореактивность MnSOD за исключением одного случая. Клинически, этот случай позже был диагностирован как саркоидоз, но диагноз не был подтвержден гистологически. Паттерн окрашивания MnSOD был зернистым и интрацитоплазматическим.

CuZnSOD положительно окрашивалась в бронхиальном эпителии гистологически нормального легкого. Окрашивание CuZnSOD было умеренным в одном и слабым в четырех случаях, от 50 до 100 % бронхиальных эпителиальных клеток показали иммунореактивность CuZnSOD. CuZnSOD окрашивалась в реснитчатых бронхиальных эпителиальных клетках более интенсивно, чем в клетках периферического бронхиального эпителия. Напротив, очень слабая иммунореактивность CuZnSOD была обнаружена у альвеолярных макрофагов. Паттерн иммуноокрашивания CuZnSOD был интрацитоплазматическим и гомогенным.

MnSOD и CuZnSOD при саркоидозе

Биопсия легкого у 16 пациентов с легочным саркоидозом показала, что MnSOD интенсивно окрашивалась в гранулемах. Окрашивание было интенсивным у девяти и умеренным у семи пациентов, от 60 до 100 % гранулем показали иммунореактивность MnSOD, особенно гигантские клетки и, в меньшей степени, эпителиальные клетки. В отличие от группы контроля, наблюдалась положительная иммунореактивность MnSOD у пневмоцитов типа II. Однако, число окрашенных пневмоцитов сильно различалось между пациентами. У двух пациентов, биопсия гладких мышц показала иммунореактивность MnSOD. Иммуногистохимический анализ клеток БАЛ показал положительную иммунореактивность MnSOD у макрофагов, но не у лимфоцитов. Интенсивность окрашивания была от слабой до интенсивной у 30-90 % макрофагов. Вестерн-блоттинг показал значительно более высокую реактивность MnSOD клеток БАЛ пациентов с саркоидозом, чем в группе контроля.

В отличие от MnSOD, гранулемы не показали иммунореактивности CuZnSOD. Бронхиальный эпителий окрашивался в 30-100 %, интенсивность окрашивания была умеренной в пяти случаях и слабой в девяти случаях. В отличие от MnSOD, иммунореактивность CuZnSOD у клеток БАЛ пациентов с саркоидозом была низкой или отрицательной .

MnSOD и CuZnSOD при аллергическом альвеолите

Гранулемы при аллергическом альвеолите показали значительную иммунореактивность MnSOD. Однако, окрашивание имело очаговый характер и было менее интенсивным, чем при саркоидозе. Как и при саркоидозе, иммуногистохимический анализ клеток БАЛ показал положительную иммунореактивность MnSOD у макрофагов, но не у лимфоцитов. Ни иммуногистохимический анализ, ни Вестерн-блоттинг не показали увеличения экспрессии CuZnSOD в гранулемах при аллергическом альвеолите, принимая во внимание, что бронхиальный эпителий имел положительную иммунореактивность CuZnSOD. Вестерн-блоттинг показал более высокую иммунореактивность MnSOD в БАЛ пациентов с аллергическим альвеолитом, чем в БАЛ группы контроля.

Обсуждение

Мы впервые обнаружили, что MnSOD сильно экспрессирована в гранулемах при саркоидозе и аллергическом альвеолите. Этот эффект был постоянным и повторяющимся не только в гранулемах, но и в лимфатических узлах шести пациентов с саркоидозом. В отличие от MnSOD, CuZnSOD имела подобную иммунореактивность в бронхиальном эпителии здоровых индивидуумов группы контроля и у пациентов с саркоидозом и аллергическом альвеолитом, но не имела экспрессии в гранулемах при любой из этих болезней. Интересно, что дополнительные неопубликованные эксперименты в нашей лаборатории показали увеличенную иммунореактивность MnSOD, но не CuZnSOD, в гранулемах при легочном туберкулезе.

Локализация и регулирование MnSOD и CuZnSOD в легких экспериментальных животных были относительно хорошо объяснены (19, 21, 22, 31), и могут иметься определенные подобия для легкого человека. В легком крысы, Chang с коллегами (19) и Coursin с коллегами (22) продемонстрировали иммунореактивность MnSOD у реснитчатых бронхиальных эпителиальных клеток, клеток Клара, альвеолярных макрофагов и пневмоцитов типа II. Локализация MnSOD, возможно, ограничена митохондриями. В легком человека, Coursin с коллегами (22) не смогли продемонстрировать иммунореактивность CuZnSOD в любых из ранее упомянутых клеток, в то время как CuZnSOD была обнаружена в мезенхимальных клетках, артериолах и эпителиальных клетках альвеол легкого крысы (22). В более поздних исследованиях, однако, та же самая группа обнаружила иммунореактивность CuZnSOD в бронхиальном эпителии здорового легкого человека (25). Кроме того, другие исследования, проводимые на легких эмбрионов и взрослых индивидуумов, показали слабую иммунореактивность CuZnSOD у бронхиальных эпителиальных клеток и клеток Клара (24, 32, 33).

Патогенез гранулематозных болезней все еще остается неясным, но может быть вероятным, что свободные радикалы могут иметь центральную роль при этих болезнях. В формирование гранулемы вовлечены некоторые цитокины и лимфокины, такие как TNF-alpha, L-1 и IL-6, все из которых могут вызывать индукцию MnSOD (11). Наше исследование показало высокую иммунореактивность MnSOD у альвеолярных макрофагов и пневмоцитов типа II у пациентов с саркоидозом и аллергическим альвеолитом. Эти клетки также были более резистентны к экзогенным оксидантам, чем альвеолярные клетки тип I или эндотелиальные клетки (34). Вестерн-блоттинг клеток бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), показал значительно более высокое количество MnSOD при саркоидозе и аллергическом альвеолите, чем в группе контроля. Иммуногистохимическое исследование показало более высокую экспрессию MnSOD у макрофагов, но не у лимфоцитов. Так как эти гранулематозные болезни обычно имеют доброкачественный курс и не нарушают архитектуру легкого, увеличенная экспрессия MnSOD может играть важную роль в защите легкого при активации макрофагов и формировании гранулемы. Известно, что MnSOD локализована в альвеолярных макрофагах. Естественно, что MnSOD также экспрессироована в гранулемах, которые производят макрофаги.

CuZnSOD была обнаружена у реснитчатых эпителиальных клеток и клеток Клара (22, 25). CuZnSOD обычно не индуцируется цитокинами (15, 16) и эти результаты находятся в согласии с нашим исследованием, которое показало относительно слабую иммунореактивность CuZnSOD у клеток БАЛ и альвеолярных макрофагов, положительное окрашивание наблюдалось в основном в реснитчатом эпителии. Таким образом локализация и индукция MnSOD и CuZnSOD отличаются у различных клеток в легком человека.

Привлечение здоровых индивидуумов в группу контроля часто является трудным. Нередко мы вынуждены использовать гистологически нормальные образцы биопсии легкого, полученные у пациентов, у которых проводилась хирургия злокачественной опухоли легкого или БАЛ пациентов, у которых проводилась бронхоскопия при исследовании респираторных симптомов. Пациенты с опухолями легкого часто курят или курили в прошлом. Было обнаружено, что табачный дым уменьшает активность нескольких антиоксидантных ферментов, одним из которых является CuZnSOD (35). С другой стороны, оксидантная нагрузка и воспаление, сопровождаемое действием табачного дыма, может стимулировать активность MnSOD в легком. В нашем исследовании активность CuZnSOD была низкой при гранулематозных болезнях и в группе контроля. Реактивность MnSOD была низкой в группе контроля и высокой при обеих гранулематозных болезнях.