American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine Vol 167. pp. 1225-1231, (2003)

HLA-DQB1 аллели восприимчивости и резистентности к саркоидозу у афро-американцев

Michael C. Iannuzzi, Mary J. Maliarik, Laila M. Poisson and Benjamin A. Rybicki
Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Mount Sinai Medical Center, New York, New York; and Department of Pulmonary, Critical Care, Allergy, and Sleep Medicine and Department of Biostatistics and Research Epidemiology, Henry Ford Health System, Detroit, Michigan

Реферат

Саркоидоз в Соединенных Штатах более часто воздействует на афро-американцев. Ранее сообщалось о связи саркоидоза с HLA, но большинство исследований использовали дизайн случай-контроль, который может производить систематическую ошибку из-за стратификации группы исследования. Мы исследовали передачу HLA-DQB1 аллелей в 225 афро-американских семьях, в которых был по крайней мере один пациент с саркоидозом. Из пяти HLA-DQB1 аллелей, аллели *02 и *06 показали существенное отклонение паттерна наследования у пациентов с саркоидозом. Типирование с высоким разрешением показало, что HLA-DQB1*0201 наследовался пациентами на 50% более часто, чем ожидалось (p = 0.001), принимая во внимание, что DQB1*0602 наследовался пациентами с саркоидозом приблизительно на 20 % более часто, чем ожидалось (p = 0.029). Исследование взаимодействия между *0201 и *0602 и воздействиями окружающей среды показало, что *0602 был слабо связан с воздействиями окружающей среды, но риск саркоидоза, связанный с *0201, часто зависел от характера воздействия. Кроме того, аллель *0602 был связан с рентгенографическим прогрессом болезни, но аллель *0201 не показал существенной корреляции с фенотипом. Различия в последовательностях аминокислот, кодирующих *0201 и *0602 аллели, могут объяснить различный эффект этих аллелей на восприимчивость к саркоидозу и прогресс болезни у афро-американцев.

Саркоидоз является следствием увеличенной активности макрофагов и CD4+ клеток Т-хелпер, которые приводят к дисрегуляции иммунного ответа и формированию неказеозных гранулем в вовлеченных органах. Хотя саркоидный антиген(ы) остается неизвестным, семейная группировка и этнические различия в заболеваемости говорят, что наследственная восприимчивость к саркоидозу существует (1, 2). Попытки идентифицировать гены восприимчивости к саркоидозу в последнее время сосредоточены на генах главного комплекса тканевой совместимости (MHC), особенно генах HLA.

Гены HLA при саркоидозе находятся в центре внимания, потому что активация Т-клеток вероятно происходит после процессинга и презентации антигена в контексте соответствующих молекул HLA класса II на поверхности клеток (3). Также это поддерживается ролью генов HLA при хронической бериллиевой болезни. Хроническая бериллиевая болезнь (CBD), с клиническими проявлениями и иммунопатологическими механизмами, подобными саркоидозу, является превосходной моделью для изучения генетической восприимчивости к гранулематозным болезням легкого (4). CBD наиболее часто происходит у носителей HLA-DPB1 аллеля с глютаматом в позиции 69 (4-6). Хотя сообщалось о связи HLA-DPB1 с саркоидозом, эта связь была не столь сильна, как при CBD (7-11).

Сообщалось о других связях HLA с саркоидозом. Они включают связь HLA-A*01, A*26, A*30, B*08, B*13, B*27, DRB1*03, DRB1*11, DRB1*13, DRB1*14 и DRB3*01 с восприимчивостью к саркоидозу (8, 12-17), связь HLA-B*35 и HLA-DRB1*11 с ранним началом (18, 19), связь HLA-DRB1*03 с острым началом (20-23), связь HLA-DRB1*14 и DRB1*15 с хронической болезнью (24) и связь HLA-DRB1*13 с серьезной болезнью (14). Во многих из этих исследований, антигены HLA были типированы серологическими методами. В дальнейшем, эти методы были заменены на генетические, позволяющие идентифицировать варианты последовательности ДНК, ответственные за чувствительность к антигенам различной структуры (25). Сообщалось об увеличенной экспрессии антигенов MHC класса II на альвеолярных макрофагах при легочном саркоидозе (26-28). Ранее, было обнаружено, что семейный саркоидоз связан с регионом главного комплекса тканевой совместимости в немецких семьях (11, 29).

Дальнейшие исследования позволили сузить регион поиска до MHC класса II, где вероятно находятся гены восприимчивости к саркоидозу. Связь наблюдалась с TAP-2 (ген транспортера, связанный с процессингом антигена), но не с TAP-1 и HLA-DP (30). Недавно мы закончили картирование региона MHC, на основании исследования афро-американских семей с саркоидозом (31), которое подтверждает, что локус восприимчивости к саркоидозу близок к TAP-2, но наши результаты предполагают, что локус восприимчивости более близко связан с HLA-DQB1, чем с DRB1.

Методы

Сбор данных

Протокол исследования был одобрен Наблюдательным советом больницы Генри Форда (Детройт). Диагноз был подтвержден биопсией ткани в 86 % случаев, в том числе у 14 пациентов с нормальной рентгенограммой (стадия 0). Пациенты без гистологического подтверждения саркоидоза имели рентгенографические ненормальности в виде двусторонней внутригрудной лимфаденопатии, совместимой клинической картины при наблюдении в течение 2 лет или более, и при исключении других состояний, которые могли бы объяснить клинический курс у этих пациентов.

Из 623 пациентов, у 359 (58 %) были зарегистрированы один или более родственников первой степени родства с саркоидозом. Из них, 234 имели 2 или более родственников или родителей, которые согласились сдать кровь для генетического анализа. Еще 10 афро-американских семей с саркоидозом были привлечены из других клиник, не из системы Генри Форда. Общее количество семей составило 244. Если это было возможно, генотипировались оба родителя. Когда генотипирование одного или обоих родителей было невозможно, генотипировались все родственники, давшие согласие участвовать в исследовании. Используя несцепленные маркеры, мы исключили 20 семей (8.2 %), данные которых были несовместимы с Менделевскими законами о сегрегации и 2 семьи (0.8 %) в которых при дальнейшем наблюдении саркоидоз не был подтвержден. При исследовании оставшихся 222 семей, было идентифицировано еще 3 семьи, которые были проанализированы отдельно. Таким образом, в исследование было включено 225 семей с общим количеством 704 индивидуума. Приблизительно 8 % семей (19 из 225) имели 2 или более родствеников с саркоидозом.

Данные анкетного опроса

Все участники исследования ответили на анкету, которая содержала вопросы о медицинской истории пациента, проводимого лечения, работе и воздействии различных факторов окружающей среды. Этот анкетный опрос был основан на анкете, использованной в исследовании ACCESS (34). Информация, полученная от каждого участника исследования включила детальную демографическую и медицинскую историю по 38 пунктам, историю воздействия факторов окружающей и продолжительность воздействия по 189 пунктами, и историю семейного саркоидоза.

Рентгенограммы оценивались экспертом без знания генотипа и серьезности болезни, используя стандартную систему рентгенографических стадий для саркоидоза (35). Для определения вовлечения органов использовались ранее опубликованные критерии (36).

Результаты

Типирование HLA-DQB1 с низкой разрешением

Наиболее часто встречался аллель DQB1*06, обнаруженный в 31.1 % из 1,018 исследованных хромосом, который немного чаще встречался у родствеников историей саркоидоза по сравнению с родственниками без истории саркоидоза (32.8 против 29.6 %). Наименее частый аллель, DQB1*04, был найден только в 8.2 % исследованных хромосом и встречался немного чаще у родствеников с историей саркоидоза по сравнению с родственниками без истории саркоидоза (8.9 против 7.4 %). Все остальные аллели, за исключением DQB1*02 (13.4 против 19.1 %), были распределены равномерно.

Типирование HLA-DQB1 с высоким разрешением

Учитывая статистически существенные различия для HLA-DQB1*02 и *06, мы провели типирование с высоким разрешением для этих двух аллелей. Было обнаружено три различных *02 аллеля и восемь различных *06 аллелей. Из этих 11 аллелей, 5 аллелей (DQB1*0203, *0608, *0619, *06052 и *06111) не обнаруживались достаточно часто, чтобы произвести статистические исследования. Два из этих шести аллелей продемонстрировали существенное отклонение паттерна наследования. Аллель DQB1*0201 наследовался пациентами на 50% более часто, чем ожидалось. Кроме того, аллель DQB1*0602 наследовался пациентами с саркоидозом приблизительно на 20 % более часто, чем ожидалось.

Затем мы исследовали, был ли риск саркоидоза, связанный с некоторыми воздействиями окружающей среды, более сильным (или более слабым) в присутствии DQB1*0201 и *0602 аллелей. Это исследование было сделано с помощью модификации модели взаимодействия ген-окружающая среда, в которую были включены семьи с одним или больше кровным родственником с саркоидозом. Этому критерию удовлетворяли 186 из 225 семей.

Для DQB1*0201 аллеля, наиболее сильной была связь с воздействием растительной пыли (OR 4.11) и влаги (OR 3.99). Также было отмечено несколько отрицательных связей с DQB1*0201. Наиболее существенным является связь DQB1*0201 с воздействием высокой влажности (OR 0.34; p = 0.026). Для индивидуумов с DQB1*0201 и DQB1*0602 аллелями, воздействие высокой влажности на рабочем месте в течение более 1 года не было фактором риска саркоидоза (OR 1.62), но у индивидуумов, несущих DQB1*0201 аллель, это воздействие имело защитный эффект (OR 0.47).

Мы проверили, было ли присутствие DQB1*0201 или *0602 аллеля связано с проявлениями болезни и клиническим курсом. Самая сильная фенотипическая связь с DQB1*0201 аллелем наблюдалась для рентгенограммы легких (8.0 % пациентов со стадией 0 или I рентгенограммы имели *0201 аллель, по сравнению с только 4.6 % со стадией II или выше), но это различие не было статистически значимым (p = 0.334). Никакие другие связи между DQB1*0201 аллелем и фенотипическимими характеристиками не были обнаружены. Для DQB1*0602 аллеля, наиболее существенной была связь с проведением дополнительной рентгенограммы (p = 0.051) и изменениями рентгенограммы в период наблюдения (p = 0.032). Последняя рентгенограмма была выполнена в среднем через 7.9±6.4 лет после постановки диагноза. Для пациентов, имевших рентгенографические ненормальности при постановке диагноза и у которых проводилась дополнительная рентгенограмма, среднее время между проведением рентгенограммы при постановке диагноза и самой последенй рентгенограммой было 6.5±5.1 лет. Положительная связь также наблюдалась между DQB1*0602 аллелем и клиническим курсом, рентгенографическимим ненормальносями при постановке диагноза и присутствим внелегочной болезни.

Обсуждение

Функцией HLA класса II является захват фрагментов антигенных пептидов, полученых из антигенных белков, которые были подвергнуты фагоцитозу или эндоцитозу антиген-презентирующими клетками (42). Комплекс HLA-антигенный пептид на поверхности клеток затем презентируется CD4+ T-лимфоцитам. Сцепление антигенных пептидов с молекулами HLA класса II зависит от взаимодействия между якорными сайтами HLA и пептидом и от формирования множественных водородных связей между антигенным пептидом и молекулой HLA (43). Таким образом, иммунный ответ индивидуума на пептиды имеет непосредственную связь с полиморфизмами генов, определяющих структуру якорных сайтов.

Schurmann с коллегами (44) сообщили о большей частоте DQB1*0603 и DQB1*0604 аллелей, общих у родственников первой степени родства и пациентов с саркоидозом. Частота DQB1*0301 и *0501 была увеличена у Японских пациентов по сравнению с здоровой группой контроля (45), и частота DQB1*0201/*0202 была увеличена у Скандинавов (24). Haslam с коллегами (27) сообщили о большем увеличении уровней HLA-DQ и DP на альвеолярных макрофагах при саркоидозе по сравнению с HLA-DR и отметили обратную корреляцию между уровнями HLA-DQ на альвеолярных макрофагах и функцией легкого при саркоидозе.

Sato с коллегами оценили частоту HLA-DQB1 у британских и голландских пациентов с саркоидозом (46). Эти авторы не нашли никаких различий в частоте DQB1*0201 между британскими и голландскими пациентами и группой контроля, но обнаружили уменьшенную частоту DQB1*0202 у британских, но не у голландских пациентов с саркоидозом. Никаких различий не было найдено для *0602 в обеих группах. DQB1*0201 аллель был связан с более умеренной болезнью при постановке диагноза и с разрешением рентгенографических ненормальностей, принимая во внимание, что *0602 аллель был связан с неблагоприятными клиническими характеристиками, такими как увеит и с более высокой рентгенографической стадией. Эти результаты были совместимы с данными Visser с коллегами (47), которые сообщили, что DQB1*0201-DRB1*0301 гаплотипы были связаны с острым саркоидным артритом, который был самоограниченным и был связан с хорошим прогнозом.

Хотя мы не обнаружили связи между DQB1*0201 аллелем и проявлениями саркоидоза или прогнозом, мы обнаружили связь DQB1*0602 с более высокой рентгенографической стадий при постановке диагноза и прогрессом рентгенографической болезни при наблюдении. Поскольку наше исследование было наблюдательным с ретроспективными методами сбора данных, наша группа может быть не репрезентативной.

Как известно, частоты аллелей HLA класса II значительно изменяются в различных популяциях (48) Ген DQB1 MHC класса II имеет 36 известных аллелей с серологическими эквивалентами (49). У белых и афро-американцев, частоты DQB1 аллеля высоко переменны (48), что скорее может позволить обнаружить расовые различия, чем связь с болезнью. Хотя теоретически, подбор группы контроля из этой же популяции, может позволить избежать этой ошибки, на практике это сделать трудно. Были предложены статистические методы стратификации (50), но эти методы пока широко не применяются. Исследования, основанные на изучении семейной группировки, позволяют избежать ошибки, связанной с подбором группы исследования и группы контроля без проведения любой статистической коррекции (51).

Потенциальным ограничением семейных исследований является то, что некоторые индивидуумы без болезни фактически могут быть случаями невыявленной, продромальной болезни. Это ограничение может не играть важной роли, поскольку продромальный саркоидоз у афро-американцев не столь обычен, как у белых индивидуумов (52, 53).

Мы исследовали взаимодействие факторов окружающей среды молекулами HLA класса II, которые кодируются DQB1*0201 и *0602 аллелями. Никаких существенных для связей для DQB1*0602 аллеля не было обнаружено, но было обнаружено различное влияние некоторых факторов окружающей среды на восприимчивость к саркоидозу по отношению у DQB1*0201 аллелю. Воздействие высокой влажности и воды имели существенное OR для DQB1*0201 аллеля. Воздействие растительной пыли имело самое высокое OR для DQB1*0201-позитивных индивидуумов, но не было статистически значимым. По нашим даным, никакие предыдущие исследования не сообщили о взаимодействии окружающей среды с генами, участвующим в восприимчивости к саркоидозу.

Эти результаты должны интерпретироваться в контексте ограничений нашего исследования и методологии оценки воздействия. Анкетный опрос о характере воздействия был основан на анкете, используемой в исследовании ACCESS (34), который был разработан, чтобы выявить минимальное количество информации о максимальном количестве воздействий. Никаких механизмов подтверждения сообщения пациентов о воздействии или специфических гипотез о том, как воздействие может производить саркоидоз, разработано не было. Например, растительная пыль была определена как мелкие частицы, произведенные при переработке растительного сырья. Индивидуумы, которые сообщили о воздействии растительной пыли, обычно имели профессию, связанную с сельским хозяйством, но факт воздействия был основан исключительно на восприятии респондента. Выбор времени действия этих факторов также является проблемой, так как доклинический период саркоидоза неизвестен, поэтому определить, произошло ли воздействие до фактического начала болезни, было невозможно. Несмотря на ограничения исследования, наши результаты указывают на возможные направления будущих исследований, которые могли бы производить более глубокую оценку связи воздействия факторов окружающей среды и HLA класса II.

Foley и коллегами (8) заключили, что связь с MHC при саркоидозе отражает участие скорее HLA-DR, чем другого локуса класса II. Это предположение поддерживается данными, что связь, обнаруженная между полиморфизмом в локусе TAP-2, происходит из-за неравновесного сцепления с HLA-DR1 в английской и польской популяции. Они также предположили, что связь с локусом HLA-DQ является маловероятной, поскольку присутствие специфического HLA-DR аллеля в гаплотипе более вероятно, чем то, что HLA-DQ аллель определяет восприимчивость к болезни.

Поскольку неравновесность сцепления усложняет интерпретацию связей с HLA, существуют противоречия относительно того, могут ли несколько или единственный HLA аллель объяснить связь саркоидоза с регионом MHC. Например, в одних сообщениях связь DQB1 с саркоидозом объяснялись неравновесностью сцепления гена DQB1 с DRB1 (45). В белых популяциях, локусы DQB1 и DRB1 находятся в неравновесном сцеплении (56). Степень неравновесности сцепления между DQB1 и DRB1 у афро-американцев может быть не такой сильной (57). Например, у афро-американцев было обнаружено большее количество вариаций в гаплотипах HLA-DRB1/DQA1/DQB1 по сравнению с белыми индивидуумами (58). Утверждение, что молекулы HLA непосредственно вовлечены и имеют функциональную роль при саркоидозе, нуждаются в прямых экспериментальных доказательствах, например создании линии трансгенных мышей, которые несут только специфические человеческие молекулы MHC, как это было сделано для диабета (59, 60).

В анализе HLA-DQB1 аллелей мы использовали пошаговый подход. Сначала был проведен поиск связи саркоидоза с аллелями с низкой разрешающей способностью, затем произведено типирование с высоким разрешением. Таким образом мы уменьшили возможность обнаружения ложных связей. Хотя возможно, что мы пропустили некоторые реальные связи при типировании с высоким разрешением *03, *04 и *05 аллелей, маловероятно, что эти аллели имели сильный эффект на восприимчивость к саркоидозу, поскольку иначе они были бы обнаружены в нашем анализе с низкой разрешающей способностью. Наше исследование поддерживает данные, что HLA-DQ является важным фактором при саркоидозе. Хотя мы обнаружили, что *0201 имеет протективную функцию, этот эффект может зависеть от характера воздействия на индивидуума. Мы также обнаружили, что присутствие *0602 аллеля было связано с прогрессом рентгенографической болезни, но *0201 аллель не показал существенной корреляции с фенотипом. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы оценить, как HLA-DQ взаимодействует с факторами окружающей среды и другими генами при саркоидозе.