The American Journal of Pathology, Vol. 174, No. 2, February 2009

FoxP3+ регулирующие T-клетки подавляют формирование гранулем на ранних стадиях, но имеют небольшое влияние на саркоидные повреждения

Cecile Taflin, Makoto Miyara, Dominique Nochy, Dominique Valeyre, Jean-Marc Naccache, Frederic Altare, Pascale Salek-Peyron, Cecile Badoual, Patrick Bruneval, Julien Haroche, Alexis Mathian, Zahir Amoura, Gary Hill, and Guy Gorochov
From the Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM) UMR-S 945 Paris; the Department of Internal Medicine and the Laboratoire AP-HP d’Immunologie Cellulaire et Tissulaire, AP-HP Hopital Pitie-Salpetriere, Paris; the Department of Pathology, and the Unite d’Immunologie Biologique, AP-HP Hopital European Georges Pompidou

Реферат

Саркоидоз характеризуется непропорциональным Th1 гранулематозным иммунным ответом в пораженных тканях. Это состояние также связано с периферической и внутритканевой экспансией регулирующих T-клеток (Treg). Эти клетки демонстрируют мощную антипролиферативную активность, однако полностью не ингибируют производство фактора некроза опухоли альфа или интерферона гамма. Причина экспансии клеток Treg и, что более важно, влияние этих клеток на развитие саркоидоза остается нерешенными проблемами. Мы обнаружили, что CD4⁺CD45RA^-FoxP3^bright Tregs клетки пролиферируют и накапливаются в пределах гранулем. Однако, количество Tregs не коррелирует с диссеминацией болезни, ни с местной степенью гранулематозного воспаления.

Мы обнаружили положительную корреляцию между присутствием Tregs в почечных гранулемах и степенью интерстициального фиброза (r=0.46, P=0.03, n=20). Кроме того, истощение пула Treg ускоряется in vitro при росте гранулемы в культуре мононуклеарных клеток здоровой контрольной группы, но не у пациентов с активным саркоидозом. Результаты этого исследования показывают, что хотя Tregs подавляют формирование гранулемы на начальном этапе, они не имеют положительного влияния на саркоидные повреждения. Наши результаты свидетельствуют, что Tregs имеют скорее профилактический, чем терапевтический эффект на воспалительные процессы.

Введение

Саркоидоз - мультисистемная болезнь неизвестной этиологии, наиболее часто поражающая респираторный тракт, характеризованная формированием гранулем в пораженных органах (1,2). Клинические проявления саркоидоза чрезвычайно разнообразны, в зависимости от пораженного органа и продолжительности воспаления. Хотя доброкачественный курс саркоидоза наблюдается у более половины пациентов, саркоидоз может приводить к серьезному поражению сердца, почек, центральной нервной системы, печени и глаз. Кроме того, саркоидоз может иметь хроническое течение, приводя к легочному фиброзу (2).

К сожалению, исход саркоидоза не может быть предсказан исходя из начальных проявлений болезни, что делает трудным планирование терапии. Хотя кортикостероиды могут изменить течение гранулематозного процесса, они имеют супрессивный эффект и остается неясным, могут ли они предотвращать развитие фиброзных повреждений (1).

Поэтому, для предсказания исхода и разработки специфической терапии саркоидоза, необходимо точное понимание иммунных процессов, которые инициируют начало болезни. Ранее было показано, что несоразмерный Th1 иммунный ответ в пораженных органах является ключевым механизмом в инициировании и поддержании воспаления (3,4). Однако, природа антигена (ов), инициирущих Th1 ответ при саркоидозе и механизмы, ведущие к диссеминации гранулем и фиброза, остаются неясными (5-7).

Характер Th1 воспалительного ответа при саркоидозе говорит, что его причиной может быть нарушение иммунорегулирующих процессов. Регулирующие CD4⁺ Т-клетки, экспрессирующие FoxP3 играют важную роль в контроле иммунного ответа против эндогенных и экзогенных антигенов (8,9). Хотя молекулярные механизмы действия Treg полностью не объяснены (10), имееются свидетельства, что ухудшение функции Treg может быть причиной неконтролируемого воспалительного процесса (11).

Ранее мы обнаружили увеличение количества CD4+CD25^bright Tregs при активном саркоидозе (12). Tregs были обнаружены в периферической крови, ЖБАЛ и лимфатических узлах. Хотя Tregs были способны подавлять пролиферацию и секрецию IL-2 CD4+CD25- T-клетками in vitro, мы обнаружили, что они полностью не могли ингибировать секрецию IFN-gamma и TNF-alpha. Подавление пролиферации Tregs может объяснить периферическую анергию, обычно наблюдаемую при саркоидозе и отстутсвие контроля над производством IFN-gamma и TNF-alpha может быть ответственным за формирование гранулем при саркоидозе.

Однако, пока не ясно, могут ли Tregs противодействовать формированию гранулемы. Кроме того, хотя число Tregs было увеличено почти у всех пациентов с активной болезнью, коррелирует ли число Tregs с серьезностью болезни, остается неизвестным. Наконец, хотя мы обнаружили увеличение количества Tregs, их происхождение остается неясным.

В этом исследовании мы показали, что Tregs активно пролиферируют в пределах саркоидных гранулем. Мы также показали, что увеличение числа Treg не коррелирует с ни с серьезностью, ни со степенью повреждения ткани при внелегочной болезни. Мы обнаружили положительную корреляцию между присутствием Tregs в почечных гранулемах и степенью интерстициального фиброза. Наконец, мы обнаружили, что в отличие от Tregs здоровой контрольной группы, Tregs пациентов с саркоидозом не подавляют формирование гранулем in vitro.

Пациенты

В исследование было включено 69 пациентов (40 женщин, 29 мужчин, 40 Европейцев и 29 Африканцев, в том числе 19 из Северной Африки) с диагнозом саркоидоз, установленного согласно критериям ATS/ERS/WASOG (1). Эти 69 пациентов были разделены на следующие группы:

1) 49 пациентов с легочной болезнью, 18 из которых (средний возраст 40.94 ± 11.36 лет, диапазон: от 16 до 60 лет) наблюдались в Thoracic Surgery Department of the Hospital Europeen Georges Pompidou, Paris, саркоидоз у них был диагностирован при биопсии средостенного лимфатического узла, и 31 пациент (средний возраст 42.58 ± 13.12 лет, диапазон: от 23 до 69 лет) в настоящее время наблюдаются в Pulmonary Department of the Hospital Avicenne, Bobigny, саркоидоз у них был диагностирован только на основании исследования периферической крови.

2) у 20 пациентов с саркоидозом почек, привлеченных из Hospital Europeeen Georges Pompidou, была проведена почечная биопсия (средний возраст 54.55 ± 14.58 лет, диапазон: от 32 до 78 лет). Из этих пациентов 13 (65 %) дополнительно имели легочную болезнь и 9 (45 %) имели иные внелегочные повреждения.

Ни один из пациентов не получал лечение во время исследования. Ткань в контрольной группе включала: 1) 6 образцов ткани лимфатического узла, полученных при медиастиноскопии у пациентов с подозреваемым раком легкого (n=6, средний возраст 45.83 ± 6.33 лет, диапазон от 39 до 55 лет). Все лимфатические узлы не имели признаков опухолевых клеток или аутоиммуннной болезни. 2) 9 образцов ткани почки больных с негранулематозным интерстициальным нефритом (средний возраст 52.67 ± 22.81 лет, диапазон: от 21 до 84 лет), 2 больных с волчаночным нефритом и 7 образцов ткани пациентов с аллергическими болезнями. 3) Образцы крови 15 здоровых добровольцев (средний возраст 37.33 ± 7.88 лет, диапазон: от 26 до 60 лет). Статистически значимых различий между пациентами и контрольной группой по возрасту не имелось. Протокол исследования был одобрен комитетом по этике.

Результаты

Саркоидные гранулемы содержат большое количество Treg клеток с фенотипом памяти

Известно, что не все FoxP3+ человеческие T-клетки фенотипически соответствуют Tregs (16). Проточная цитометрия показала наличие 3 субпопуляций CD4+ FoxP3+ T-клеток: наивные CD4+ CD45RA+ FoxP3+ (CD45RO-) соответствующие наивным Treg клеткам и 2 субпопуляции клеток памяти, CD45RA- (CD45RO+), нерегулирующая субпопуляция, имеющая промежуточную экспрессию FoxP3, и субпопуляция FoxP3^bright, соответствующая клеткам Treg с фенотипом памяти. Ранее мы обнаружили увеличение числа CD4+ CD25^bright Tregs в периферической крови пациентов с активным саркоидозом (12).

Большинство клеток Tregs, обнаруженных у пациентов с саркоидозом имеют фенотип памяти CD45RA- FoxP3^bright (4.62 ± 4.84 % CD4+ клетки, n=31 против 1.08 ± 0.39 % в контрольной группе, n=15, P< 0.0001). Мы отметили небольшое, но статистически значимое уменьшение среднего процента циркулирующих наивных CD45RA+ FoxP3+ Tregs (1.29 ± 0.61 % CD4+ клеток, n=31 против 1.76 ± 0.66 % в контрольной группе, n=15, P<0.04). Увеличение численности субпопуляции Treg клеток с фенотипом памяти при саркоидозе связано с более высоким производством воспалительных цитокинов IFN-gamma IL-2, TNF-alpha и IL-17 не Treg эффекторными T-клетками, включая FoxP3- и CD45RA- FoxP3low CD4+ T-клетками.

Мы подтвердили увеличение численности CD4+ FoxP3+ клеток в саркоидных лимфатических узлах, по сравнению с контрольной группой (21.6 ± 10.03 %, n=18 против 2.7 ± 1.25 %, n=6, P<0.0004). Гранулематозные интерстициальные инфильтраты при почечном саркоидозе также демонстрировали высокую распространенность CD4+ FoxP3+ клеток (21.95 ± 10.41 %, n=20) по сравнению с негранулематозным интерстициальном нефрите (2.27 ± 2 %, n=9, P<0.0001). Исследование локализации CD4+ FoxP3+ клеток в инфильтратах показало более значительное накопление в пределах гранулем, чем в периферическом инфильтрате (30.2 ± 11.58 % против 10.98 ± 7.32 %, P< 0.0001). Эти данные подтверждают наши предыдущие результаты, что активный саркоидоз характеризуется увеличением числа CD4+ CD45RA- FoxP3^bright Tregs (12) и указывают на высокую распространенность Tregs в пределах гранулем в нелимфоидных органах.

Клетки Treg активно пролиферируют в крови и гранулемах

Чтобы идентифицировать механизмы, ответственные за глобальную экспанию Tregs при саркоидозе, мы изучили экспрессию маркера пролиферации Ki-67. Мы обнаружили in vivo, что пролиферации - фактически является особенностью Tregs с фенотипом памяти в противоположность FoxP3low Tregs как у пациентов с саркоидозом, так и в контрольной группе. Tregs периферической крови экспрессируют Ki-67 с той же самой частотой у пациентов с саркоидозом и в контрольной группе (29.4 ± 8.23 % CD4+ FoxP3^bright клетки, n=31 против 33.08 ± 8.91 %, n=11, P< 0.23).

Однако Tregs в лимфатических узлах при саркоидозе более часто экспрессируют Ki-67 (17.55 ± 8.05 %, n<8) чем в лимфатических контрольной группы (6.76 ± 5.11 %, n=6, P<0.01). Аналогично, Tregs почечных гранулем экспрессировали Ki-67 более часто чем, Tregs, связаные с негранулематозным интерстициальным нефритом (6.89 ± 2.77 % Tregs, n=4 против 0 %, n=5, P=0.01).

Саркоидые Tregs не ингибируют in vitro формировании гранулемы

Ранее было показано, что in vitro клеточные компоненты окружения гранулем, индуцированных бусинками, покрытыми экстрактом БЦЖ при использовании мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) здоровых доноров, были подобны воспалительным клеткам, наблюдаемым в подлинных гранулемах (13-15). Однако, было неясно, будут ли формироваться подобные гранулемы in vitro при использовании использование PBMCs пациентов с саркоидозом. Чтобы убедиться, что скопления клеток вокруг бусинок действительно являются гранулемами, а не просто центрами пролиферации Т-клеток на участке презентации антигена, скопления гранулем из культуры PBMCs пациентов с саркоидозом были проанализированы с помощью проточной цитометрии.

Хотя пациенты с активным саркоидоза демонстрировали меньшее число CD4+ T-клеток по сравнению с контрольной группой (29.08 ± 3.38 % PBMCs, n=4 против 38.33 ± 2.89, n=4, P=0.02), мы также наблюдали меньшее количество моноцитов у этих пациентов и отношение лимфоидных / моноцитарных клеток в культуре in vitro значительно не различалось между пациентами с саркоидозом и контрольной группой (3.37±1.89 против 4.5±3, P=0.48). Клеточный состав индуцированных бусинками гранулем через 3 и 7 дней культивирования, в обоих случаях отражал наличие всех специфических типов клеток, обнаруженных в пределах естественных человеческих гранулем.

Чтобы изучить роль Tregs в формировании гранулемы, мы сравнили время, небходимое на формирование гранулем в культуре с экстрактом БЦЖ с цельными PBMCs и PBMCs после удаления CD25HIGH клеток (Tregs) у пациентов с активным саркоидозом и в контрольной группе. В культуре PBMCs контольной группы, удаление CD25HIGH клеток ускоряло формирование гранулемы через 3 дня после культивирования (93.25 ± 15.13 против 42.75 ± 6.5 гранулем, P=0.02). Это увеличение осталось статистически значимым через 7 дней, однако, через 8 дней количество гранулем в обоих группах сравнялось.

Напротив, у пациентов с активным саркоидоза удаление CD25HIGH клеток не изменяло количество гранулем через 3 дня культивирования (41.25 ± 7.5 против 49.75 ± 8.65 гранулем). Когда мы сравнили процент увеличения числа гранулем после удаления CD25HIGH клеток через 3 дня у 4 пациентов с активным саркоидозом (средний возраст 35.25 ± 8.77 лет, диапазон: от 29 до 48 лет) против 11 здоровых доноров в контрольной группе (средний возраст 36.18 ± 8.96 лет, диапазон: от 26 до 60 лет), мы обнаружили существенное увеличение увеличение числа гранулем у здоровых доноров (153.5 ± 82.81 %, n=11 против 12.07 ± 21.76 %, n=4, P=0.005) и это различие сохранялось до 7 дня культивирования.

Чтобы изучить зависимость изменения активности Tregs, мы сравнили формирование гранулем in vitro у пациентов в течение активной болезни и в ремиссии. При бездействующем саркоидозе удаление CD25HIGH клеток ускоряло формирование гранулем в день 3 (100.5 ± 14.8 против 39.5 ± 9.11 гранулем, P=0.02) и это ускорение сохранялось до дня 7, как и в контрольной группе. Эти данные указывают, что Tregs подавляют ранние стадии аутогенного формирования гранулем и что способность к подавлению формирования гранулем Tregs при активном саркоидозе нарушена in vitro.

Циркуляция и экспансия лимфоидных Treg не коррелирует с серьезностью болезни

Затем мы исследовали, связана ли экспансия Tregs при саркоидозе с прогрессом и диссеминацией болезни. Мы попытались обнаружить корреляцию амплитуды циркуляции и/или экспансии лимфоидных Treg с серьезностью саркоидоза. Используемым маркером был процент CD4+ T-клеток Tregs (% Tregs) в периферической крови или ткани. Мы не обнаружили корреляции между % Tregs в периферийной крови и внелегочной болезнью, форсированной жизненной емкостью, уровнем АПФ в сыворотке или стадией саркоидоза.

При исследовании Tregs в средостенных лимфатических узлов, мы наблюдали более высокий % Tregs у чернокожих пациентов, по сравнению с Европейскими (30.3 ± 6.8 %, n=8, против 14.6 ± 5.7 %, n=10, P=0.00006). Из-за этого различия, мы разделили эти две популяции при определении корреляции между % Tregs и различными критериями серьезности болезни. Однако, никаких корреляций в этих двух популяциях между % Tregs и различными клиническими параметрами, обнаружено не было.

Количество Tregs значительно увелично в почках, пораженных фиброзом

Неспособность подавления формирования гранулем аутогенными Tregs in vitro при саркоидозе позволяет предположить, что они должным образом контролируют гранулематозный ответ in vivo. Поэтому мы определили связь Tregs с серьезностью повреждения в течение саркоидоза. Мы искали корреляцию с присутствием Tregs в почечных гранулемах с серьезностью гистологических повреждений. Особенно большое количество саркоидных гранулем наблюдалось у 5 пациентов (25 %), с поражением более 60 % паренхимы. Интерстициальный) фиброз был обнаружен во всех образцах биопсийной ткани, но особенно диссеминированый и серьезный (>40 %) у 10 пациентов (50 %).

Мы не обнаружили корреляции между % почечных Tregs и серьезностью гранулематозного воспаления (r=-0.07, P=0.74). Этот результат указывает, что Tregs не способны эффективно контролировать формирование гранулем и повреждение ткани, поскольку они обнаружены во всех стадиях болезни, независимо от гистологической серьезности поражения. Однако, имелась положительная корреляция между % Tregs и степенью интерстициального фиброза (r=0.46, P=0.03). В целом, наши данные указывают, что Tregs не способны предотвращать повреждение ткани и даже могут быть связаны с развитием интерстициального фиброза.

Обсуждение

Несколько исследований показали роль Tregs не только в подавлении ответа на аутоантигены, предотвращающее развитие аутоиммунных реакций, но также и в регулировании иммунного ответа на экзоненные антигены (18). Предполагалось, что при саркоидозе нарушение иммунной регуляции может быть связано с развитием непропорционального Th1 ответа в пораженных органах (3,19). Цель этого регулирующего ответа и механизмы, ведущие к его очевидному дефициту, остаются неизвестными. Ранее мы сообщили об увеличении числа Tregs в крови, ЖБАЛ и лимфоидных тканях при активном саркоидозе (12).

В этом исследовании мы обнаружили in situ увеличение числа CD4+ FoxP3+ клеток в пределах почечных гранулем. Анализ Ki-67 показал, что CD4+ FoxP3+ Tregs действительно пролиферируют в пределах гранулем. Эти результаты совместимы с сильной пролиферативной способностью Tregs in vivo (20).

Местное производство IL-2, наблюдаемое в пораженных органах при саркоидозе (22) могло быть причиной пролиферации in situ Tregs, сопровождаемого их перераспределением на периферию. Другой потенциальный механизм, который мог бы объяснять накопление Tregs в пораженных органах - их миграция к участкам гранулематозного воспаления. Мы показали, что CXCR3 сверхэкспрессирован у CD4+ CD25^bright клеток ЖБАЛ при легочном саркоидозе (12).

В другом исследовании было показано, что хемокин CCL4 также участвует в миграции CD4+ CD25bright клеток к участкам воспаления, возможно вследствие экспрессии CCR5 (23). Накопление и пролиферация in situ Tregs поднимает относительно их роли в формировании, персистировании и разрешении гранулем в пораженных органах. Недавно в мышиной модели туберкулеза было показано, что на участках инфекции наблюдается накопление и пролиферация полностью функциональных Tregs, подавляющих ответ эффекторных клеток на Mycobacterium tuberculosis, таким образом возможно способствуя персистированию инфекции (24). Кроме того, в нескольких исследованиях была показана выгодная роль Tregs при антиинфекционном ответе в отношении контроля за повреждениями ткани, вторичными к интенсивному воспалительному ответу (25-29). В случае саркоидоза, можно предположить, что накопление Tregs в пораженных органах может быть выгодным при подавлении формирования гранулем, таким образом ограничения диссеминации болезни и повреждение ткани.

Чтобы иследовать эту гипотезу, мы использовали in vitro модель гранулемы (13-15). В этой модели, культивирование PBMC с бусинками ведет к формированию гранулем начиная со 2-го дня. Хотя удаление CD4+ CD25high клеток из PBMCs в контрольной группе ускоряло формирование гранулемы, но никаких изменений по времени роста гранулем не наблюдалось при использовании PBMCs пациентов с саркоидозом. Эти результаты предполагают дефект подавляющей функции Tregs на аутогенные гранулемы при саркоидозе. Эти данные совместимы с нашими предыдущими результатами, которые показали in vitro частично измененную подавляющую функцию Treg, которые были способны ингибировать пролиферацию эффекторных T-клеток без полного ингибирования секреции IFN-gamma и TNF-alpha (12). Однако, эти результаты не позволяют определить, является ли этот дефект причиной или последствием болезни.

Несколько исследований показали, что подавляющая функция Tregs зависит от их собственного состояния активации и от уровня активации эффекторных T-клеток (30-32). Billiard с коллегами (33) показали in vivo у мышей, что сильная активация эффекторных клеток делает их резистентными к подавляющему действию Tregs. Похоже, что воспалительный контекст является детерминантом ингибирования подавляющей функции Tregs, особенно с участием колоколоподобных рецепторов. Sutmuller с коллегами (34) показали in vitro экспансию Tregs с измененной подавляющей функцией в ответ на лиганд колоколоподобных рецепторов 2 (Pam3cys) в мышиной модели.

Наконец, мы обнаружили, что при саркоидозе Tregs имеют фенотип памяти, а наивные Tregs фактически отсутствуют у этих пациентов. Tregs с фенотипом памяти in vivo имеют более интенсивный клеточный цикл (35) и намного больше склонны к апоптозу, чем наивные Tregs (36). Поэтому, связанные с саркоидозом Tregs в действительности могут не иметь никакого специфического функционального дефекта, а нарушение их функции может быть связано с апотозом или дефектами колоколоподобных рецепторов. Очевидные нарушения иммунорегуляции, наблюдаемые при саркоидозе, могут быть связаны с резистентностью эфекторных клеток из-за их сильной активации и нарушением функции Tregs.

Наши результаты in vitro поддержаны отсутствием корреляции между присутствием in situ Tregs в почечной паренхиме и степенью гранулематозного воспаления. Точно так же, процент Tregs в крови и средостенных лимфатических узлах пациентов с легочным саркоидозом не коррелирует ни с серьезностью легочной болезни, ни со степенью диссеминации болезни. Таким образом, накопление Tregs в крови и различных органах не ведет ни к подавлению гранулематозного ответа, ни к уменьшению повреждения ткани. Эти результаты говорят, что дефект подавления формирования гранулемы, наблюдаемый in vitro, также наблюдается in vivo в пораженных органах.

Кроме того, мы обнаружили положительную корреляцию между присутствием Tregs в почечных гранулемах и степенью интерстициального фиброза. Однако, корреляция между процентом почечных Tregs и степенью интерстициального фиброза не подразумевает, что Tregs могут участвовать в процессе фиброгенеза, но предлагает, что эти клетки имеют минимальный защитный эффект.

В этом исследовании мы показали, что нормальные человеческие регулирующие T-клетки способны контролировать, по крайней мере in vitro, начальные этапы развития гранулемы. Однако, в контексте саркоидоза, те же самые клетки накапливаются и пролиферируют в пределах гранулем, но не в состоянии подавить их рост. Эти результаты in vitro подтверждены клиническими и гистопатологическими исследованиями, показавшими, что большее число Tregs не наблюдается у пациентов с менее серьезной болезнью, и наоборот.

В целом, наши результаты являются доводом в пользу скорее профилактического, чем терапевтического эффекта Tregs на воспалительный процесс. Мы выдвигаем гипотезу, что нарушении функции Tregs участвует в усилении и персистировании Th1 иммунного ответа при саркоидозе. Необходимо исследовать, является ли нарушение функции Tregs при саркоидозе первичны, или нарушение функции является вторичным и связано с продолжительным действием неизвестных факторов.