American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine Vol 169. pp. 180-186, (2004)

Полиморфизм гена 10-kD белка клеток Клара при саркоидозе

Takashi Ohchi, Noriharu Shijubo, Isao Kawabata, Shingo Ichimiya, Shin-ichiro Inomata, Akihiro Yamaguchi, Yoshifumi Umemori, Yoshihisa Itoh, Shosaku Abe, Yomei Hiraga and Noriyuki Sato
Third Department of Internal Medicine; Department of Pathology, Sapporo Medical University School of Medicine; Department of Respiratory Medicine, Sapporo Hospital, Hokkaido Railway Company, Sapporo; and Department of Laboratory Medicine, Asahikawa Medical College, Asahikawa, Japan

Реферат

10-kD белок клеток Клара (CC10) имеет мощные противовоспалительные свойства. В гене CC10 был обнаружен полиморфизм G38A. Мы исследовали влияние аллели на развитие саркоидоза, используя исследование дизайна случай-контроль в Японской популяции (265 случаев саркоидоза и 258 индивидуумов в группе контроля). Частота аллели в случаях саркоидоза (45.1 %) была значительно выше, чем у здоровых индивидуумов группы контроля (34.9 %, p = 0.0002). В течение 3-х летнего периода наблюдения, мы разделили 223 пациента на две подгруппы (55 с прогрессом и 168 с регрессом болезни). Частота аллели А у пациентов с прогрессом болезни была значительно выше чем в группе контроля (OR = 4.55; доверительный интервал 95 %, 2.97-6.97; p < 0.0001), принимая во внимание, что в группе с регрессом болезни этого не наблюдалось. Пациенты с генотипом А/А имели значительно более низкие уровни CC10 в БАЛ, чем с генотипом G/G (некурящие p = 0.0054, курящие p = 0.0045) и генотипом G/A (некурящие p = 0.0022, курящие p = 0.0402). Исследование репортерного гена показало значительно более низкую активность в присутствии интерферона гамма для 38A, чем для 38G (p = 0.0177). G38A полиморфизм гена CC10 может быть связан с развитием прогрессирующего саркоидоза.

Саркоидоз является следствием существенного увеличения активности макрофагов и CD4+ T-клеток, иммунной дисрегуляции и формирования неказеозных гранулем в вовлеченных органах. Хотя причинный антиген остается неизвестным, семейная группировка и этнические предпочтения указывают, что наследственная восприимчивость к саркоидозу существует (1, 2). Попытки идентифицировать гены восприимчивости к саркоидозу в основном были сосредоточены на генах главного комплекса тканевой совместимости, особенно генов HLA (1-6). Кроме того, активация T-клеток и макрофагов / моноцитов ограничена вовлеченными органами, несмотря на системный характер болезни. Приблизительно у 70 % пациентов с саркоидозом, наблюдается спонтанный регресс болезни (7, 8). Механизмы уменьшения воспаления при саркоидозе должны существовать; однако, предпосылки или механизмы индукции спонтанного регресса неизвестны.

10-kD белок клеток Клара (CC10) - основной продукт нереснитчатых бронхиолярных эпителиальных клеток (клетки Клара) (9). CC10 - полипептидный гомодимер, состоящий из 70 аминокислот (10). CC10 также называют фосфолипид-связывающим белком клеток Клара, секреторным белком клеток Клара или полихлорированным бифенил-связывающим белком. Была доказана идентичность человеческого CC10 человеческому протеину-1 (P1) [5] и утероглобину (UG) (9). На симпозиуме по семейству UG/CLARA (9), было предложено новое родовое название - секретоглобин (secretoglobin) (9, 10). В семействе секретоглобинов, CC10/UG определен как секретоглобин 1A1. CC10/UG обладает различными биохимическими и биологическими свойствами, включая ингибирование активности фосфолипазы A2 (9) и фосфолипазы C (11). CC10 является мощным ингибитором IFN-gamma (8, 12). IFN- gamma обратно пропорционально увеличивал экспрессию CC10 эпителиальных клеток дыхательных путей (13-15). Уровни CC10 были различными при различных воспалительных болезнях легкого (16-18), включая саркоидоз (8, 19). Дефицит CC10 приводит к увеличенной чувствительности к индуцированному гипероксией повреждению легкого, увеличивая экспрессию провоспалительных цитокинов (20). Эти данные позволяют предположить, что CC10 может регулировать воспаление в легком.

Имеется несколько сообщений о связи между болезнями и заменой аденина на гуанин в позиции 38 (A38G), расположеной по ходу транскрипции от сайта инициации транскрипции в пределах некодирующего региона экзона 1 гена CC10 (21-25). Уровни CC10/UG были значительно уменьшены у пациентов с астмой с генотипом А/А (21) и IgA нефропатией (22) по сравнению с генотипами G/G и G/A. Мы исследовали генетическое влияние аллеля G38A на развитие саркоидоза и риск его прогресса, используя исследование дизайна случай-контроль в Японской популяции. Мы также сравнили уровни CC10 среди различных генотипов и проанализировали, является ли полиморфизм G38A ответственным за уменьшенную транскрипционную активность гена CC10.

Методы

Пациенты

В исследование было включено 265 пациентов с саркоидозом и 258 здоровых индивидумов в группу контроля. Все участники исследования (n = 523) были Японцами, главным образом с севера Японии (Хоккайдо). Все участники дали письменное информированное согласие для участия в исследовании. Комитеты по этике Sapporo Medical University и Sapporo Hospital, Hokkaido Railway Company одобрили протокол исследования.

Пациенты с саркоидозом имели результаты гистологической экспертизы, совместимые с саркоидозом (неказеозные эпителиоидноклеточные гранулемы в легком и/или коже без микобактериальной, грибковой или паразитарной инфекции). Ни один пациент не имел историю воздействия органических или неорганических материалов, способных вызывать гранулематозные болезни легкого. 18 пациентов имели стадию 0 (нормальная рентгенограмма); 167 стадию 1 (внутригрудная лимфаденопатия); 61 стадию 2 (внутригрудная лимфаденопатия и легочные инфильтраты); 17 стадию 3 (легочные инфильтраты без внутригрудной лимфаденопатии); 2 стадию 4 (легочный фиброз без внутригрудной лимфаденопатии). У 70 пациентов саркоидоз был диагностирован недавно. 223 пациента, которые наблюдались 3 года и более (диапазон от 44 до 430 месяцев, в среднем 112 месяцев) были разделены на группу с прогрессом (n = 55) и регрессом болезни (n = 168). 36 пациентов (стадия 1, n = 18; стадия 2, n = 12; стадия 3, n = 5; и стадия 4, n = 1) во время постановки диагноза имели прогрессирующие легочные повреждения, оцененные по рентгенограмме, компьютерной томографии и результатам тестов функции легкого. 16 из этих 36 пациентов получали продолжительную кортикостероидную терапию. Кардиосаркоидоз развился у восьми пациентов (стадия 1, n = 4; стадия 2, n = 3; и стадия 3, n = 1), все они нуждались в продолжительной кортикостероидной терапии. 9 пациентов (стадия 1, n = 5; стадия 2, n = 3; и стадия 3, n = 1) имели персистирующие мышечные, кожные и/или костные повреждения без улучшения внутригрудных повреждений, 7 из них получали продолжительную кортикостероидную терапию. Вследствие ухудшения повреждений глаз, 7 пациентов (стадия 1, n = 5 и стадия 2, n = 2) нуждались в продолжительной кортикостероидной терапии. 5 из 60 ранее упомянутых пациентов имели 2 прогрессирующих повреждения глаз. Таким образом, эти 55 пациентов были классифицированы в группу с прогрессом болезни. 38 пациентов получали кратковременную кортикостероидную терапию и после терапии они имели регресс болезни. Остальные 130 пациентов имели спонтанный регресс болезни. Поэтому, 168 пациентов были классифицированы в группу с регрессом болезни. Исследования БАЛ во время постановки диагноза были выполнены у 180 из 265 пациентов. Однако, 18 пациентов, получавших кортикостероидную терапию, были исключены. Таким образом, 162 образца БАЛ (некурящие n = 91 и курящие n = 71) были проанализированы согласно генотипам.

Результаты

Полиморфизм G38A гена CC10

Полиморфизм G38A гена CC10 был оценен у 265 пациентов с саркоидозом и 258 здоровых индивидуумов в группе контроля с помощью аллель-специфической ПЦР. Аллель-специфическая ПЦР использует аллель-специфические праймеры, которые отличаются по длине на 10 bp.

Полиморфизм G38A удовлетворял ожиданиям согласно закону Харди-Вайнберга. Мы обнаружили, что частота аллеля была значительно выше чем в группу контроля (CI = 1.60; доверительный интервал 95 %, 1.25-2.05; p = 0.0002).

Генотип G38A и связь с клиническими параметрами

Характеристики пациентов были сравнены согласно наличию генотипа G38A. Не имелось никаких существенных различий по полу, возрасту начала болезни, распределению рентгенографических стадий, числу вовлеченных органов или уровню АПФ. Когда были проанализированы данные экспертизы БАЛ у некурящих и курящих, не имелось никаких существенных различий по любому параметру среди генотипов.

Связь полиморфизма G38A с риском прогресса болезни была проанализирована у 223 пациентов, которые наблюдались в течение 3 или более лет. Частота 38A аллеля у пациентах с прогрессирующей болезнью была значительно выше чем у пациентов группы контроля (OR = 4.55; доверительный интервал 95 %, 2.97-6.97; p < 0.0001). Напротив, не имелось никакого существенного различия в частоте аллеля между группой контроля и пациентами с регрессом болезни.

Уровни CC10 в зависимости от генотипа

Уровни CC10 в БАЛ во время постановки диагноза были сравнены согласно генотипу G38A. Поскольку сообщалось, что курение влияет на уровни CC10 (8, 15, 27), мы оценили уровни CC10 у некурящих и курящих раздельно. А/А генотип соответствовал значительно более низким уровням CC10 в БАЛ чем генотип G/G (некурящие, p = 0.0054, курящие p = 0.0045) и генотип G/A (некурящие p = 0.0025, курящие p = 0.0402). Генотип G/A соответствовал значительно более низким уровням CC10 в БАЛ, чем генотип G/G (некурящие p = 0.0022, курящие p = 0.0054). Уровни CC10 в сыворотке были значительно ниже у генотипа А/А, по сравнению с генотипом G/G (некурящие p = 0.0088, курящие p = 0.0452). Генотип А/А имел тенденцию к меньшим уровням CC10 в сыворотке, по сравнению с генотипом G/A.

Модуляция транскрипции гена CC10

Чтобы исследовать, влияет ли полиморфизм G38A на активность промотора гена CC10, последовательности промотора, связанные с люциферазой репортерного гена, были введены в клетки аденокарциномы легкого NCI-H441. Активность репортеного гена была сравнена между двумя полиморфизмами, G или А в позиции 38, расположеными по ходу транскрипции от сайта инициации транскрипции в пределах некодирующего региона экзона 1 в присутствии IFN-gamma (от 1 до 1,000 U/ml). Результат соответствовал предшествующим наблюдениям (28-30). В отсутствии IFN-gamma или в присутствии 1 U/ml IFN-gamma, не имелось никаких существенных различий в активности люциферазы для полиморфизмов 38G и 38A. Была обнаружена значительно более низкая активность люциферазы для 38A в присутствии 10-U/ml IFN-gamma, чем для 38G (p = 0.0177). Эти результаты говорят, что аллель G38A может быть связан с уменьшенной транскрипционной активностью гена CC10, когда наблюдается увеличенное производство IFN-gamma в легком.

Обсуждение

Это исследование продемонстрировало существенное увеличение частоты аллеля G38A у пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля. Хотя среди этих трех генотипов не имелось существенных различий по клиническим параметрам во время постановки диагноза, пациенты с генотипом А/А имели значительно более низкие уровни CC10 в сыворотке и БАЛ чем с G/G и G/A генотипом. Еще более важно, что частота аллеля у пациентов с прогрессирующей болезнью, но не у пациентов с регрессом болезни, была значительно выше, чем в группе контроля, когда были проанализированы данные 223 пациентов с саркоидозом, наблюдавшихся в течение 3 или более лет. Эти данные говорят, что полиморфизм G38A может влиять на экспрессию CC10 и быть связан с развитием саркоидоза и риском его прогресса.

CC10-дефицитные мыши - мощная модель для исследования функциональной роли CC10 в развитии воспаления при астме (31, 32). По сравнению с мышами с диким типом (наиболее часто встречающийся в природной популяции фенотип, признаки которого детерминированы ''нормальными'', немутантными аллелями), интенсивный эозинофильный воспалительный ответ вызывался сенсибилизацией оваблюмином (ovablumin) вместе с увеличенными уровнями Th2 цитокинов и (31) эотаксина. В другой модели астмы, в легком были увеличены реактивность дыхательных путей и воспаление (32). Инфильтрация нейтрофилами в ранней стадии была увеличена и число мукосубстанций в дыхательных путях, окрашиваемых реактивом Шиффа, после воздействия оваблюмина было увеличено (32). Эти данные говорят, что CC10 модулирует воспаление и отклик дыхательных путей на аллергены in vivo. Клинические исследования продемонстрировали уменьшенные уровни CC10 в сыворотке (9, 20) и БАЛ пациентов с астмой (33). Иммуногистохимический анализ показал, что число CC10-позитивных эпителиальных клеток было уменьшено в мелких дыхательных путях пациентов с астмой (34). Следует отметить, что накопление T-клеток и тучных клеток отрицательно коррелировало с отношением числа CC10-позитивных эпителиальных клеток к полному числу эпителиальных клеток в мелких дыхательных путях. Кроме того, трансгенные мыши с увеличенной экспрессией интерлейкина-4 в дыхательных путях, имели уменьшенную экспрессию CC10 (35). Таким образом, уменьшение уровней CC10 может иметь важное значение в развитии хронического воспаления легкого при астме. Увеличение уровней CC10 в сыворотке пациентов с саркоидозом может происходить из-за увеличения проницаемости аэрогематического барьера (19). Примечательно, что уровни CC10 при саркоидозе во время постановки диагноза, были значительно увеличены в сыворотке и БАЛ пациентов с регрессом болезни по сравнению с группой контроля, и были значительно меньше в сыворотке и БАЛ пациентов с прогрессирующей болезнью по сравнению с пациентами с регрессом болезни (8). Несколько исследований продемонстрировали, что IFN-gamma увеличивает экспрессию CC10 у эпителиальных клеток в дыхательных путях (13-15). Эти данные могут разъяснить механизм увеличения CC10 при Th1 воспалительных болезнях легкого, таких как саркоидоз.

Структура человеческого гена CC/UG весьма подобна структуре у других млекопитающих; эти два белка имеют соответствие последовательности 53 %, 55 % и 61 % у обезьяны, крысы и человека, соответственно, также как подобие в их третичной структуре (пространственная структура, образующаяся в результате самоукладки отдельной полипептидной цепи) (9, 16). Интрон-экзонные границы человеческого гена CC10/UG подобны таковым у кролика и мыши. Бокс Хогнесса (выполняет регуляторную функцию - участвует в инициации транскрипции, обеспечивая ориентацию РНК-полимеразы относительно промотора) и два октамер-подобных региона расположены в 5 '- фланкирующем регионе у человека, кролика и мыши. IFN-gamma увеличивает экспрессию CC10 эпителиальных клеток дыхательных путей (13-15). Ramsay с коллегами (15) продемонстрировали молекулярный механизм, посредством которого IFN-gamma стимулирует экспрессию гена CC10 у трансформированных мышиных клеток Клары и трансгенных мышей. Картирование показало, что индуцированная IFN-gamma экспрессия CC10 частично регулируется на уровне транскрипции. В исследованиях in vitro и in vivo, что минимальный сегмент, отзывчивый к IFN-gamma, локализован в проксимальном 166 bp 5 '-фланкирующем регионе.

Человеческий CC10/UG кодируется геном, сотоящим из 3 тысяч нуклеотидов, который содержит три экзона и два интрона и локализован на длинном плече хромосомы 11 (11q12.3-q13.1) (9). Сообщалось о связи IgA нефропатии и бронхиальной астмы с полиморфизмом CC10/UG G38A (21-25). Обсуждалась связь полиморфизма G38A с увеличенным риском астмы. Laing с коллегами (21) изучали полиморфизм G38A в группе из 67 детей с астмой с согласованной группой контроля. Они сообщили о увеличении риска развития астмы в 6.9 раза при генотипе А/А и в 4.2 раза при генотипе G/A. Подобные исследования британских и японских пациентов, однако, не смогли подтвердить связь G38A с развитием астмы (24). Следует отметить, что уровни CC10 в сыворотке у пациентрв с астмой с А/А генотивом были значительно меньше по сравнению с G/G и /GA генотипами (21). Недавно, Sengler с коллегами (25) сообщили, что частота аллеля G38A не была связана с развитием астмы у детей в Германии. Однако, у детей с астмой, уровни PC₂₀FEV₁ были значительно ниже у носителей А/А и G/A генотипов, чем у G/G у носителей генотипа. Значительно большее уменьшение FEV1 после физической нагрузки наблюдалось у носителей А/А генотипа, по сравнению с G/G и G/A генотипами. Некоторые данные говорят, что полиморфизм G38A может влиять на уровни CC10 и увеличение бронхиальной реактивности и может быть генетическим детерминантом серьезности астмы. Th2 цитокины, включая интерлейкин-4 и интерлейкин-13, могут влиять на экспрессию CC10 (35, 37). Связь полиморфизма G38A, транскрипционной активности гена CC10 и Th2 цитокинов должна быть объяснена.

В этом исследовании, изучение активации репортерного гена показало, что точечная мутация, замена аденина на гуанин в позиции 38 гена CC10, уменьшала активность люциферазы в присутствии 10-U/ml IFN-gamma, но не влияла на активность люциферазы в отсутствии IFN-gamma. В микросреде увеличенного производства IFN-gamma в легком (Th1 воспалительные болезни легкого, такие как саркоидоз), полиморфизм G38A может уменьшать аффинность специфического ядерного белка промотора гена CC10, что приводит к уменьшенной транскрипционной активности и, в конечном счете, ведет к более низкой экспрессии белка CC10. Если пациенты не имеют мутации гена CC10, увеличение производства CC10 при увеличении производства IFN-gamma вопалительными повреждениями, может действовать как отрицательная обратная связь на производство IFN-gamma, что является иммунорегуляторным действием. В этом контексте, полиморфизм G38A гена CC10 может влиять на экспрессию CC10 и может быть хорошим маркером для предсказания риска прогресса саркоидоза.