Journal of Clinical Microbiology, September 2006, p. 3448-3451, Vol. 44, No. 9

Mycobacterium tuberculosis Complex и микобатериальный белок температурного шока в лимфатических узлах пациентов с легочным саркоидозом

Anna Dubaniewicz, Miroslawa Dubaniewicz-Wybieralska, Adam Sternau, Zofia Zwolska, Ewa Izycka-Swieszewska, Ewa Augustynowicz-Kopec, Jaroslaw Skokowski, Mahavir Singh, and Lech Zimnoch
Department of Pathophysiology, Medical University of Gdansk, Gdansk, Poland, Department of Radiology, Medical University of Gdansk, Gdansk, Poland, Department of Thoracic Surgery, Medical University of Gdansk, Gdansk, Poland, National Institute of Tuberculosis and Lung iseases, WarСаркоидозw, Poland, Department of Pathomorphology, Medical University of Gdansk, Gdansk, Poland, Department of Surgical Oncology, Medical University of Gdansk, Gdansk, Poland, LIONEX Diagnostics and Therapeutics GmbH and GBF, Braunschweig, Germany, Department of Medical Pathomorphology, Medical University of Bialystok, Bialystok, Poland

Реферат

Мы показали, что не микобактерия туберкулеза но ее специфические антигены, hsp70Mtb, hsp65Mtb и hsp16Mtb, присутствуют в лимфатических узлах пациентов с саркоидозом. Hsp16Mtb наблюдается в ранней стадии саркоидоза, принимая во внимание, что hsp70Mtb наблюдается в стадии II саркоидоза. Антиген hsp65Mtb экспрессирован в капиллярах лимфатических узлов пациентов с саркоидозом.

Введение

Саркоидоз - гранулематозная болезнь неизвестной этиологии. Поскольку гранулематозное воспаление - гистологический признак саркоидоза, также наблюдается при туберкулезе (TB), предполагалось участие микобактерий в патогенезе саркоидоза (1, 7). Результаты поиска ДНК Mycobacterium tuberculosis с помощью ПЦР дали противоречивые результаты (7). Некоторые из исследований обнаружили сильные сигналы для микобатериального белка температурного шока 65 (hsp65Mtb) в саркоидных тканях (3). Увеличенный титр антител к hspMtb также был описан у пациентов с несколькими аутоиммуннными болезнями, латентной микобактериальной инфекцией и саркоидозом (6, 12).

Белок температурного шока часто является целью T-клеточных и гуморальных иммунных реакций на инфекции, что может объяснить связь между инфекцией и аутоиммуными реакциями, вызванным взаимной реактивностью между T-лимфоцитами, Mycobacterium tuberculosis и человеческими hsp70, hsp65 и hsp16 (гомология 46 %, 60 % и 18 %, соответственно) (4, 12).

Пациенты и методы

Чтобы исследовать участие микобактериальных антигенов в развитии саркоидоза, мы определили присутствие Mycobacterium tuberculosis Complex (MTBC) и hspMtb в замороженных тканях лимфатического узла пациентов с легочным саркоидозом и группы контроля, в которую входили четыре пациента с метастатическим раком легкого, пять пациентов с неспецифической лимфаденопатией (отрицательная группа контроля) и один пациент с туберкулемой легкого (положительная группа контроля). Диагноз саркоидоз был установлен на основании клинической картины, отсутствия свидетельств инфекции Mycobacterium tuberculosis и обнаружении неказеозных гранулем при биопсии лимфатического узла. Компьютерная томография с высоким разрешением (КТВР) использовалась, чтобы диагностировать стадию I (двусторонняя внутригрудная лимфаденопатия; 25 пациентов) и стадию II (двусторонняя внутригрудная лимфаденопатия и паренхиматозные инфильтраты; 25 пациентов) саркоидоза. Диагноз туберкулез был основан клинических даных, результатах рентгенограммы легких, исследовании мокроты и обнаружении казеозного некроза при биопсии. Диагноз метастатического рака легкого был установлен на основании клинических данных, КТВР и результатов гистологической экспертизы. Неспецифическая лимфаденопатия была диагностирована на основании клинических и радиологических признаков, гистологических и микробиологических результатов (отсутствие кислотостойких организмов, грибов и атипичных клеток, отрицательной ПЦР и культуральных исследований для Mycobacterium tuberculosis). Все пациенты и группа контроля были привиты Mycobacterium bovis (БЦЖ). Ни один из них не имел семейной истории туберкулеза или саркоидоза или контакта с больным активным туберкулезом.

Образцы такни были получены при проведении обычных диагностических процедур и были заморожены. Использовалось окрашивание гематоксилином и эозином.

Анализ с помощью системы BD ProbeTec (Becton Dickinson Diagnostic Instruments) используя IS6110-специфические праймеры, был выполнен у 50 пациентов с саркоидозом и 10 индивидуумов группы контроля согласно инструкции изготовителя (2). IS6110 Mycobacterium tuberculosis в этом исследовании является более специфичным для Mycobacterium tuberculosis, чем для M. bovis или M. avium complex (10).

Замороженные ткани лимфатического узла 25 пациентов с саркоидозом и 10 индивидуумов группы контроля для поиска микобактериального hsp были окрашены с использованием моноклональных антител (Abs) против hsp70Mtb, hsp65Mtb и hsp16Mtb (LIONEX Diagnostics and Therapeutics GmbH, Germany) согласно протоколу APAAP (DAKO, Dakopatts, Denmark). Интенсивность реакции с антителами была оценена полуколичественно со следующими градациями: 0, отсутствие иммунореактивности; 1, слабая интенсивность реакции; 2, сильная интенсивность реакции.

Результаты

В отрицательной группе контроля не было обнаружено положительных сигналов для IS6110 праймеров, специфических для Mycobacterium tuberculosis. Мы обнаружили присутствие ДНК MTBC только у 3 из 50 пациентов с саркоидозом (6 %), что является совместимым с другими результатами (7). Напротив, некоторые авторы, при использовании IS6110, получили положительные результаты ПЦР у более половины индивидуумов с саркоидозом. В других исследованиях (3, 7), положительных сигналов для Mycobacterium tuberculosis не было обнаружено.

Возможным объяснением этого факта является то, что тест не был достаточно чувствительным, чтобы обнаружить малое число геномов Mycobacterium tuberculosis в ткани пациентов с саркоидозом или что Mycobacterium tuberculosis присутствует, но не содержит IS6110. Другое возможное объяснение этих отрицательных результатов - то, что небольшое число микроорганизмов вызывает интенсивный воспалительный ответ, аналогичный туберкулоидной лепре (3, 4). Также предлагалось, что причинный агент, связанный с саркоидозом - не целые микобактерии, а их антигены, например, микобактериальный hsp (7, 8). Кроме того, у наследственно предрасположенных индивидуумов, воздействие персистирующего антигена, включая микобактериальный hsp, вызывает усиленный местный клеточный иммунный ответ, что ведет к формированию гранулемы (1, 4).

Иммуногистохимический анализ в нашем исследовании показал экспрессию hsp70Mtb, hsp65Mtb и hsp16Mtb во всех 25 образцах ткани лимфатического узла пациентов с саркоидозом и в одном случае неспецифической лимфаденопатии со слабой реактивностью к hsp70Mtb. Остальная часть группы контроля не показала реактивности к hsp.

У пациентов с саркоидозом, реактивность к hsp70Mtb, hsp65Mtb и hsp16Mtb была найдена в гранулемах и у лимфоцитов, окружающих гранулему; однако, имелись различные уровни реактивности. Сравнение уровней экспрессии микобактериального hsp, показало более высокую реактивность hsp70Mtb, hsp65Mtb и hsp16Mtb в гранулемах. Экспрессия Hsp16Mtb была значительно более интенсивной, чем экспрессия hsp70Mtb в мембране лимфоцитов. В лимфатических узлах, экспрессия hsp70Mtb и hsp16Mtb была значительно выше, чем экспрессия hsp65Mtb. Анализ hspMtb в стадии I и II саркоидоза показал, что уровни экспрессии hsp70Mtb и hsp16Mtb были значительно выше, чем экспрессия hsp65Mtb в обеих стадиях. Экспрессия Hsp70Mtb была значительно выше в стадии II, чем в стадии I, принимая во внимание, что экспрессия hsp16Mtb была сопоставимой в обеих стадиях саркоидоза. Кроме того, реактивность hsp16Mtb в стадии I была значительно более интенсивной, чем реактивность hsp70Mtb и была сопоставима с реактивностью hsp70Mtb в стадии II. Интересно, что реактивность hsp65Mtb была значительно более интенсивной, чем реактивность hsp70Mtb и hsp16Mtb в капиллярах лимфатического узла.

Обсуждение

Наши результаты говорят, что hsp65Mtb и hsp16Mtb, участвующие в формировании иммунных комплексов при теберкулезе (9, 11), также формируются при раннем иммунном ответе при саркоидозе. Ранее мы сообщали (6) об увеличенной концентрации hsp70Mtb в сыворотке в той же самой группе пациентов, особенно со стадией II саркоидоза. Более высокие уровни экспрессии hsp70Mtb и hsp16Mtb по сравнению с hsp65Mtb в ткани лимфатического узла пациентов со стадией II саркоидоза могли быть вызваны секвестрацией антигена hsp65Mtb в связанной форме, например, в иммунных комплексах в мембране сосудов (5).

Наш анализ говорит, что не целые Mycobacterium tuberculosis но их специфические антигены, например, hsp70Mtb, hsp65Mtb и hsp16Mtb, могут участвовать в патогенезе саркоидоза. Возникновение hsp16Mtb связано с ранней стадией саркоидоза, принимая во внимание, что hsp70Mtb связан со стадией II болезни. Hsp65Mtb экспрессирован в капиллярах лимфатических узлов у пациентов с саркоидозом.