Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2007;48:3019-3025.

Связь между генетическими полиморфизмами белка температурного шока 70/Hom и увеитом у пациентов с саркоидозом

Paolo Spagnolo, Hiroe Sato, Sara E. Marshall, Katerina M. Antoniou, Tariq Ahmad, Athol U. Wells, Muhammad A. Ahad, Susan Lightman, Roland M. du Bois, and Kenneth I. Welsh
From the Clinical Genomic Group, National Heart and Lung Institute, Department of Occupational and Environmental Medicine, and the Department of Immunology, Imperial College, London, United Kingdom; the Gastroenterology Unit, Radcliffe Infirmary, University of Oxford, Oxford, United Kingdom; and the Department of Clinical Ophthalmology, Institute of Ophthalmology, Moorfields Eye Hospital, London, United Kingdom.

Реферат

Цель. Предрасположенность к саркоидозу, системной гранулематозной болезни неизвестной этиологии, является генетически детерминированной. Это исследование было предпринято, чтобы проверить гипотезу, что генетически, саркоидный увеит является особым семейством болезней, исследуя полиморфизмы единичного нуклеотида (SNPs) генов HSP-70/1 и HSP-70/HOM. Молекулы HSP70 играют ключевую роль в иммунном ответе, действуя как молекулы-наставники и индукторы секреции провоспалительных цитокинов.

Методы. Пять SNPs были оценены у 270 белых пациентов с саркоидозом, включая 88 с саркоидным увеитом и в согласованной по возрасту и расе контрольной группе, включавшей 347 индивидуумов. 125 пациентов с идиопатическим передним увеитом (IAU) и 56 с идиопатическим переходным увеитом (IIU) была также включены в исследование в качестве контрольной группы.

Результаты. Частота аллеля HSP-70/HOM rs2075800 G была выше в группе пациентов с саркодным увеитом, чем в группах с IAU, IIU и в контрольной группе (83 % против 71 %, OR = 2.00, PC = 0.01; и 83 % против 66 %, OR = 2.45, PC = 0.00005, соответственно). Подобные результаты наблюдались при рассмотрении частоты гаплотипа HSP-70 гаплотип 2 в этих же группах (47 % против 29 %, OR = 2.17, PC = 0.03; и 47 % против 21 %, OR = 3.26, PC = 0.0003, соответственно). Кроме того, частота HSP-70 гаплотип 2 различалась среди пациентов с саркоидным увеитом, IAU и IIU (47 % против 19 %, OR = 3.26, PC = 0.001; и 47 % против 23 %, OR = 2.81, PC = 0.04, соответственно).

Заключение. Мы обнаружили сильную связь между аллелем HSP-70/HOM rs2075800 G и увеитом у пациентов с саркоидозом. Чтобы понять молекулярные механизмы, лежащие в основе этой связи, необходимы дополнительные исследования.

Введение

Саркоидоз - системная воспалительная болезнь, характеризованная накоплением CD4+ T-лимфоцитов и макрофагов, формирующих неказеозные эпителиоидные гранулемы в пораженных органах (1,2). Причина болезни остается неизвестной. В настоящее время предполагается, что саркоидоз возникает в результате сложного взаимодействия между факторами окружающей среды и специфическим генетическим профилем хозяина.

На основании вариабельных клинических проявлений и исхода болезни, предполагается, что саркоидоз является семейством клинически и генетически различных болезней, связанных с различными фенотипами (3,6-9). Таким образом, саркоидный увеит может быть особым семейством болезней, характеризованным специфическим генетическим профилем. Саркоидный увеит особенно часто наблюдается в Японии, где более половины пациентов имеют болезнь глаз, в то время как в Европе, саркоидный увеит прооисходит у менее трети пациентов (10). Кроме того, саркоидоз глаз более распространен у чернокожих, чем у белых (11), что таже поддерживает гипотезу генетической восприимчивости (3).

Белок температурного шока (HSP) входит в группу высококонсервативных белков, которые в зависимоти от молекулярного веса сгруппированны в семейства различного размера (12). Белок температурного шока действует как внутриклеточный “наставник” (“chaperon”), участвуя в обеспечении сборки пространственной структуры белков при физиологических состояниях а также после физического или химического стресса (13). (Примечание переводчика: слово “chaperon” переводится как ''пожилая женщина, сопровождающая молодых девушек на балах''). Внеклеточный HSP участвует в процессинге и презентации иммуногенных пептидов цитотоксическим T-клеткам, активизирует иммунную систему и стимулирует секрецию провоспалительных цитокинов моноцитами (14,15). У людей, три члена семейства HSP-70 были картированы в регионе 6p21.3 человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) класса III (16). HSP-70/1 (HSPA1A) и HSP-70/2 (HSPA1B) кодируют идентичные белки, которые отличаются регулирующем регионом, принимая во внимание, что HSP-70/HOM (HSPA1L) имеет последовательность аминокислот, практически идентичную HSP-70, но экспрессирован конституитивно.

Полиморфизмы единичного нуклеотида (SNPs) генов HSP-70 связаны с несколькими болезнями (17-21). Однако, малое число пациентов в исследованиях и высокая неравновесность сцепления в регионе HLA, препятствуют обнаружению точного локуса, связанного с этиологией болезни. Тем не менее, важность HSP70 в защите клеток от стресс-индуцированного апоптоза, указывает на возможность участия этих генов в патогенезе саркоидоза (22). Учитывая важность апоптоза в патогенезе увеита, мы исследовали гипотезу, что саркоидный увеит связан с полиморфизмами генов HSP-70.

Пациенты и контрольная группа

В исследование были включены 270 белых пациентов с саркоидозом, включая 88 пациентов с клиническими признаками саркоидного увеита, которые наблюдались в Sarcoidosis Clinic of Royal Brompton Hospital (London, UK), куда направляются больные с саркоидозом главным образом с юго-востока Великобритании. У всех пациентов саркоидоз был диагностирован согласно критериев ATS/ERS/WASOG (2).

Пациенты с поражением глаз были оценены в специализированной клинике (Moorfields Eye Hospital) одним из авторов. 27 (31 %) пациентов имели панувеит, 22 (25 %) передний увеит, 22 (25 %) задний увеит и 17 (19 %) переходной увеит. У 34 пациентов (39 %) проводилось лечение местными или системными стероидами. Полный отчет относительно офтальмологической экспертизы был доступен для 62 (70 %) пациентов с саркоидым увеитом. Офтальмологическая экспертиза показала кистоидный макулярный отек у 29 (47 %) пациентов, признаки васкулита у 18 (29 %), ''снежные комья'' у 8 (13 %) и поражение зрительного нерва у 6 (10 %) пациентов. Письменное информированное согласие было получено у всех пациентов. Комитет по этике Royal Brompton Hospita дал разрешение на проведение исследования.

Также были исследованы 125 пациентов с идиопатическим передним увеитом (IAU) и 56 с идиопатическим переходным увеитом (IIU). Они были привлечены из Uveitis Clinic at Moorfields Eye Hospital. Передний увеит был определен как воспаление, ограниченное передней камерой и/или передней частью стекловидного тела. Переходной увеит был определен как воспаление, поражающее стекловидное тело, ресничный кружок (pars plana) и периферическую сетчатку (23, 24). Болезнь была определена как идиопатическая, когда не имелось никаких симптомов, признаков или результатов исследования, суггестивных для альтернативного диагноза. Поэтому, пациенты с увеитом инфекционной этиологии или увеитом, связанным с известной системной болезнью (например, рассеянным склерозом, анкилозирующим спондилитом, синдромом Рейтера, болезнью Бехчета или воспалительной болезнью кишечника) не были включены в это исследование. Клинический фенотип пациентов был определен при взятии пробы крови. После получения письменного информированного согласия, были собраны демографические данные и истории болезни для каждого из пациентов. Комитет по этике Moorfields Eye Hospital дал разрешение на проведение исследования.

В контрольную группу было включено 347 индивидуумов с юго-востока Великобритании, согласованных по полу, возрасту и этнической принадлежности с пациентами. Они были отобраны в случайном порядке из 10,000 здоровых индивидуумов, проходивших текущий скрининг у врачей общей практики.

Результаты

Были исследованы 5 биаллельных SNPs: rs1008438 A/C (HSP-70/1, промотор), rs1043618 C/G (HSP-70/1, промотор), rs1043620 C/T (HSP-70/1, экзон), rs2227956 T/C (HSP-70/Hom, экзон, кодирующий последовательность Met/Thr), rs2075800 G/A (HSP-70/Hom, экзон, кодирующий последовательность Gly/Lys), согласно публичной базе данных SNP (28). Были образованы 7 гаплотипов, включая два редких гаплотипа (гаплотипы 6, 7). Компьютераная программа PHASE использовалась отдельно для пациентов и контрольной группы и показала идентичную структуру гаплотипа HSP-70. Для каждого SNP, соотношение гетерозиготных и гомозиготных генотипов было совместимо с законом Харди-Вайнберга у пациентов с саркоидозом и в контрольной группе.

Аллели и гаплотипы HSP-70/1 и HSP-70/HOM, связанные с саркоидозом

Анализ SNP всех пациентов с саркоидозом показал существенное увеличение частоты аллеля rs1043620 C по сравнению с контрольной группой (91 % против 85 %, OR = 1.78, 95 % CI = 1.25-2.53, PC = 0.006). Частота аллеля rs2075800 G также была увеличена в группе пациентов с саркоидозом по сравнению с контрольной группой (75 % против 66 %, OR = 1.49, 95 % CI = 1.16-1.92, PC = 0.007). Другие варианты rs1008438, rs1043618 и rs2227956, не показали различий в генотипе, фенотипе и частоте аллелей между пациентами с саркоидозом и контрольной группой.

Дальнейший анализ гаплотипов показал, что HSP-70 гаплотип 2 значительно чаще наблюдался у пациентов с саркоидозом по сравнению с контрольной группой (34 % против 21 %, OR = 1.97, 95 % CI = 1.37-2.82, PC = 0.003). Гаплотип 3 наблюдался значительно чаще в контрольной группе (43 % против 56 %, OR = 0.59, 95 % CI = 0.43-0.82, PC = 0.01). Кроме того, частота гаплотипа 4 была значительно ниже у пациентов с саркоидозом (18 % против 28 %, OR = 0.57, 95 % CI = 0.39-0.84, PC = 0.03), принимая во внимание, что частота гаплотипа 5 была значительно выше у пациентов с саркоидозом по сравнению с контрольной группой (16 % против 7 %, OR = 2.32, 95 % CI = 1.39-3.87, PC = 0.01).

Аллели и гаплотипы HSP-70/1 и HSP-70/HOM, связанные с саркоидным увеитом

Затем, пациенты с саркоидозом были разделены на две группы, согласно присутствию или отсутствию болезни глаз. Анализ SNP показал, что аллель rs1043620 C наблюдался значительно чаще в группе без саркоидного увеита, по сравнению с контрольной группой (91 % против 85 %, OR = 1.81, 95 % CI = 1.20-2.73, PC = 0.02). Напротив, частота аллеля rs2075800 G была значительно выше в группе с саркоидным увеитом по сравнению с пациентами без увеита (83 % против 71 %, OR = 2.00, 95 % CI = 1.28-3.15, PC = 0.01) и контрольной группой (83 % против 66 %, OR = 2.45, 95 % CI = 1.61-3.72, PC = 0.00005). Ни один из других исследованных SNP не показал различий в генотипе, фенотипей и частоте аллелей в этих трех группах. При анализе подгруппы пациентов с саркодиным увеитом, не было обнаружено связи с любым из исследованных SNP.

Анализ гаплотипов показал, что частота HSP-70 гаплотип 2 была значительно увеличена в группе с саркоидным увеитом, по сравнению с пациентами без увеита (47 % против 29 %, OR = 2.17, 95 % CI = 1.28-3.67, PC = 0.03) и с контрольной группой (47 % против 21 %, OR = 3.26, 95 % CI = 2.0-5.32, PC = 0.0003). Частота HSP-70 гаплотип 3 была значительно уменьшена в группе пациентов с саркоидным увеитом по сравнению с контрольно группой (28 % против 56 %, OR = 0.31, 95 % CI = 0.19-0.53, PC = 0.0006) и пациентами без увеита (28 % против 49 %, OR = 0.41, 95 % CI = 0.24-0.71, PC = 0.01). Кроме того, частота HSP-70 гаплотип 5 была значительно выше в группе с саркоидным увеитом, по сравнению с контрольно группой (18 % против 7 %, OR = 2.76, 95 % CI = 1.42-5.37, PC = 0.02). Никаких других существенных различий в частоте гаплотипов HSP-70 отмечено не было.

В группе пациентов с саркоидным увеитом, не было обнаружено связи между фенотипами болезни и любым из гаплотипов. Однако, наше исследование не было достаточно мощным для выполнения такого анализа.

Аллели и гаплотипы HSP-70/1 и HSP-70/HOM, связанные с саркоидным увеитом и идиопатическим увеитом

Чтобы определить, является ли связь HSP-70 с саркоидым увеитом специфической, мы сравнили пациентов с саркоидным увеитом с пациентами с идиопатическими формами увеита. Частота аллеля rs2075800 G была значительно увеличена у пациентов с саркоидным увеитом, по сравнению с пациентами с IAU (83 % против 62 %, OR = 3.00, 95 % CI = 1.88-4.78, PC = 0.00001) и контрольной группой (83 % против 66 %, OR = 2.45, 95 % CI = 1.61-3.72, PC = 0.00008). Кроме того, более высокая частота аллеля rs1043620 C наблюдалась у пациентов с IAU по сравнению с контрольной группой (94 % против 85 %, OR = 2.78, 95 % CI = 1.60-4.84, PC = 0.0007).

Анализ гаплотипов показал более высокую частоту HSP-70 гаплотип 2 у пациентов с саркоидным увеитом по сравнению с пациентами с IAU (47 % против 19 %, OR = 3.62, 95 % CI = 1.97-6.64, PC = 0.001) и IIU (47 % против 23 %, OR = 2.81, 95 % CI = 1.34-5.89, PC = 0.04). Частота HSP-70 гаплотип 3 была ниже в группе у пациентов с саркоидным увеитом по сравнению с пациентами с IAU (28 % против 60 %, OR = 0.27, 95 % CI = 0.15-0.48, PC = 0.0006) и IIU (28 % против 52 %, OR = 0.37, 95 % CI = 0.19-0.75, PC = 0.04). Кроме того, частота HSP-70 гаплотип 4, была более низкой у пациентов с IAU по сравнению с контрольной группой (12 % против 28 %, OR = 0.35, 95 % CI = 0.20-0.63, PC = 0.005).

Никаких другий различия в частоте гаплотипа HSP-70 отмечено не было.

Частота HLA-B27 у пациентов с саркоидным увеитом, без саркоидного увеита, пациентов с IAU, IIU и в контрольной группе

Передний увеит, связанный с HLA-B27 - клиническое состояние, имеющее особое медицинское значение из-за его офтальмологических, системных, иммунологических и генетических особенностей. Кроме того, это состояние связано с серьезной болезнью глаз и рекуррентными эпизодами воспаления (29, 30). Чтобы исключить возможность, что связь с HSP70, обнаруженная в нашем исследовании является вторичной к неравновесности сцепления с HLA-B27, мы определили, вносило ли вклад носительство аллеля HLA-B27 в болезнь глаз при саркоидозе. Никакой связи с саркоидным увеитом идентифицировано не было (пациенты с саркоидным увеитом 2 %, пациенты без саркоидного увеита 7 %, контрольная группа 9 %), принимая во внимание, что увеличенная частота HLA-B27 наблюдалась у пациентов с IAU (68 %; OR = 21.95, P < 0.0001 против контрольной группы; OR = 91.54, P < 0.0001 против пациентов с саркоидным увеитом; OR = 7.72, P < 0.0001 против пациентов с IIU) и пациентов с IIU (22 %, OR = 2.84, P = 0.005 против контрольной группы; OR = 11.86, P = 0.0002 против пациентов с саркодным увеитом).

Впоследствии, чтобы проверить потенциал влияния аллеля HLA-B27 на связь между HSP-70 и саркоидным увеитом, мы выполнили логистический регрессионный анализ. HSP-70 гаплотип 2 остался сильно связанным с саркоидным увеитом по сравнению с пациентам без саркоидного увеита (OR = 1.84, 95 % CI = 1.06-3.17, P = 0.03), IAU (OR = 3.9, 95 % CI = 1.62-9.41, P = 0.002), IIU (OR = 2.67, 95 % CI = 1.20-5.91, P = 0.015) и контрольной группой (OR = 3.23, 95 % CI = 1.91-5.44, P < 0.0001).

Обсуждение

В этом исследовании мы показали, что аллель HSP-70/HOM (rs2075800 G) и соответствующий гаплотип (HSP-70 гаплотип 2) связаны с увеитом у пациентов с саркоидозом. Кроме того, мы использовали индивидуумов с идиопатическими формами увеита (IAU и IIU) в качестве контрольной группы и показали, что связь HSP-70 с саркоидным увеитом является специфической. Кроме того, из-за известной связи между HLA-B27 и увеитом (30), мы выполнили логистический регрессинный анализ и подтвердили, что HSP-70/HOM rs2075800 G является фактором риска для саркоидного увеита, независимым от HLA-B27. Эти результаты говорят, что увеит вероятно является следствием различных иммунопатогенетических процессов и гены предрасположенности к увеиту в значительной степени зависят от основной болезни.

HSP-70 гаплотип 2 (аллель rs2075800 G) связан с саркоидным увеитом. При этом, HSP-70 гаплотип 3 (аллель rs2075800 А) является защитным от саркоидного увеита. Поскольку гаплотипы 2 и 3 отличаются только по аллелю rs2075800, мы предполагаем, что фенотипический эффект, скорее связан с этим вариантом (смысловой заменой нуклеотидов), чем с гаплотипом. Однако, из-за сильной неравновесности сцепления, существующей в регионе HLA, мы не можем исключить, что связь между HSP-70/HOM и саркоидным увеитом вторична к другим связанным полиморфизмам.

Сообщалось, что аллель HSP70/HOM rs2075800 А был связан с ревматоидным артритом (19). HSP-70/Hom rs2227956 был связан с саркодозом с и без синдрома Лёфгрена в группе Польских пациентов (21). В наше исследование не были включены пациенты с классическим синдромом Лёфгрена. Однако, мы не смогли воспроизвести эти результаты в нашей группе пациентов с саркоидозом без синдрома Лёфгрена (n = 270). Это несоответствие наиболее вероятное произошло из-за малого числа пациентов в Польском исследовании (синдром Лёфгрена, n = 13, без синдрома Лёфгрена, n = 29), чем из-за этнических различий, хотя частота аллеля С в Британской и Польской контрольных группах различалась (19 % и 12 %, соответственно).

Из-за отсутствия функциональных исследований, о биологических последствиях связи между HSP70/HOM rs2075800 и саркоидным увеитом, можно лишь предполагать. Замена нуклеотида G на A ведет к формированию новой аминокислоты в позиции 602 HSP70/HOM. Согласно исследований модели Escherichia coli (31), этот SNP может влиять на экспрессию и функциональную эффективность HSP-70/HOM, таким образом вызывая накопление патологических белков в пределах клеток.

Одной из интригующих гипотез является то, что вариант HSP-70/HOM модулирует риск саркоидного увеита не потому, что влияет на действия HSP-70 как внутриклеточного “наставника” (“chaperon”), а потому что, влияет на степень увеального воспалительного процесса. HSP-70 также действует как ранний ииндуктор неспецифического провоспалительного ответа, стимулируя моноцитарные клетки к производству IL-1, IL-6 и TNF-alpha (1,14). Кроме того, HSP-70 стимулирует производство IL-12, следовательно T-клетки могут производить большее количество IFN-gamma и TNF-alpha, которые играют важную роль в иммунопатогенезе увеита (32). Принимая во внимание, что HSP-70/1 и HSP-70/2 - стрессовые белки, которые синтезируются в ответ на тепловой шок и некоторые химические вещества и что HSP-70/Hom конституитивно экспрессирован в различных органах, включая глаза (33), измененная экспрессия HSP70HOM может влиять на способность клеток противостоять воспалению или изменять порог апоптоза клеток в пределах глаза.

Наши результаты показывают, что аллель HSP70/HOM rs2075800 G связан с развитием увеита у пациентов с саркоидозом, что еще раз поддерживает гипотезу, что широкое разнообразие фенотипов саркоидоза, по крайней мере частично, связано со специфическими генетическими профилями. Эта связь является специфической для саркоидного увеита, поскольку частота аллеля rs2075800 G различается между саркоидным и другими идиопатическими формами увеита. Главным ограничением этого и многих других исследований генетических полиморфизмов является неполное понимание биологического значения SNP. Наше исследование также выдвигает на первый план важность точной фенотипической классификации, поскольку генетические исследования вероятно будут более успешными, если исследуется точно определенный, специфический фенотип болезни. Связь между HSP-70/HOM rs2075800 и саркоидным увеитом должна быть проверена в различных этнических группах.