Am. J. Respir. Cell Mol. Biol Volume 19, Number 2, August 1998 250-258

Экспрессия инсулиноподобный фактор роста связывающих белков в бронхоальвеолярном лаваже пациентов с легочным саркоидозом

Jeremy T. Allen, Claire A. Bloor, Richard A. Knight, and Monica A. Spiteri
Lung Injury and Inflammation Research Group, Department of Respiratory Medicine, North Staffordshire Hospital Trust, Staffordshire, United Kingdom

Реферат

Паренхиматозные гранулемы при легочном саркоидозе обычно разрешаются спонтанно. Однако, остается неясным, какие механизмы являются ответственными за прогресс к локальному или диффузному фиброзу с необратимым изменением архитектуры легкого, которое происходит у 20 % пациентов. Альвеолярные макрофаги играют стержневую роль при саркоидозе, производя различные медиаторы, включая инсулиноподобный фактор роста (IGF-1), мощную профибротическую молекулу. Биоактивность IGF-1 в легком зависит по крайней мере от шести IGF-связывающих белков белков с высокой афинностью (IGFBP), которые главным образом ингибируют действие IGF-1. Мы исследовали их присутствие у пациентов со стадией III саркоидоза, чтобы определить, вносят ли IGF-1 и IGFBP вклад в процесс фиброза и прогресс болезни у этих пациентов. Митогенный потенциал фибробластов в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) был более чем в 3 раза выше (P < 0.005) у пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля. Активность в БАЛ уменьшалась (P < 0.0005) при использовании антител к IGF-1. Мы установили профиль IGFBP с помощью Вестерн-блоттинга и определили экспрессию IGFBP-3. IGFBP-2 и IGFBP-4 преобладают в БАЛ пациентов с саркоидозом и группы контроля, но IGFBP-3 наблюдается только в виде малой 29-kD формы, экспрессия которой была увеличена (P < 0.003) у пациентов с саркоидозом. Экспрессия гена IGF-1 и IGFBP-3 в клетках БАЛ была продемонстрирована с помощью полимеразной цепной реакцией с обратной транскриптазой. Таким образом, локальное производство профибротического IGF-1 может быть подчиненно посттрансляционному регулированию ассоциированными с IGFBP и IGFBP-протеазами, которые могут вносить вклад в усиление фиброгенеза у пациентов с саркоидозом или развития фиброза.

Введение

Легочный саркоидоз - гранулематозная болезь неизвестной этиологии. Накопление в легком активизированных иммунных клеток, прежде всего активизированных олигоклональных CD4+ T-клеток и макрофагов вместе с производством различных провоспалительных цитокинов, определяет такие иммунные феномены, как развитие и разрешение саркоидных гранулем (1, 2). Обычно, саркоидоз - самоограниченная болезнь с возможностью спонтанной ремиссии. Однако, приблизительно в 20 % случаев, гранулематозное воспаление прогрессирует к локальному или диффузному фиброзу, с необратимым ухудшением функции легкого (3, 4).

Мы ранее продемонстрировали, что альвеолярные макрофаги (АМ), имеют критическое влияние не только на инициирование саркоидного воспаления посредством T-клеточных иммунных реакций, но также и на последующие процессы, через взаимодействие с другими эффекторными клетками, такими как фибробласты (5, 6). Количество АМ в бронхоальвеолярном лаваже увеличено (5, 7). Активизированные АМ производят различные медиаторы, способные модулировать функции фибробластов, включая цитокины (8) и факторы роста, например инсулино-подобного фактора роста 1 (IGF-1) (9). IGF-1 - профибротический медиатор, действующий как мощный митоген и стимулятор синтеза коллагена фибробластами (10, 11). IGF-1, производимый АМ имеет значительно большую молекулярную массу (20-26 kD) чем серологическая форма (7.6 kD), но имеет такую же фиброгенность (9). Другие типы клеток также демонстрируют экспрессию транскрипции IGF-1 и производство иммунореактивного IGF-1 (12). Увеличенная экспрессия и производство IGF-1 были обнаружены у пациентов с идиопатическим легочным фиброзом (15) и системным склерозом (16).

Локальная биоактивность IGF-1 в легком находится под влиянием системы по крайней мере шести специфических IGF-связывающих белков с высокой афинностью (IGFBP 1-6) регулирующих уровни IGF-1 (17). IGFBP-3 - основная циркулирующая форма (18), которая формирует большой 150-kD комплекс с IGF-1 и кислотолабильной субъединицей, значительно увеличивая период полураспада IGF-1 (19). Функциональная роль IGFBPs известна плохо (17, 20, 21). Их действие обычно ингибирующее, посредством влияния на связывание IGF-1 с его рецептором, но также может быть стимулирующим. Это присходит при связывании IGFBP с поверхностью клеток или внеклеточного матрикса, что снижает аффинность IGFBP. Кроме того, они обладают независимой от IGF-1 активностью по ингибированию роста клеток, возможно посредством рецепторов IGFBP (22, 23). Посттрансляционная модификация IGFBP также происходит при усилении фосфорилирования и протеолитическом уменьшении афинности IGFBP, таким образом уменьшая или увеличивая биоактивность IGF-1 (24).

Легочный саркоидоз является превосходной клинической моделью для изучения не только инициирования воспалительного ответа но также событий, участвующих в ремиссии или прогрессе к фиброзу. Однако, остается неясным, какие механизмы участвуют в репаративных процессах в легком, которые у некоторых пациентов не происходят, ведя к необратимому фибозу. Мы исследовали вклад IGF-1, модуляцию его биоактивности IGFBP и фиброгенетические характеристики саркоидоза. Для этой цели мы сравнили митогенный потенциал фибробластов БАЛ пациентов с саркоидозом (с идентифицированным паренхиматозным вовлечением) и группы контроля а также оценили вклад IGF-1 в митогенез. Мы также установили профиль IGFBP в БАЛ у пациентов с саркоидозом и в группе контроля и количественно определили различия в экспрессии IGFBP-3. IGFBP-3 был выбран из-за его уникальных функций (17). Экспрессия гена IGF-1 и IGFBP-3 были определены в недавно изолированных ex vivo клетках БАЛ, чтобы подтвердить, что клетки, связанные с ограниченной иммунной реакцией могли служить источником производства этих медиаторов.

Пациенты

В исследовании участвовали восемь некурящих пациентов (3 мужчины, 5 женщин) с клинически активным легочным саркоидозом. Все пациенты имели стадию III саркоидоза с двусторонними узловыми паренхиматозными инфильтратами, включая области фиброза и сотовое легкое. Три пациента имели значительное уменьшение общей емкости легких и всех имели уменьшение DLco. Ни один из пациентов не получал стероидную или другую иммуносупрессивную терапию. Группа контроля состояла из 10 некурящих добровольцев (6 мужчин, 4 женщины) с нормальной рентгенограммой и функцией легких. Ни у одного из них не наблюдалось никаких респираторных симптомов в течение месяца до проведения исследования. Исследования было одобрено комитетом по этике. Все пациенты дали информированное письменное согласие.

Результаты

Анализ БАЛ

Пациенты с легочным саркоидозом имели значительно более высокий полный индекс клеток, увеличенное абсолютное число АМ, увеличенное абсолютное число и процент лимфоцитов в БАЛ по сравнению с группой контроля.

Профиль IGFBP в БАЛ

В группе контроля были идентифицированы 24 kD IGFBP-4, 29 kD IGFBP-1 и 33 kD IGFBP-2. Не был обнаружен IGFBP-3, который был обнаружен в контрольном образце как дублет с молекулярной массой приблизительно 45 и 42 kD. Подобный паттерн был обнаружен у пациентов с саркоидозом, хотя три пациента, имевшие более агрессивную болезнь со значительной дисфункцией легкого, имели увеличенный уровень IGFBP-2.

Экспрессия гена IGF-1 и IGFBP-3 клеток БАЛ

Была выполнена полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой мРНК клеток БАЛ пациентов с саркоидозом и группы контроля, чтобы подтвердить присутствие локального альвеолярного источника этих молекул. Количественный анализ экспрессии в этом исследовании выполнен не был.

Пролиферация клеток, индуцированная БАЛ

После обнаружения, что саркоидный БАЛ содержит увеличенные уровни частично деградированного IGFBP-3, мы выяснили, имеется ли сопутствующее влияние на биоактивность IGF-1 в БАЛ. Поэтому, были выполнены эксперименты, чтобы обнаружить пролиферативный эффект БАЛ на фибробласты здоровых индивидуумов. Сначала мы определили, увеличивалась ли пролиферация клеток в присутствии саркоидного БАЛ. Затем, используя IGF-1-специфические антитела, мы исследовали, могло ли увеличение свободного IGF-1 объяснить изменения пролиферации.

Индуцированная саркоидным БАЛ пролиферация была значительно выше (P < 0.0005 при разбавлении 1/16 и 1/256; P < 0.005 при разбавлении 1/512 и 1/1024) по сравнению небольшим пролиферативным эффектом, наблюдаемым в группе контроля. Максимальная пролиферация было достигнута при разбавлении 1/16 для обеих групп, но стимуляция саркоидным БАЛ была больше на 60 % чем в группе контроля.

Антитела к IGF-1 были способны к полному блокированию IGF-1-индуцированной пролиферации фибробластов (P < 0.0002). Индуцированная саркоидным БАЛ активность была уменьшена приблизительно на 40 % (P < 0.0005); однако, в группе контроля не имелось значительного уменьшения пролиферации.

Обсуждение

Фиброз является конечной стадией сложного патологического процесса. Идентификация клеточного ответа, ведущего к развитию фиброза может позволить проводить раннее и успешное терапевтическое вмешательство (32). Прогресс многих интерстициальных болезней легкого в конечном счете ведет к фиброзу легкого, хотя все еще неясно, почему при легочном саркоидозе фиброз развивается у относительно малого процента пациентов. Характерно, что воспалительный ответ определяется взаимодействием между активизированными макрофагами и лимфоцитами. Существуют доказательства, что эти клетки производят фибробласт-стимулирующий фактор роста, IGF-1. Было показано, что лимфоциты периферической крови экспрессируют IGFBP-2 и IGFBP-3, но после активации, также экспрессируются IGFBP-5 и IGF-1 (12). Вероятно поэтому экспрессия IGF-1 и этих трех IGFBPs при саркоидозе увеличена. АМ пациентов с саркоидозом спонтанно производят фактор роста, идентифицированный как тканевый IGF-1 (33), большая форма той же самой молекулы была идентифицирована как сывороточный IGF-1 (11). Это 70-аминокислотый пептид (экзоны 3 и 4) с дополнительной N-терминальной последовательностью, являющейся результатом альтернативного сплайсинга экзонов 1 или 2, и C-терминальной последовательностю E-пептида, сформированной вследствие альтернативного сплайсинга экзонов 4-6. Клетки БАЛ в этом исследовании экспрессировали IGF-1EB транскрипты (экзоны 4-5), как было показано с помощью полимеразной цепной реакцией с обратной транскриптазой. Увеличение спонтанного производства IGFBP-3 АМ наблюдается у пациентов с идиопатическим легочным фиброзом (15) и должно быть обнаружено при легочном саркоидозе.

Мы показали, что неповрежденный 46-kD IGFBP-3 практически отсутствует в БАЛ пациентов с саркоидозом и группы контроля. Однако, 29 и 16 kD фрагменты IGFBP-3 с существенным увеличением экспрессиии этих фрагментов, особенно 29-kD, были обнаружены в БАЛ пациентов с саркоидозом. 29-kD фрагмент IGFBP-3 мигрирует вместе с IGFBP-1, и слабый сигнал, соответствующий этой молекулярной массе, может представлять остаток IGF-1 связанный с фрагментом IGFBP-3, скорее чем IGFBP-1. Низкие уровни IGFBP-3 даже при саркоидозе, где концентрация фрагмента IGFBP-3 увеличена, поэтому, соответствуют уменьшению его аффинности к IGF-1 после протеолиза к меньшим формам. Протеолиз IGFBP IGFBP-специфическими ферментами был описан для IGFBP-2 (35), IGFBP-3 (26, 36), IGFBP-4 (38, 42, 43) и IGFBP-5 (43, 44). Возможно, действие протеаз снижает аффинность IGF к IGFBP, что может увеличивать биоактивность IGF (45). Наши данные согласуются с этими результатами и указывают, что активность IGFBP-3 протеазы, может регулировать концентрацию свободного IGF-1. Измененный IGFBP-3, обнаруженный в БАЛ, был идентифицирован как 29- и 16-kD фрагменты. 29-kD иммунореактивный фрагмент IGFBP-3 вероятно является протеолитическим фрагментом IGFBP-3 с уменьшенной аффинностью к IGFS (46). Недавно, 16-kD негликозилированный протеолитический фрагмент IGFBP-3 был идентифицирован in vitro культуре IGFBP-3 с плазмином (39). Действительно, этот фермент ранее был идентифицирован как IGFBP-3 протеаза в различных биологических жидкостях (47). Другие известные IGFBP протеазы включают металлопротеиназы (49, 50), но не ясно имеются ли другие, пока еще неизвестные, возможно IGFBP-специфические протеазы. Активность IGFBP-3 протеазы увеличивается при беременности (37, 38) и при некоторых патологических состояниях (46). Пока неясно, имеет ли место локальное производство протеазы на участках воспалительной активности.

Производство IGFBP-3 и IGF-1 происходит локально, что подтверждается экспрессией гена IGFBP-3 и IGF-1 клеток БАЛ. Поэтому, источниками IGFBP и IGF-1 скорее всего являются АМ и лимфоциты. Действительно, мы подтвердили, что АМ, выделенные из БАЛ являются источником IGFBP и IGF-1 и высоко вероятно, что лимфоциты также производят IGFBP и IGF-1, по крайней мере у пациентов с саркоидозом, учитывая, что активированные лимфоциты экспрессируют и IGF-1 и IGFBP-3 (12). Кроме того, мы обнаружили экспрессию IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-6 и IGFBP-7 в нефракционированном БАЛ у пациентов с саркоидозом и в группе контроля. В дальнейшем, должен быть выполнен количественный анализ экспрессии мРНК IGF-1 и IGFBP-3 у пациентов с саркоидозом и здоровых индивидуумов. Однако, значение любых различий между экспрессией гена может быть уменьшено из-за сильного регулирования на посттрансляционном уровне, IGFBPs - IGF-1 и IGFBP протеаза - IGFBPs, определяя их вклад в фиброогенетический ответ. Подобные наблюдения были недавно описаны для пациентов с IPF (15). Интересно, что IGFs могут модулировать уровни IGFBP с участием IGFBP-3, с помощью механизмов независимого de novo синтеза и взаимодействия с IGF-1 рецептором, включая производство мембрана-ассоциированного IGFBP-3 (52). Таким образом, локальное увеличение IGF-1 может приводить к увеличению IGFBP-3, наблюдаемому у пациентов с саркоидозом. Присутствие IGFBP-3 протеазы регулирует биоактивность IGF-1 посредством частичного протеолиза IGFBP-3 и уменьшения аффинности 29-kD фрагмента IGF-1. 16-kD фрагмент, наблюдаемый в нашем исследовании, вообще не имел аффинности к IGF (39). Дальнейшие доказательства увеличенной фиброгенной активности у пациентов с саркоидозом были получены в исследованиях пролиферации клеток. Наши данные показали, что митогенный потенциал фибробластов саркоидного БАЛ в три раза выше, чем у здоровых индивидуумов. Использование IGF-1-специфических антител показало, что приблизительно 40 % фиброгенной активности в саркоидном БАЛ может быть приписано IGF-1. Это контрастировало с нормальным БАЛ, в котором анти-IGF-1 не вызывал значительного уменьшения пролиферации, предполагая что производство IGF-1 очень мало. Эти данные согласуются с результатами, полученными у пациентов с системным склерозом (16) и пневмоэктомизированных крыс (56).

Роль IGFBP (особенно IGFBP-3) в пролиферации клеток, однако, более сложна чем предотвращение связи IGF с его рецептором. Было предположено, что при некоторых условиях IGFBP может усиливать действие IGF-1 посредством связи IGFBP с поверхностью клеток или внеклеточным матриксом, уменьшая аффинность IGFBP для IGF-1 (17). Недавние исследования предполагают, что имеется механизм IGF-1-независимого ингибирования пролиферации клеток, включая апоптоз, посредством IGFBP-3 рецепторов. Предположительно это связано с взаимодействием IGFBP-3 с поверхностью клеток, так как образовавшийся комплекс IGFBP - IGF-1 не ингибирует пролиферацию. Обнаружение нуклеарной локализации IGFBP-3 подразумевает, что он участвует в транскрипционном контроле генов, регулирующих рост (57). В этом исследовании, увеличение местного производства IGF-1 приводит к ответному синтезу IGFBP-3. Это защитное действие может вести к секвестрации IGF-1 и ограничению биоактивности. Однако, наблюдаемое увеличение IGFBP-3 у пациентов саркоидозом приводит к нарушению антипролиферативного механизма. Этот сценарий не возникает в группе контроля, хотя у них также наблюдается активность IGFBP-протеазы, потому что этот процесс представляет ответ на увеличение свободного IGF-1, но не является причиной этого. Интересно, что 30-kD протеолитический фрагмент усиливает действие IGF-1, предполагая, что этот фрагмент может иметь митогенную активность, в отличие от нативного IGFBP-3 (58). Мы предполагаем, что дифференциальное регулирование IGF-1 ассоциированными IGFBPs и протеазами может вносить вклад в увеличение фиброгенеза, наблюдаемое у индивидуумов с легочным саркоидозом и может быть вовлечено в патогенез других интерстициальных болезней легкого. Мы выдвигаем гипотезу, что фиброгенетические медиаторы (IGF-1) резидентно находятся в легком, как часть нормального репаративного процесса, но обычные ингибиторы фиброгенеза (вероятно IGFBPs) не в состоянии ограничить их экспрессию.