The Journal of Immunology, 2001, 166: 642-649.

Увеличенные уровни IL-12 и IL-18 в легких при саркоидозе стимулируют производство IFN-gamma

Katsunori Shigehara, Noriharu Shijubo, Mitsuhide Ohmichi, Ryuji Takahashi, Shin-ichiro Kon, Haruki Okamura, Masashi Kurimoto|, Yohmei Hiraga, Tachio Tatsuno, Shosaku Abe and Noriyuki Sato
Hokkaido Branch of Japan Anti-Tuberculosis Association, Sapporo, Japan; Third Department of Internal Medicine and First Department of Pathology, Sapporo Medical University School of Medicine, Sapporo, Japan; Department of Respiratory Disease, Sapporo Hospital, Hokkaido Railway Co. Sapporo, Japan; Laboratory of Host Defense, Institute for Advanced Medical Sciences, Hyogo Medical College, Nishinomiya, Japan; and Fujisaki Institute, Hayashibara Biochemical Laboratories, Okayama, Japan

Реферат

Саркоидоз - системная хроническая гранулематозная болезнь неизвестной этиологии. Недавние исследования показали, что в саркоидных повреждениях наблюдается Th1 профиль цитокинов. Чтобы получить лучшее понимание иммунопатологии саркоидоза, мы исследовали экспрессию IL-12 и IL-18 и их роль в производстве IFN-gamma при легочном саркоидозе. В случаях саркоидоза, по сравнению со здоровыми индивидуумами, уровни IL-12 (p40 и p70) и IL-18 в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) значительно выше. IL-12 p70 и IL-18 были экспрессированы в эпителиоидных клетках и гигантских клетках саркоидных гранулем. Значительная индукция IFN-gamma, IL-12 p70 и IL-18 наблюдалась у клеток БАЛ при стимуляции LPS, принимая во внимание, что LPS стимулировал только IL-12 p70 клетки БАЛ в группе контроля. Пациенты с саркоидозом имели значительно большую индукцию IFN-gamma при стимуляции LPS, чем группа контроля. Экспрессия мРНК IL-18 наблюдалась у недавно изолированных клеток БАЛ также как и у LPS-стимулированных клеток БАЛ, но экспрессия IFN-gamma и мРНК IL-12 наблюдались только у LPS-стимулированных клеток БАЛ. Использование Anti-IL-12- и Anti-IL-18 значительно уменьшало производство IFN-gamma LPS-стимулированными саркоидными клетками БАЛ. Добавление rIL-12 или rIL-18 вызвало более сильное увеличение производства IFN-gamma саркоидными клетками БАЛ чем клетками БАЛ группы контроля. Мы обнаружили, что биоактивные IL-12 и IL-18 производятся при саркоидозе клетками БАЛ и в синергизме индуцируют производство IFN-gamma, указывая, что это важные цитокины в Th1 ответе при саркоидозе.

Введение

Интерлейкин-18 был недавно описан как цитокин семейства IL-1 и был первоначально определен как IFN-gamma-стимулирующий фактор (1). Кроме активации лимфоцитов, последующие исследования объяснили множество эффекторных функций IL-18 , которые делают IL-18 важным регулятором врожденных и приобретенных иммунных реакций (2, 3). Недавние исследования показали, что IL-18 экспрессирован на участках активности хронических Th1 воспалительных болезней, таких как болезнь Крона (4, 5) и ревматоидный артрит (6). IL-18 стимулирует производство цитокинов NK клетками и T-клетками при лепре (7). Увеличенные циркулирующие уровни IL-18 коррелируют с увеличенными уровнями IFN-gamma при туберкулезе (8).

IL-12 и IL-18 важные цитокины для Th1 иммунного ответа, так как в синергизме стимулируют производство IFN-gamma (9, 10, 11) и увеличивают цитотоксичность NK и T-клеток (12, 13). Кроме того, IL-12 стимулирует дифференцирование предшественников Т-клеток (Th0 клетки) в Th1 клетки (14). IL-12 и IL-18 играют важную роль в устойчивости к инфекциям, внутриклеточным паразитами и бактериям и при некоторых аутоиммуннных и злокачественных болезнях (2, 3, 15).

Саркоидоз - системная болезнь неизвестной этиологии, которая характеризована формированием неказеозных эпителиоидно-клеточных гранулем с доминирующей инфильтрацией CD4+ клетками и макрофагами (16). Многие цитокины и хемокины играют важную роль при формировании саркоидной гранулемы (17). На основании Th1/Th2 парадигмы, при активном саркоидозе доминирует Th1 профиль цитокинов (17, 18, 19). Недавние исследования продемонстрировали увеличенную экспрессию IL-12 (20, 21, 22) и IL-12R (23, 24) в легких при саркоидозе. Экспрессия IL-18 увеличена у респираторных эпителиоцитов (25). Однако, роль IL-12 и IL-18 при в Th1 ответе при саркоидозе полностью не известна.

Мы исследовали местное производство IL-12 и IL-18 у пациентов с саркоидозом и его влияние на Th1 ответ, связанный с производством IFN-gamma при легочном саркоидозе.

Пациенты

Диагноз саркоидоз был установлен у 58 индивидуумов (23 мужчины, средний возраст 26.0 лет и 35 женщин средний возраст 47.2 лет); 36 некурящих и 22 курящих). Все пациенты имели гистологическое подтверждение саркоидоза без признаков микобактериальной, грибковой или иной инфекции. Ни один пациент не имел истории воздействия органических или неорганических материалов, способных вызывать гранулематозные болезни легкого. Ни один пациент не получал кортикостероидную терапию во время исследования. 48 пациентов имели патологию рентгенограммы легких; 36 пациентов имели только внутригрудную лимфаденопатию, 11 пациентов имели внутригрудную лимфаденопатию и интерстициальные инфильтраты и 1 пациент имел только интерстициальные инфильтраты. 10 пациентов не имели патологии рентгенограммы, но имели положительные результаты биопсии легкого и увеит и, таким образом, имели подозреваемый саркоидоз. Оценка активности болезни включала клинические особенности, рентгенограмму легких, КТВР, тесты функции легкого, бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ), сцинтиграфию с галлием 67 и исследования крови. Экспертиза показала 35 внелегочных повреждений (27 - увеит, 6 - кожа, 1 - кость и 1 - околоушная железа) у 28 пациентов. 5 пациентов имели 2 внелегочных повреждения, 1 пациент имел 3 внелегочных повреждения.

В группу контроля вошли 23 здоровых индивидуума (13 мужчин и 10 женщин: средний возраст 34.8 года). 13 не курили, 10 курили. Группа контроля не имела легочных болезней в медицинской истории. Не имелось рентгенологических ненормальностей, физикальная экспертиза и функция легкого были в пределах нормы. Информированное согласие было получено у пациентов с саркоидозом и группы контроля.

Результаты

Уровни IL-12 и IL-18 в БАЛ

Мы измерили уровни IL-12 p70, IL-12 (p40 и p70) и IL-18 в БАЛ, используя ELISA. Когда уровни IL-12 (p40 и p70) были сравнены между некурящими и курящими, курящие пациенты с саркоидозом и курящие в группе контроля имели значительно более низкие уровни IL-12 (p40 и p70) в БАЛ чем некурящие пациенты с саркоидозом (p < 0.0001) и некурящие в группе контроля (p = 0.0008), соответственно. Некурящие и курящие пациенты с саркоидозом имели значительно увеличенные уровни IL-12 (p40 и p70) в БАЛ по сравнению с некурящими (p < 0.0001) и курящими (p = 0.0012) в группе контроля, соответственно.

Не имелось никаких значительных различий в уровнях IL-18 в БАЛ между некурящими и курящими в группе контроля или у пациентов с саркоидозом. Некурящие и курящие пациенты с саркоидозом имели значительно увеличенные уровни IL-18 в БАЛ по сравнению с некурящими (p < 0.0001) и курящими (p = 0.0131) в группе контроля, соответственно. Пациенты с саркоидозом имели значительно увеличенные уровни IL-12 (p40 и p70) и IL-18 в БАЛ по сравнению группой контроля.

Иммуногистохимический анализ IL-12 и IL-18

В здоровых легких было обнаружено очень слабое положительное окрашивание IL-12 и IL-18. Только некоторые альвеолярные макрофаги имели слабо окрашивались для IL-12 и IL-18. Напротив, сильное положительное окрашивание IL-12 p70 и IL-18 было обнаружено в эпителиоидных клетках гранулем и альвеолярных макрофагах в интерстиции, особенно в цитоплазме. Гигантские клетки также положительно окрашивались для IL-12 p70 и IL-18. Лимфоциты и фибробласты вокруг гранулем не окрашивались.

IFN-gamma, IL-12, экспрессия мРНК IL-18 и их производство культурами клеток БАЛ

Недавно изолированные клетки БАЛ экспрессировали мРНК IL-18, но не IFN-gamma, IL-12 p40 или мРНК IL-12 p35. IFN-gamma и экспрессия мРНК IL-12 p40 наблюдались через 4 и 48 часов после начальной стимуляции культуры клеток LPS. Экспрессия мРНК IL-12 p35 наблюдалась через 4 часа после стимуляции LPS. Экспрессия мРНК IL-18 также наблюдалась через 4 и 48 часов после начальной стимуляции культуры клеток LPS. Экспрессия мРНК IL-18 наблюдалась у клеток БАЛ, недавно изолированных в группе контроля и наблюдалась через 4 и 48 после начальной стимуляции культуры клеток LPS.

Спонтанное производство IFN-gamma и IL-18 наблюдалось и у пациентов с саркоидозом и в группе контроля, принимая во внимание, что спонтанное производство IL-12 p70 было обнаружено только в 5 случаях саркоидоза и у одного индивидуума группы контроля. Имелась значительная положительная корреляция между спонтанным производством IFN-gamma и IL-18 нестимулированными клетками БАЛ в случаях саркоидоза, но не в группе контроля.

Стимуляция LPS индуцировала производство IFN-gamma, IL-12 p70 и IL-18 клетками БАЛ пациентов с саркоидозом, принимая во внимание, стимуляция LPS индуцировала только производство IL-12 p70 (p = 0.06) клетками БАЛ группы контроля, но не производство IFN-gamma или IL-18. Сравнение индукции цитокинов при стимуляции LPS у пациентов с саркоидозом и в группе контроля показало, что случаи саркоидоза имели значительно более высокое производство IFN-gamma чем в группе контроля (p < 0.0001). Не имелось никаких значительных различий в индукции IL-12 p70 или IL-18 при стимуляции LPS клеток БАЛ пациентов с саркоидозом и группы контроля. Имелась значительная положительная корреляция между производством IFN-gamma и IL-12 p70 LPS-стимулированными клетками БАЛ в случаях саркоидоза, но не в группе контроля.

Влияние нейтрализации IL-12- и IL-18 на производство IFN-gamma клетками БАЛ

LPS-стимулированные саркоидные клетки БАЛ производили значительно более высокий уровень IFN-gamma (578±219 pg/ml) чем группа контроля (67.3±30.1 pg/ml). Anti-IL-12 или Anti-IL-18 антитела уменьшали производство IFN-gamma LPS-стимулированными клетками БАЛ у 13 пациентов с саркоидозом (процент ингибирования: anti-IL-12 30.0±5.1%; anti-IL-18 39.8±6.4 %) и 5 индивидуумов группы контроля (процент ингибирования: anti-IL-12, 37.2±7.8 %; anti-IL-18 44.4±11.2 %). При совместном использовании Anti-IL-12 и Anti-IL-18, производство IFN-gamma клетками БАЛ сильно уменьшилось у пациентов с саркоидозом (процент ингибирования 58.5±5.6 %) и в группе контроля (процент ингибирования 78.0±4.7 %). Ингибирование Anti-IL-12- и/или Anti-IL-18 было статистически значимым во всех случаях саркоидоза (p < 0.05). Кроме того, экспрессия мРНК IFN-gamma была уменьшена, когда LPS-стимулированные саркоидные клетки БАЛ были обработаны Anti-IL-12- и Anti-IL-18. Эти результаты указывают, что IL-12 и IL-18 являются мощными стимуляторами производства IFN-gamma при саркоидозе.

Влияние rIL-12 и/или rIL-18 на производство IFN-gamma клетками БАЛ

Мы исследовали производство IFN-gamma при стимуляции rIL-12 и/или rIL-18 в 3 случаях саркоидоза и у 3 индивидуумов группы контроля. При стимуляции только rIL-12, уровни IFN-gamma были очень низкими у пациентов с саркоидозом и в группе контроля, принимая во внимание, что при стимуляции только rIL-18, он производил дозозависимую индукцию производства IFN-gamma в 2 случаях саркоидоза и у 1 индивидуума группы контроля. При параллельным применении обоих рекомбинантов, наблюдалась дозозависимая индукция производства IFN-gamma. При стимуляции rIL-12 и rIL-18, саркоидные клетки БАЛ демонстрировали большее производство IFN-gamma по сравнению с клетками БАЛ группы контроля. Однако, дальнейшая стимуляция не производила увеличения производства IFN-gamma во всех случаях. Рекомбинантые IL-12 и IL-18 синергистически стимулировали производство IFN-gamma клетками БАЛ пациентов с саркоидозом и группы контроля.

Обсуждение

В настоящем исследовании мы продемонстрировали, что уровни IL-12 (p40 и p70) и IL-18 увеличены в БАЛ пациентов с саркоидозом. Однако, мы не смогли обнаружить IL-12 p70 в сконцентрированном в 10 раз БАЛ в исследованных случаях саркоидоза, хотя IL-12 p70 был обнаружен с помощью иммуногистохимического окрашивания в эпителиоидных клетках и макрофагах. Концентрирование и последующее замораживание и размораживание могут делать точное измерение уровней IL-12 p70 невозможным (20). Уровни IL-12 (p40 и p70) в БАЛ были значительно ниже у курящих, чем у некурящих, в то время как курение не влияло на уровни IL-18 в БАЛ. Курение влияет на производство цитокинов альвеолярными макрофагами (27, 28), поэтому, при исследовании клеток БАЛ, мы использовали только некурящих индивидуумов. Кроме того, известно, что клетки БАЛ только косвенно отражают гранулематозные события при активном саркоидозе (16, 17, 18, 21, 22). Исследование продемонстрировало интенсивную экспрессию IL-12 p70 и IL-18 в легких при саркоидозе.

Экспрессия мРНК IL-18 наблюдалась у недавно изолированных клеток БАЛ пациентов с саркоидозом и группы контроля, хотя экспрессия мРНК IFN-gamma и IL-12 наблюдались только после стимуляции LPS клеток БАЛ пациентов с саркоидозом. мРНК IL-18 была обнаружена в различных органах и клетках (2, 13, 30). Легкие постоянно стимулируются различными экзогенными стимулами. IL-18 может постоянно производиться в легких, даже если вирулентные патогены не воздействуют на респираторный тракт. Исследование продемонстрировало, что производство IL-18 индуцируется при стимуляции LPS саркоидных клеток БАЛ, в то время как у клеток БАЛ группы контроля наблюдалась очень слабая индукция IL-18. LPS активизирует каспазу-1 у моноцитов периферической крови и линии клеток THP-1 (31). Каспаза -1 у альвеолярных макрофагов также может быть активизирована при стимуляции LPS, приводя к слабому увеличению секреции IL-18 у здоровых индивидуумов. Tsutsui (32) сообщил, что секреция IL-18 заметно увеличивалась при стимуляции LPS в Propionibacterium acnes модели повреждения печени. Альвеолярные макрофаги при саркоидозе активизированы неизвестными стимулами. Активация альвеолярных макрофагов может быть ключом, для объяснения значительной индукции IL-18 при LPS стимуляции клетотк БАЛ пациентов с саркоидозом.

Случаи саркоидоза показывали большую индукцию IFN-gamma и IL-12 p70 клетками БАЛ при LPS стимуляции, чем группа контроля. В отношении производства IL-12 антигенпрезентирующими клетками (APC), важна не только стимуляция LPS, но также и взаимодействие между CD40 и CD40 лигандом (33). Значительно увеличенная экспрессия CD40 наблюдалась у альвеолярных макрофагов пациентов с саркоидозом по сравнению с альвеолярными макрофагами группы контроля (34). Взаимодействие CD40 и CD40 лиганда может быть ключом к увеличению индукции IL-12 p70 у саркоидных клеток БАЛ по сравнению с группой контроля. T-клетки БАЛ пациентов с саркоидозом имели увеличенную экспрессию IL-12beta2R (22) и большинство T-клеток БАЛ дифференцировались в Th1 клетки (24). Экспрессия IL-18R у Th1 клеток также была увеличена (35). При совместном использовании rIL-12 и rIL-18, клетки БАЛ пациентов с саркоидозом, показали заметно большее производство IFN-gamma чем клетки БАЛ группы контроля. Большая индукция IFN-gamma может быть объяснена увеличением экспрессии IL-12beta2R и IL-18R клеток БАЛ пациентов с саркоидозом.

Anti-IL-12- и Anti-IL-18 заметно уменьшали производство IFN-gamma LPS-стимулированными клетками БАЛ у пациентов с саркоидозом (58.5 %) и в группе контроля (78.0 %). Результаты показали, что совместное использование Anti-IL-12- и Anti-IL-18, полностью не ингибировали производство IFN-gamma у пациентов с саркоидозом. Yang (36) сообщил о двух регулирующих механизмах производства IFN-gamma: механизм, связанный с Т-клеточными рецепторами (ТКР) и костимулирующий механизм, связанный с IL-12 и IL-18. В легких пациентов с саркоидозом, T-клетки могли быть активизированы неизвестными стимулами и различными факторами внешней среды. Производство IFN-gamma активизированными T-клетками происходит спонтанно, даже если влияние IL-12 и IL-18 отсутствует. TNF-alpha и IL-1beta, произведенные LPS-стимулированными альвеолярными макрофагами, также функционируют как слабые индукторы IFN-gamma.

При стимуляции клеток БАЛ rIL-12 и rIL-18, производство IFN-gamma дозозависимо увеличивалось и затем достигало насыщения, хотя концентрации rIL-12 и rIL-18 отличались у различных пациентов. Подобные результаты наблюдались у Th1 клеток PBMC и IL-12-отзывчивых клонов T-клеток (9, 38). Молекулярные механизмы явления насыщения должны быть исследованы.

Мы обнаружили, что уровни IL-12 и IL-18 увеличены у пациентов с саркоидозом. LPS-стимулированные клетки БАЛ пациентов с саркоидозом демонстрировали большую индукцию IFN-gamma, IL-12 и IL-18 чем LPS-стимулированными клетки БАЛ группы контроля. IL-12 и IL-18 могут быть ключевыми цитокинами Th1 ответе при легочном саркоидозе.