The Journal of Immunology, 2000, 165: 4718-4724.

Роль IL-18 в активации CD4+ Т-лимфоцитов при саркоидозе

Catherine M. Greene, Gerard Meachery, Clifford C. Taggart, Cyril P. Rooney, Raymond Coakley, Shane J. O’Neill and Noel G. McElvaney
Department of Respiratory Research, Royal College of Surgeons in Ireland, Beaumont Hospital, Dublin, Ireland

Реферат

Саркоидоз - гранулематозная болезнь неизвестной этиологии, связанная с экспансией активизированных CD4+ Т-лимфоцитов, производящих IL-2. Многие факторы, включая недавно описанный IL-18, участвуют в экспрессии IL-2 in vitro. Мы исследовали роль IL-18 в экспрессии IL-2 при саркоидозе. Были исследованы 18 пациентов с саркоидозом и 15 индивидуумов в группе контроля. Экспрессия IL-18R и концентрация IL-18 в ЖБАЛ была значительно увеличена в группе пациентов с саркоидозом (p = 0.0143 и 0.0024, соответственно). AP1 и NF-kappa B, факторы транскрипции, которые регулируют экспрессию гена IL-2, были активизированы in vivo у саркоидных легочных CD4+ Т-лимфоцитов. Активность факторов транскрипции не была обнаружена у легочных CD4+ Т-лимфоцитов в группе контроля или CD4+ Т-лимфоцитов периферической крови у пациентов с саркоидозом, что является еще одним доказательством компартментализации воспалительного процесса при саркоидозе. Мы исследовали влияние IL-18 на AP1 и NF-kappa B у T-клеток линии Jurkat in vitro. Это влияние оказалось дозо- и время- зависимым. Исследование активации факторов транскрипции и экспрессии гена IL-2 у T-клеток линии Jurkat показала, что саркоидная ЖБАЛ, но не ЖБАЛ группы контроля, активизировала AP1 и NF-kappa B, вызвала транскрипцию гена IL-2 и увеличение производства IL-2. Добавление IL-18 к нормальной ЖБАЛ также вызвало аккумуляцию мРНК IL-2. Эти данные указывают на участие IL-18 в патогенезе саркоидоза посредством активации AP1 и NF-kappa B, что ведет к увеличению экспрессии гена IL-2, увеличению производства IL-2 и сопутствующей активации T-клеток.

Введение

Хотя этиология саркоидоза остается неизвестной, текущее понимание его патогенеза заключается в том, что болезнь возникает при воздействии на наследственно восприимчивого хозяина специфических факторов внешней среды (1). Болезнь происходит у людей всех рас и обоих полов, однако, склонность к саркоидозу наблюдается у индивидуумов некоторых этнических и расовых групп и лиц моложе 40 лет (1, 2). По разным оценкам, заболеваемость саркоидозом в США составляет 0.85 и 2.4 % для белых и чернокожих, соответственно (3). Семейная группировка болезни указывет, что генетические факторы могут быть важными факторами риска саркоидоза (4, 5). В частности индивидуумы со специфическими генотипами HLA-DR, имеют более высокий риск развити болезни (6, 7, 8, 9, 10). До настоящего времени, многочисленные факторы внешней среды, включая инфекционные организмы и неинфекционные агенты окружающей среды были предложены как потенциальные этиологические факторы, ответственные за саркоидоз; однако, причинный агент все же пока не идентифицирован (11, 12, 13, 14, 15, 16).

Патологический признак саркоидоза - неказеозные гранулемы. Повреждения могут развиваться во многих органах, однако, 90 % пациентов имеет легочные проявления (17, 18). Это состояние характеризовано накоплением и экспансией в вовлеченных органах Th1 лимфоцитов, преимущественно с CD4+ фенотипом, которые производят IL-2 и IFN-gamma (19, 20, 21, 22). Иммунологические события, связанные с легочным саркоидозом, вероятно, являются следствием формирования этого пула CD4+ Т-лимфоцитов (19, 23, 24, 25).

Недавно было установлено, что цитокин IL-18 играет важную роль в Th1 ответе (26, 27, 28). IL-18 производится моноцитами/макрофагами (29). Транскрипция IL-18 также была обнаружена у различных типов клеток, включая фибробласты, T- и B-клетки а также клетки эпителия дыхательных путей (27, 30, 31). IL-18 экспрессируется как процитокин и затем подвергается внутриклеточному дроблению каспазой-1 к биологически активной форме (32, 33, 34, 35). С помощью иммуноцитохимического исследования недавно было показано, что столбчатые эпителиоциты дыхательных путей имеют более высокую экспрессию IL-18 при саркоидозе, чем при астме (31). Однако, имеет ли IL-18 биологическую активность, определено не было.

Была объяснена роль IL-18 в увеличении производства IFN-gamma Т-лимфоцитами. IL-18 вместе с IL-12 синергистически влияют на увеличение производства IFN-gamma (36, 37). IL-18 может независимо от IL-12 слабо стимулировать производство IFN-gamma. Однако, более мощная экспрессия IFN-gamma происходит в присутствии IL-12 (38). Анализ путей, посредством которых IL-18 может стимулировать транскрипционную активность IFN-gamma у первичных CD4+ T клеток показал, что IL-18 может стимулировать активность IFN-gamma посредством активации AP1 (38). IL-18 также увеличивает пролиферацию T-клеток in vivo при участии IL-2 (29, 39).

В этой работе мы исследовали роль IL-18 в регулировании экспрессии IL-2 и активации T-клеток при легочном саркоидозе и показали, что более высокие уровни IL-18 и его рецепторов присутствуют в легких пациентов с саркоидозом. Мы исследовали влияние IL-18 на активацию факторов транскрипции, которые регулируют экспрессию гена IL-2 и определили, какое влияние IL-18 имеет на экспрессию гена IL-2 у T-клеток ЖБАЛ. Наши наблюдения указывают на участие IL-18 в патогенезе легочного саркоидоза и идентифицируют его как важный фактор, регулирующий экспрессию гена IL-2, возможно посредством модуляции активности факторов транскрипции.

Пациенты

В настоящем исследовании участвовали 18 недавно диагностированных, нелеченных пациентов с доказанным биопсией саркоидозом стадии I или II и 15 индивидуумов в группе контроля (мужины/женщины = 9/9 и 9/6; средний возраст 39.3 ± 2.4 и 56.5 ± 3.7 для пациентов и группы контроля, соответственно). Результаты исследований функции легких для пациентов с саркоидозом и группы контроля значительно не отличались (объем форсированного выдоха за 1 с (FEV1) 86 ± 8 и 89 ± 6; FEV1/ FVC 77 ± 9 и 74 ± 12; DLco 72 ± 13 и 79 ± 10, соответственно). ЖБАЛ группы контроля и группы пациентов содержал 2.09x10⁵ и 5.9x10⁵ клеток/мл, соответственно.

Результаты

Уровни Th1 цитокинов и IL-18 в нормальной и саркоидной ЖБАЛ

В саркоидной ЖБАЛ наблюдалось более высокое отношение лимфоциты/макрофаги, чем в ЖБАЛ группы контроля (1:5 против 1:15), что совместимо с экспансией CD4+ Т-лимфоцитов в легких. Уровни IL-2 в ЖБАЛ были значительно увеличены при саркоидозе по сравнению с группой контроля, 2717 ± 1130 против 1319 ± 561 pM, соответственно (p = 0.0211). Кроме IL-2, в группе пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля также были значительно увеличены уровни IL-12 p40 и уровни IFN-gamma (24, 44, 45). Средние уровни обоих цитокинов были в 3 раза выше в саркоидной ЖБАЛ: 331 ± 112 pM и 99 ± 20 pM (p = 0.0013) для IL-12p40 и 6302 ± 2682 pM и 1891 ± 1298 pM (p = 0.025) для IFN-gamma, соответственно.

Уровни IL-18 в саркоидной ЖБАЛ (5301 ± 2148 pM) были значительно выше чем в группе контроля (816 ± 650 pM ЖБАЛ, p = 0.0024) и индивидуумов с воспалительными болезнями (536 ± 96 pM / ЖБАЛ, p = 0.0416). Наблюдалась положительная корреляция между уровнями IL-2 и IL-18 в саркоидной ЖБАЛ (r = 0.8984, p < 0.0001). Не имелось различия в уровнях каспазы-1 в ЖБАЛ у индивидуумов с саркоидозом и в группе контроля.

Экспрессия IL-18R у T-клеток линии Jurkat, периферической крови и CD4+ T-лимфоцитов ЖБАЛ

Проточная цитометрия, с использованием меченных радиоизотопами антител к IL-18R или IgG1 показала, что T-клетки линии Jurkat селективно экспрессируют IL-18R. CD4 + T-клетки периферической крови слабо экспрессировали IL-18R. Стимуляция IL-12 увеличивала экспрессию IL-18R у этих клеток. Саркоидные CD4+ T-клетки ЖБАЛ имели значительно большую экспрессию IL-18R по сравнению с группой контроля (p = 0.0143) и индивидуумов с воспалительными болезнями (p = 0.0286).

AP1

Активация IL-18 in vitro

Промотор гена IL-2 гена имеет участки, чувствительные для многих факторов транскрипции, включая NF-AT и NFkappaB; однако сцепление с AP1 является необходимым для экспрессии IL-2 (46). Активизация IL-18 AP1 у T-клеток линии Jurkat является дозо- и время- зависимой, с оптимальной активацией при 30 ng/ml IL-18 в течение 2 часов. IL-18 не влиял на активацию NF-AT у T-клеток линии Jurkat.

Активация in vivo легочных CD4 + Т-лимфоцитов, но не лимфоцитов периферической крови при саркоидозе

Активные комплексы AP1 присутствовали в ядрах саркоидных CD4+ Т-лимфоцитов, изолированных из ЖБАЛ. Уровни IL-18 в саркоидной ЖБАЛ составляли 5301 ± 2148 pM что соответствует 10.7 ± 4.3 ng/ml и является физиологически релевантной концентрацией. Напротив, активность AP1 не была обнаружена у Т-лимфоцитов периферической крови, изолированных у тех же самых индивидуумов, что предполагает ответ, локализованный в легких.

NF-kappa B

Активация IL-18 in vitro

Эксперименты по исследованию влияния факторов времени и дозы IL-18 на активацию NF-kappa B у T-клеток линии Jurkat, подтвердили предыдущие сообщения, что оптимальная активация достигается в течение 30 минут при концентрации IL-18 30 ng/ml (47, 48, 49, 50, 51).

Активация in vivo легочных CD4+ Т-лимфоцитов

Исследование активности NF-kappa B у саркоидных легочных CD4+ Т-лимфоцитов покаказало, что NF-kappa B был активизирован и ограничен ядром этих клеток. Соответственно, подобные эксперименты с нормальными CD4+ T-клетками ЖБАЛ не смогли обнаружить активность NF-kappa B в ядерных экстрактах.

Влияние IL-18 в ЖБАЛ на активацию факторов транскрипции

Стимуляция T-клеток линии Jurkat 10 µl саркоидного ЖБАЛ в течение 2 часов, активизировала AP1. Устанение IL-18 из саркоидного ЖБАЛ, используя нейтрализацию с помощью Anti-IL-18 и иммунопреципитацию, аннулировало этот эффект. Точно так же, NF-kappa B был активизирован саркоидным ЖБАЛ, после стимуляции в течение 30 минут. Однако, нормальный ЖБАЛ или саркоидный ЖБАЛ, в котором IL-18 был нейтрализован, не мог стимулировать активацию NF-kappa B.

Влияние IL-18 на экспрессию гена IL-2 и производство IL-2

IL-18 вызвал экспрессию гена IL-2 у активизированных T-клеток линии Jurkat. Также IL-18 мог усиливать индуцированное PMA/A23187 производство IL-2 T-клетками линии Jurkat (2047 ± 63 против 1502 ± 23 pg/ml IL-2, соответственно). Инкубация T-клеток линии Jurkat с нормальным ЖБАЛ не имела никакого влияния на аккумуляцию мРНК IL-2 без добавления экзогенного IL-18. Напротив, саркоидный ЖБАЛ активизировал аккумуляцию мРНК IL-2, причем этот эффект аннулировался при устранении IL-18 из саркоидного ЖБАЛ при нейтрализации Anti-IL-18 и иммунопреципитации. Подобно этому, концентрации IL-2, произведенные клетками, культивированными с нормальным ЖБАЛ или саркоидным ЖБАЛ, очищенным от IL-18, были на 66±4.3 % меньше чем концентрации IL-2, произведенные в ответ на стимуляцию саркоидным ЖБАЛ.

Обсуждение

Результаты исследования показали, что IL-18 имеет важную роль при регулировании экспрессии IL-2 у легочных CD4+ Т-лимфоцитов при саркоидозе. Концентрация IL-18 в ЖБАЛ и экспрессия IL-18R были значительно выше у индивидуумов с саркоидозом. Факторы транскрипции AP1 и NF-kappa B были активны in vivo у саркоидных CD4+ Т-лимфоцитов. Этот сценарий был воспроизведен in vitro при возбуждении T-клеток линии Jurkat IL-18 или саркоидной ЖБАЛ. Саркоидная, но не нормальная ЖБАЛ, также вызвала активацию IL-2 у стимулированных CD3 T-клеток линии Jurkat. Удаление IL-18 из саркоидного ЖБАЛ аннулировало этот эффект. Кроме того, добавление IL-18 в нормальную ЖБАЛ, вызвало аккумуляцию мРНК IL-2. Провоспалительная роль IL-18 в саркоидной ЖБАЛ демонстрировалась увеличением производства IL-2 по сравнению с нормальной ЖБАЛ или очищенной от IL-18 саркоидной ЖБАЛ. Эти результаты говорят о важной роли IL-18 в увеличении экспрессии гена IL-2 и, таким образом, в патогенезе саркоидоза посредством регулирования активности факторов транскрипции.

Саркоидоз - хроническая гранулематозная болезнь неизвестной этиологии. Эта мультисистемная болезнь чаще всего воздействует на легкие и лимфатическую систему, а также на другие органы, включая печень, селезенку, слюнные железы, сердце, нервную систему, мышцы, кости (2, 52). Характерные для саркоидоза неказеозные гранулемы состоят из лимфоцитов, эпителиоидных клеток и гигантских клеток. Кроме формирования гранулем, легочный саркоидоз характеризован экспансией Th1 клеток в легких из-за перераспределения клеток из периферической крови (19, 20, 21, 22). Этот лимфоцитоз происходит при участии цитокинов, которые увеличивают интраальвеолярный пул CD4+ T-клеток на участке воспаления (25, 53, 54). In situ, пролиферация, индуцированная IL-2, вносит дальнейший вклад в накопление CD4+ T-клеток на участках формирования гранулем (19, 25, 55). Было сделано много предположений относительно того, какие факторы являются ответственными за увеличенную экспрессию IL-2 у этих CD4+ T клеток. Однако, иммунологический паттерн клеток в саркоидных инфильтратах говорит, что слабо деградирующий, персистирующий антигенный стимул мог бы быть ответственен за индукцию провоспалительных медиаторов и цитокинов в легком, приводя к острому и часто хроническому Th1 воспалительному ответу, который характеризован увеличенными уровнями IL-2 и IFN-gamma.

IL-18 играет важную роль в Th1 ответе (26, 27, 28). Хотя IL-18 производится моноцитами/макрофагами (29), транскрипты IL-18 также были обнаружены у других типов клеток, включая клетки эпителия дыхательных путей (27, 30, 31). Иммунореактивность к IL-18 присутствует у столбчатых эпителиоцитов дыхательных путей (31), обеспечивая другой потенциальный источник IL-18 в ЖБАЛ при саркоидозе. Хотя эти данные позволяют предположить важную роль IL-18 в патогенезе саркоидоза, также возможно, что IL-18 с его провоспалительными свойствами, может играть определенную роль при других хронических легочных болезнях. В отличие от IL-18, уровни каспазы-1 в саркоидной ЖБАЛ в этом исследовании не были увеличены. Однако, это не обязательно отражает внутриклеточные концентрации каспазы-1 у альвеолярных макрофагов.

Синергистическое действие IL-12 и IL-18 увеличивает производство IFN-gamma (36, 37, 38). Кроме IL-18, в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом также были значительно увеличены уровни IL-12 и IFN-gamma, что поддерживает эту теорию и подтверждает предыдущие результаты (24, 44, 45). IL-12, произведенный антигенпрезентирующими клетками (APCs), стимулирует экспрессию IL-18R, таким образом делая клетки IL-18-реактивными. Мы продемонстрировали этот эффект, стимулируя CD4+ Т-лимфоциты, изолированные из периферической крови, с помощью IL-12.

Мы показали, что IL-18 может стимулировать производство IL-2 Ag- или Anti-CD3-стимулированными T-клетками in vitro. Интересно, что эти стимулы были неспособны увеличивать реактивность к IL-18 у CD4+ Т-лимфоцитов периферической крови (38). В нашем исследовании, T-клетки линии Jurkat экспрессировали IL-18R и поэтому были IL-18-реактивными. Это ясно показало их способность активизировать AP1 и NF-kappa B, стимулировать аккумуляцию мРНК IL-2 и увеличивать производство IL-2 в ответ на IL-18. Мы впервые показали, что экспрессия IL-18R была значительно выше у саркоидных CD4+ T-клеток ЖБАЛ чем в группе контроля (у здоровых индивидуумов и лиц с другими воспалительными болезнями). Это говорит о том, что in vivo при саркоидозе экспрессия IL-18R у активизированных легочных CD4+ Т-лимфоцитов вероятно регулируются IL-12, что отражается увеличенными уровнями IL-12 в ЖБАЛ.

Была показана важность фактора транскрипции NF-kappa B в регулировании экспрессии гена IL-2 (39, 46, 57). NF-kappa B активизирутся различными провоспалительными стимулами и недавние исследования идентифицировали способность активации NF-kappa B, как одно из свойств IL-18 (31, 32). Это исследование - первый отчет, показывающий роль IL-18 в активации NF-kappa B и AP1 и экспрессии гена IL- 2 при саркоидозе. Мы показали, что активизация NF-kappa B была ограничена группой пациентов с саркоидозом и не присутствовала у CD4+ Т-лимфоцитов ЖБАЛ группы контроля. Исследование также показало, что AP1 был активизирован у саркоидных CD4+ Т-лимфоцитов ЖБАЛ, но не в периферической крови, что, возможно, является ответом на провоспалительный стимул, возможно IL-18.

Терапия при саркоидозе нацелена на подавление воспалительного ответа, уменьшение поражения вовлеченного органа гранулемами и предотвращение развития фиброза. Из-за способности кортикостероидов уменьшать воспалительный ответ, считается, что они способны замедлять прогресс фиброза. Стероиды регулируют экспрессию воспалительных генов посредством ингибирования активности NF-kappa B. Связь IL-18 с NF-kappa B (30) делает его потенциальной мишенью для этих лекарственных средств. Терапия, основанная на модуляции цепи событий, ведущих к активизации IL-18, может иметь потенциал для лечения саркоидоза. Однако, чтобы оценить значение увеличенных уровней IL-18 в ЖБАЛ, требуются дополнительные исследования. Возможно, что CD4+ лимфоцитоз - хороший прогностический индикатор при легочном саркоидозе. Наши данные показывают, что экспрессия IL-2, как составная часть лимфоцитоза, регулируется IL-18, таким образом предполагая, что высокие уровни IL-18 не обязательно наносят вред. Индуцирование этого типа острого воспалительного ответа, фактически в некоторых случаях может ускорять разрешение болезни.

Представленные результаты позволяют считать IL-18 важным компонентом регулирования транскрипции гена IL-2 при легочном саркоидозе. Одной из главных проблем саркоидоза является идиопатический характер этой болезни. В отсутствии такой информации, важно идентифицировать пути, по которым происходит пролиферация и активация лимфоцитов и селективно модулировать эти события.