Clinics in Chest Medicine Volume 18 Number 4 December 1997

Иммунология саркоидоза

Yash P. Kataria, MD John F. Holter, MD
From the Section of Pulmonary and Critical Care Medicine, Department of Medicine, East Carolina University School of Medicine, Greenville, North Carolina

Саркоидоз - мультисистемная гранулематозная болезнь, была описана Джонатаном Хатчинсоном в 1878 г. [63]. Ранее, другие исследователи описали разнообразные синдромы, но не смогли понять их общее происхождение. В 1899 г. Цезарь Бек [6] идентифицировал общий признак этих синдромов, и заявил, что гранулематозное воспаление является признаком саркоидоза. Он не обнаружил никаких микроорганизмов и предположил, что причиной болезни является ''дефект кроветворения'' (''defect blood formation'') или аутоинтоксикация. В 1916 г. он наблюдал ослабление кожной реакции на туберкулин у пациентов с саркоидозом [7]. Эта работа положила начало иммунологии саркоидоза. С тех пор, понимание иммунопатогенеза саркоидоза имело значительный прогресс. Свидетельства ослабления клеточного иммунитета, отражаемого кожной анергией, сопровождается гипергаммаглобулемией, что характерно для активизации гуморального иммунитета [9] [76] [82]. Только в 1976 г. было обнаружено, что клеточный иммунитет при саркоидозе скорее гиперактивен чем ослаблен [56] [61] [75] [77] [79]. Эта находка и другие вехи в развитии иммунологии саркоидоза представлены в Таблице 1. Развитие иммунологии саркоидоза обеспечило рациональное основание для его лечения и позволило начать поиск причинного агента.

В этой статье мы рассматриваем исследования лимфоцитов периферической крови, гуморального иммунитета, клеточного иммунитета и его роли в формировании гранулем, кожную анергию и предположения о ее механизме и иммунологию кожной пробы Квейма-Зильцбаха (K-S).

Таблица 1. Вехи в иммунологии саркоидоза

Изучение in vitro лимфоцитов перифериферической крови

Ранние исследования лимфоцитов были направлены на определение механизма кожной анергии при саркоидозе. Интересно, что эти исследования значительно помогли в понимании иммунопатогенеза саркоидоза. Исследования по изучению лимфоцитов периферической крови при саркоидозе делятся на четыре группы: (1) пролиферативный ответ лимфоцитов на митогенное возбуждение; (2) пролиферация лимфоцитов в смешанных культурах; (3) спонтанная бласттрансформация лимфоцитов и производство лимфокинов; (4) изменение числа лимфоцитов в периферической крови - B-лимфоцитов, T-лимфоцитов и их субпопуляций.

Митогенное возбуждение лимфоцитов периферической крови

В большинстве исследований саркоидоза, ответ лимфоцитов периферической крови на фитогемагглютинин (PHA) оказался ослабленным [9] [40] [45] [67] [88] [107] [135] [140] [150]. Один из авторов этой публикации (Yash P. Kataria) обнаружил индуцированное PHA нарушение бласттрансформации лимфоцитов у пациентов с саркоидозом с внелегочной диссеминацией, но не у пациентов с клиническими проявлениями болезни, ограниченными легкими [80]. Поэтому, степень болезни может быть важным фактором для прогнозирования иммунологической дисфункции культивируемых лимфоцитов. Интересно, что степень нарушения бласттрансформации лимфоцитов не коррелирует с частотой кожной анергии. Некоторые исследователи сообщили о корреляции уменьшения ответа лимфоцитов на PHA с наличием активного саркоидоза [22]. Возможно, различие в результатах различных исследований ответа на PHA вызвано скорее различиями в подборе групп пациентов, чем фактическим несоответствием результатов.

Пролиферация лимфоцитов в смешанных культурах лимфоцитов

В смешанных культурах с гомологичными лимфоцитами при саркоидозе наблюдается большая частота бласттансформаций по сравнению с здоровыми индивидууами[129].

Спонтанная бласттрансформация и производство лимфокинов

В процессе изучения индуцированной PHA бласттрансформации, в 8-дневных культурах было обнаружено явление спонтанной морфологической бласттрансформации [45] [74] [77] [80] [129]. Возможные стимулирующие факторы: антимикробные агенты, гетерологичные белки (белки культуральных сред) или невозможность различить бласты и большие макробактериофаги, были исключены как причинные факторы [80]. Это важное физиологическое явление неспецифично для саркоидоза, также было описано при инфекционном мононуклеозе, вирусном гепатите, аллергических реакциях на лекарственные средства и Гонконгском гриппе [80].

Спонтанное производство растворимых факторов, которые увеличивают митогенный пролиферативный ответ нормальных T и B-клеток, было продемонстрировано в 7-дневных культурах мононуклеарных клеток периферической крови [94]. Кроме того, была обнаружена обратная корреляция между степенью ответа собственных T-клеток пациента на PHA и количеством стимулирующих факторов, произведенных мононуклеарными клетками.

Также было обнаружено, что лимфоциты при саркоидозе производят фактор торможения миграции (MIF), что, очевидно, не коррелирует с увеличением частоты спонтанной морфологической бласттрансформации или кожной анергии [77]. Вместе с тем, в исследованиях in vitro лимфоцитов периферической крови при саркоидозе, это является первым свидетельством гиперактивности клеточного иммунного ответа при саркоидозе, в отличие от кожной анергии.

T- лимфоциты периферической крови и их субпопуляции

Периферическая лимфопения и уменьшение числа T-клеток типичны для саркоидоза [19] [20] [41] [46] [76] [92] [115]. Интересно, что абсолютное число лимфоцитов не коррелирует с наличием кожной анергии [19]. Нормальное число T- лимфоцитов восстанавливается после клинического разрешения саркоидоза, естественного или после лечения кортикостероидами [21] [76].

Различные субпопуляции Т-клеток, такие как CD4+ и CD8+ имеют различные функции [68] [102] [132]. Увеличение пропорции циркулирующих суппрессорных клеток при саркоидозе неоднократно демонстрировались в различных исследованиях [68] [102] [132] [133]. Однако, фракции, изолированные по скорости оседания, показывают увеличенную активность клеток T-хелпер в периферической крови пациентов c саркоидозом [71].

Должно быть отмечено, что не только лимфоциты имеют суппрессорные функции, их также проявляют моноциты [68] [143]. Ответ лимфоцитов на PHA увеличивается, когда из препарата мононуклеарных клеток периферической крови извлекаются моноциты с помощью адгезии к стеклянной вате (glass wool) и когда производство простагландина ингибируется индометацином [35].

Фитогемагглютининовая кожная проба

Как и другие антигены, митогены, такие как фитогемагглютинин (PHA) и конканавалин-A, также активизируют T-лимфоциты периферической крови и вызывают производство лимфокинов, которые привлекают моноциты к участку введения антигена или митогена. Кожная проба с PHA использовалась, чтобы исследовать состояние клеточного иммунитета при различных заболеваниях. Нарушение ответа in vivo было обнаружено при лимфопролиферативных болезнях [162] или при врожденных дефектах клеточного иммунитета, включая тимусную дисплазию, комбинированный иммуннодефицит, синдром Незелоф и синдром Уискотта - Олдрича [5] [89] [108].

Один из авторов (Yash P. Kataria) изучал кожный ответ на PHA в группе из 17 пациентов с гистологически подтвержденным саркоидозом [78]. У 8 пациентов была обнаружена анергия к обычному набору антигенов, который используется для кожных проб. Хотя средний ответ на PHA у пациентов с кожой анергией был значительно меньше, чем в группе контроля или чем в группе без кожной анергии, все результаты были в пределах нормы. Причина сохранения ответа на PHA при саркоидозе - то, что стимулируется все T-клетки. Напротив, специфический антиген стимулирует только фракцию антиген-специфических клеток памяти, многие из которых привлекаются к удаленным участкам гранулематозного воспаления. В результате, кожная проба с PHA у пациентов с саркоидозом нормальна. Отрицательная кожная проба с PHA - свидетельство против диагноза саркоидоз.

Гуморальный иммунитет

Гипергаммаглобулинемия

Поликлональная гипергаммаглобулинемия обычна для саркоидоза. Сообщалось об увеличенных уровнях IgG и IgM у 7 из 14 пациентов [76]. У одного из пациентов также были увеличены уровни IgA. У 10 пациентов, гипергаммаглобулинемия наблюдалась менее часто: IgG и IgM были увеличены только у одного пациента, и IgA у двух пациентов. Впоследствии, при наблюдении 211 пациентов было обнаружено, что 68 % (из них 81 % чернокожих и 55 % белых) имели гипергаммаглобулинемию [82].

Острое начало саркоидоза, характеризуемое наличием узловатой эритемы, связано с увеличением уровней IgM и IgA, однако уровни IgG остаются нормальными [106]. При исчезновении узловатой эритемы, уровни IgM и IgA остаются увеличенными, но в меньшей степени, чем у пациентов с двусторонней внутригрудной лимфаденопатией без узловатой эритемы. Наоборот, пациенты с инфильтратами в легких имели увеличенные уровни более стабильного IgG, что отражается хроническим течением болезни. Хотя поликлональная гипергаммаглобулинемия имеет тенденцию сопутствовать острому течению болезни, уровни иммуноглобулинов не могут использоваться для контроля за течением болезни, так как часто изменения уровней иммуноглобулинов появляются в ответ на стимулы, не имеющие отношения к саркоидозу.

Участок избыточного производства иммуноглобулинов при саркоидозе не ясен. Лимфоциты периферической крови при саркоидозе не производят избыточный иммуноглобулин [84]. Вообще, замечено, что B-лимфоциты редко наблюдаются в бронхоальвеолярном лаваже. Кроме того, B-лимфоциты и плазматические клетки редко бывают замечены в пределах саркоидных гранулем. Hunninghake [56] обнаружил корреляцию между процентом T-лимфоцитов и процентом клеток в бронхоальвеолярном лаваже, которые секретировали IgG у пациентов с саркоидозом, но не у здоровых индивидуумов. Выделенные из легкого больного саркоидозом пациента T-лимфоциты, культивированные совместно с нормальными мононуклеарными клетками периферической крови, могли стимулировать производство иммуноглобулина этими клетками. Fazel [30] изучал средостенные лимфатические узлы и образцы тканей, полученные при открытой биопсии легкого и обнаружил большое количество поликлональных B-клеток, сгруппированных в межгранулематозных пространствах, без центральной зародышевой морфологии. Поэтому B-клетки редко обнаруживаются в бронхоальвеолярном лаваже, но при стимулировании активизированными T-хелперами, секретируют иммуноглобулин. Другая возможность состоит в том, что B-клетки в лимфоидных органах стимулируются активизированными лимфоцитами Т-хелпер, которые движутся через лимфоидные органы.

Антитела против микробных агентов

Специфический ответ на различные микробные агенты при саркоидозе сохраняется. Пациенты нормально отвечают на антигены тифа и паратифа [111]. Производство антител после иммунизации или инфекции коклюшем, свинкой, вирусом Эпштейна-Барра (EBV) нормально или увеличено. Byrne [10] исследовал 216 пациентов с саркоидозом и 92 индивидуумов в группе контроля на присутствие антител против EBV и 13 других вирусных антигенов, включая герпес, вирус цитомегалии, аденовирус, краснуху, респираторносинцитиальный вирус, корь, свинку, вирус гриппа и парагриппа. По сравнению с группой контроля, значительно более высокие титры антител у пациентов с саркоидозом были найдены к EBV, герпесу, краснухе, кори и парагриппу I, II и III. Однако, в подгруппе из 74 подобранных пар, существенным было увеличение антител только к EBV, краснухе и парагриппу III. Среди пациентов с саркоидозом, самые высокие титры наблюдались у женщин и чернокожих, но не имелось корреляции с рентгенографической стадией или активностью болезни. Kataoka [70] сообщил о высоком титре EBV антител у пациентов с саркоидозом и отметил, что степень реакции на туберкулин была обратно пропорциональна титру анти-EBV.

Аутоантитела против различных тканей

Авторы обнаружили увеличенный титр антинуклеарных антител у 24 из 100 пациентов с саркоидозом [82]. Veien [153] обнаружил антинуклеарные антитела у 32 % из 50 пациентов с саркоидозом и у 3 % в группе контроля. У 18 % пациентов были обнаружены тиреоидные эндоплазматические антитела, по сравнению с 8 % в группе контроля и 10 % имели ревматоидный фактор, по сравнению с 5 % в группе контроля. Митохондриальные антитела обнаружены не были. Elling и Faber [28] изучали 47 пациентов с саркоидозом. У 13 были найдены митохондриальные антитела и 19 имели ревматоидный фактор. Авторы не обнаружили тиреоидные антитела, антитела к париетальным клетками и коре надпочечников. Частота антинуклеарного фактора не была значительно увеличена.

Oreskes и Siltzbach [109] обнаружили ревматоидный фактор у 38 % из 64 пациентов с саркоидозом. Они коррелировали результаты с различными переменными и обнаружили, что частота обнаружения ревматоидного фактора у женщин была вдвое выше, чем у мужчин и больше у пациентов с активной болезнью и с рентгенографическими стадиями II и III. В течение 2-летнего наблюдения, исчезновение или уменьшение титра ревматоидного фактора было связано с клиническим улучшением пациентов, принимая во внимание, что первоначальное увеличение титра ревматоидного фактора было связано с продолжительной активностью болезни и значительно худшим клиническим результатом.

Daniele и Rowlands [20] обнаружили иммунореактивные антитела против донорских Т-клеток у пациентов со стадией II саркоидоза, антитела также были идентифицированы с помощью иммунофлюоресценции. Среди антител преобладал IgM, оптимально реагировавший при 4°C. Такие низкотемпературные антитела неспецифичны для саркоидоза, однако, они были описаны при вирусных болезнях, системной красной волчанке и ревматоидном артрите [100] [158]. Lobo и Suratt [93] сделали аналогичные наблюдения. Они обнаружили аутоантитела, главным образом низкотемпературный IgM. Антитела были реактивны к 21-83% аутогенных лимфоцитов, главным образом к B-лимфоцитами, но также и в различной пропорции к L (null) и T-лимфоцитам. Не была обнаружена корреляция между процентом аутогенных клеток и степенью лимфопении или способности формировать E розетки при наличии кожной анергии. Антитела становятся все более и более реактивными при прогрессе болезни и исчезают при разрешении саркоидоза. В настоящее время неясно, какую роль различные антитела играют в иммунопатогенезе саркоидоза.

Циркуляция иммунных комплексов

Циркуляция иммунных комплексов представляет другой аспект гуморального иммунитета при саркоидозе. Они вероятно ответствены за некоторые острые клинические проявления болезни - узловатую эритему или острый увеит. Были описаны положительные корреляции с активностью болезни, внелегочными проявлениями и продолжительностью болезни, а также с присутствием антител к T-лимфоцитам и увеличением уровней иммуноглобулинов или к легкой цепи иммуноглобулинов [22] [37] [69] [122] [123]. Selroos [130] использовал 5 различных методов, чтобы изучить присутствие иммунных комплексов у 33 пациентов и получил положительные результаты у всех пациентов. Он считает, что такой результат был достигнут из-за высокой чувствительности используемых методов. Некоторые методы дают положительные результаты в течение острой или ранней болезни, принимая во внимание, что другие дают положительные результаты при поздней или хронической болезни. Положительная корреляция не наблюдалась между циркуляцией иммунных комплексов и увеличением уровней ангиотензинпревращающего фермента или серологического лизоцима. Имеется общее согласие, что циркуляция иммунных комплексов имеет тенденцию исчезать при клиническом разрешении саркоидоза.

Наиболее часто при саркоидозе наблюдается IgG, хотя так же были замечены IgM и IgA [34] [42] [69] [122] [127] [130]. Антигенный компонент иммунных комплексов не был идентифицирован. Однако, маловероятно, что иммунные комплексы играют причинную роль в гранулемогенезе, так как саркоидоз - болезнь, связанная с клеточным иммунитетом, а иммунные комплексы не были обнаружены в гранулемах [83]. Однако, циркуляция иммунных комплексов оказывает определенное влияние. Было показано, что они связаны с низким числом циркулирующих клеток T-супрессор [156]. Трипсинизация клеток T-gamma восстанавливает процент клеток T-супрессор до нормы или немного выше нормального уровня. Инкубация нормальных лимфоцитов с иммунными комплексами нарушает их бластогенетический ответ на конканавалин-A.

B-лимфоциты

Авторы обнаружили, что число B-лимфоцитов в периферической крови, определенное с помощью поливалентной антисыворотки, было увеличено у пациентов с диссеминированной болезнью, но было нормальным, если признаки заболевания были ограничены грудной клеткой и функция легких была нормальной [76]. Однако, когда число B-лимфоцитов было определено с помощью рецепторов комплемента (EAC), оно оказалось нормальным во всех группах. Было предположено и позже подтверждено, что увеличение пропорции клеток, несущих поверхностные иммуноглобулины, вызвано присутствием иммуноглобулина на поверхности некоторых (T) лимфоцитов [20] [76] [92]. После полного разрешения болезни, число B-лимфоцитов возвращается к нормальному уровню [20] [76] [92].
B-лимфоциты, помещенные в культуру мононуклеарных клеток периферической крови теряют способность отвечать на митоген фитолакки - стимулятор В-лимфоцитов который обычно вызывает увеличение синтеза иммуноглобулина [84] [90]. Ослабление отклика B-лимфоцитов при саркоидозе может быть вызвано суппрессорной активностью циркулирующих моноцитов наряду с увеличенным числом клеток T-супрессор.

Клеточный иммунитет и механизм формирования саркоидной гранулемы

Механизмы формирования гранулемы инфекционными (например, туберкулез) и неинфекционными (бериллиоз) агентами имеют поразительное сходство и позволяют провести сравнительный анализ с иммунопатологией саркоидоза. Понимание механизмов образования гранулемы происходит при изучении периферической крови, клеточного состава бронхоальвеолярного лаважа и культивированых in vitro неповрежденных саркоидных кожных гранулем [75]. Фибробронхоскопия изменила диагностику и исследование саркоидоза, так как это дало средство получения клеточных элементов альвеолярного воспаления, которые хорошо коррелируют с типом и числом воспалительных клеток, обнаруженных при биопсии ткани [59] [60]. Наиболее важно, что изучение бронхоальвеолярного лаважа подтвердило, что клеточные и гуморальные процессы в паренхиме легкого разделены и не отражаются в периферической крови. Непосредственный мониторинг и контроль гранулемогенеза in vitro были выполнены с использованием неповрежденных саркоидных гранулем, полученых при биопсии кожи. Некоторые из этих наблюдений позволили сформулировать маркеры иммунологической активности саркоидоза, представленные в Таблице 2.

Таблица 2. Маркеры иммунологической активности при саркоидозе

Проявление и действие антигена

Возможно, образование гранулем начинается, когда антигенпрезентирующие клетки (APC) представляюшие собой антиген, связанный с главным комплексом тканевой совместимости (MHC) класса 2, воздействуют на вариабельные регионы T-клеточных рецепторов (ТКР) клеток памяти [2]. Однако, для усиления иммунного ответа требуется больше. Концентрация лиганд/рецептор должна быть достаточно большой, а константа диссоциации должна быть достаточно маленькой, чтобы взаимодействие Т-клеточный рецептор-антиген сохранялось достаточно долго для закрепления рецептора и лиганда в контактных областях взаимодействующих клеток.

Такое ''взаимное покрытие'' происходит, потому что первоначально устойчивый контакт клетка-клетка уменьшает свободную энергию формирования соединения для пар лиганд-рецептор [141]. Считается, что когда ТКР клетки T-хелпер связывается с родственным лигандом, он подвергается конформационной трансформации, что увеличивает его афинность к CD4 молекуле. Этот процесс облегчает мономорфную адгезию и трансдукцию сигнала между лимфоцитами CD4 и APC MHC 2. Различные независимые пары рецептор-лиганд присоединяются к молекулам партнеров, чтобы сильнее стабилизировать межклеточную адгезию. Например, межклеточная адгезия APC-лимфоцит соединяет ICAM-1-LFA-1 и LFA-3-CD2. Интерлейкин-1 и, возможно, другие регулирующие агенты, попадая в пространство межклеточного контакта, взаимодействуют с рецепторами родственных клеток.

Очевидный вопрос - насколько хорошо эта модель соответствует саркоидозу? Понимание роли антигена в иммунопатогенезе саркоидоза происходит прежде всего из двух источников исследования - антигена Квейма и бронхоальвеолярного лаважа.

Тест Квейма-Зильцбаха

Антиген Квейма-Зильцбаха (K-S) - суспензия ткани пораженной саркоидозом селезенки, при введении подкожно пациенту с саркоидозом, приводит к развитию папулы на месте введения через 3-6 недель. Гистологическое исследование показывает наличие в папуле неказеозных гранулем [85]. Cohn [17] с помощью электронной микроскопии показал, что гранулемогенный фактор препарата K-S не содержит пригодных для идентификации инфекционных агентов. Ripe [119] обнаружил, что мембранная подготовка антигена K-S делает его более мощным чем обычно и предположил, что агент реактива K-S является небольшой молекулой. Фаголизосомальный процесиннг APC, как известно, предшествует появлению антигена на клеточной мембране APC. Если процессинг гранулемогенного фактора происходит таким образом, его характер не противоречит его присутствию на лизосомах и на мембранах клеток. Антиген обычно состоит из 8-24 пептидных фрагментов аминокислот достаточно маленькой длины, чтобы находиться в расщелине (cleft) молекулы MHC класса 2 T-хелпер. Кроме того, гранулемогенный фактор антигена K-S является резистентным к протеазе [139]. Может быть произведен пассаж гранулемогенного фактора в последовательных кожных гранулематозных реакциях, при переносе от одной кожных пробы к следующей [137]. Такая устойчивость гранулемогенного фактора не противоречит предположению, что гранулематозное воспаление вызывается антигеном без клеточной стенки, который не может быть устранен другими иммунологическими средствами.

Изучение бронхоальвеолярного лаважа

При саркоидозе легких, самая ранняя обнаруженная патология - мононуклеарный альвеолит [86] [124], который характеризуется увеличением количества CD4+ лимфоцитов T-хелпер (при увеличении отношения CD4/CD8), макрофагов и моноцитов и редкими B-лимфоцитами [18] [38] [56] [58] [62] [110]. Подобное преобладание T-клеток замечено и в других вовлеченых органах [134]. Сопутствующее этому уменьшение количества T-лимфоцитов в периферической крови можно объяснять изъятием T-лимфоцитов из периферической крови гранулематозным воспалением.

Косвенным свидетельством усиления антигенной активности является увеличение процента альвеолярных макрофагов, экспрессирующих DR антигены [116] и увеличение плотности HLA-D антигенов на поверхности альвеолярных макрофагов [11] [39]. Кроме того, лимфоциты образуют розетки с макрофагами бронхоальвеолярного лаважа [152] [160] и с культивированными in vitro неповрежденными саркоидными гранулемами [75]. Возможно, это может отражать презентацию антигенных эпитопов макрофагами специфически сенсибилизированным T-лимфоцитами. Действительно, экспрессия альвеолярных макрофагов увеличивает адгезию молекул LFA-1 и ICAM-1[97].

Макрофаги в легком спонтанно производят IL-1 [54]. Существуют противоречия относительно производства IL-1 клетками бронхоальвеолярного лаважа. Это может быть вызвано прямой секрецией IL-1 в межклеточных мостиках (intercellular gap) или утечкой IL-1 из межклеточных мостиков (leakage outside the gaps). Наконец, T-клетки бронхоальвеолярного лаважа [57] [112] и культивированные in vitro неповрежденные кожные гранулемы [79] спонтанно производят IL-2. Эти результаты говорят, что воздействие с антигеном является самым важным в патогенезе саркоидоза. Весьма возможно, что каскад гранулематозных реакций при саркоидозе запускается специфическим антигенным стимулом.

Роль лимфокинов в гранулемогенезе

Последствием воздействия антигена является усиление иммунного ответа посредством пролиферации T-лимфоцитов и увеличения производства цитокинов. Конъюгация APC-лимфоцит дает сигнал для экспрессии рецепторов IL-2 на поверхности T-лимфоцитов и начала производства IL-2. Аутокринное и паракринное сцепление рецепторов IL-2 вызывает пролиферацию IL-2-чувствительных лимфоцитов. Имееются свидетельства наличия этого механизма при саркоидозе. Спонтанное производство IL-2 обнаружено in vitro при культивировании кожных саркоидных гранулем [79] и при изучении мононуклеарных клеток бронхоальвеолярного лаважа [112]. Непрерывное производство IL-2 необходимо для пролиферации лимфоцитов T-хелпер, что является основой для формирования гранулемы.

Пролиферирующие клетки T-хелпер управляют формированием гранулемы. Моноциты - основной клеточный ресурс, необходимый для постороения гранулемы. Моноциты производятся в костном мозге и находятся в кровообращении приблизительно 24 часа, в течение которых они мигрируют в различные ткани, где функционально приспосабливаются к местной среде [142] [149]. Hunninghake [61] показал, что T-лимфоциты в легком при саркоидозе спонтанно производят хемоаттраканты, специфические для моноцитов. T-лимфоциты в легком производят примерно в 25 раз больше хемотаксического фактора моноцитов (MCF), чем T-лимфоциты периферической крови. Градиент MCF заставляет моноциты накапливаться в паренхиме легкого. Авторы этой статьи изучили in vitro материалы биопсий кожных саркоидных повреждений и обнаружили повышенную активность MCF по сравнению с нормальной кожей [75].

Другой лимфокин, фактор торможения миграции (MIF), предотвращает миграцию макрофагов, находящихся на участке гранулемогенеза [77]. Кроме того, кожные саркоидные гранулемы содержат ингибитор лейкотаксиса моноцитов со свойствами, подобными ингибитору лейкотаксиса в плазме нелеченных пациентов с саркоидозом [13] [75]. Ингибитор требует активного белкового синтеза и дозозависимо подавляется гидрокортизоном. Это может иметь модуляционную роль при гранулематозном воспалении.

Моноциты становятся активизированными и дифференцируются в макрофаги, эпителиоидные клетки и гигантские клетки Лангханса [4] [146] [147]. Дальнейшее формирование структуры гранулемы, возможно, требует индукции межэпителиоидных молекул адгезии LFA-1 и ICAM-1. IFN-gamma является медиатором этого процесса и, как известно, его уровни увеличены на участках гранулематозного воспаления при саркоидозе [24] [104] [120].

Как и при других гранулематозных болезнях, продолжение гранулемогенеза требует непрерывной поставки антигена по крайней мере в волеченный орган [1] [8] [29] [155]. При саркоидозе, кожная проба K-S иллюстрирует фундаментальный принцип, что персистирование антигена поддерживает гранулемогенез у иммуночувствительных пациентов.

Роль Th1 и Th2 фенотипов при саркоидозе

Клоны CD4+ T-клеток, на основании профиля секретируемых цитокинов, могут быть разделены на два функциональных типа, называемые Th1 и Th2 [103] [121]. Th1 клетки отвечают за активацию клеточного иммунного ответа. Th1 клетки производят IL-2, IFN-gamma и фактор некроза опухоли бета. Th2 клетки являются медиаторами гуморального ответа. Th2 производят IL-4 (который стимулирует производство IgE и IgG1), IL-5, IL-10 и IL-13.

Предшественники CD4 + T-клеток (Th0 клетки), чтобы стать эффекторными клетками, активизируются с помощью процесса, который включает их взаимодействие непосредственно с APC и лимфокинами. В исследовании T-клеточных рецепторов (ТКР) у трансгенных мышей было показано, что фенотип регулируется внешними условиями активации, а не естественными ТКР. В поддержку этого утверждения, Reiner [117] проанализировал клоны специфических к Leishmania T-клеток и обнаружил идентичность последовательностей ТКР для Th1 и Th2 клонов. Развитие фенотипа Th1 требует IL-2 и IL-12 и ингибирования IL-4. IL-12, произведенный B-клетками, макрофагами и другими APCs, является мощным индуктором производства IFN-gamma, прежде всего NK клетками и T-клетками. При культивировании макрофагов с убитыми высокой температурой Listeria monocytogenes, макрофаги обычно производят увеличенное количество IFN-gamma; нейтрализация антител к IL-12 ингибирует производство IFN-gamma [52], ингибирует дифференцирование предшественников CD4+ T-клеток в Th1 клетки. Развитие фенотипа Th2 требует присутствия IL-2 и IL-4, и не происходит в отсутствии IL-4.

Moller [101] проанализировал экспрессию цитокинов в бронхоальвеолярном лаваже у пациентов с саркоидозом. Он обнаружил преобладание Th1 цитокинов и увеличенные уровни мРНК IFN-gamma и IFN-gamma, но не IL-4. При идентификации иммунорегуляционного механизма, он обнаружил значительную экспрессию мРНК p40 в присутствии IL-12, но не в присутствии IL-10 при саркоидозе по сравнению с нормальным легким. С этими наблюдениями согласуется обнаружение увеличенных уровней p40 при саркоидозе по сравнению с нормальным бронхоальвеолярным лаважем. Нестимулированные и стимулированные Staphylococcus aureus альвеолярные макрофаги производили большее количество IL-12, чем нормальные альвеолярные макрофаги при культивировании in vitro. Moller считает, что саркоидоз является Th1 процессом, управляемым хронической дисрегуляцией производства IL-12.

Кожная анергия

Во времени Бека, кожная реакция на туберкулин была обычной для большинства населения [7]. Отрицательная реакция у пациентов с саркоидозом не означает отсутствие предшествующей туберкулезной инфекции [51]. Утверждение, что отсутствие реакции на туберкулин вызвано подавлением ранее существовавшей чувствительности к туберкулину, было основано на прямых наблюдениях пациентов с положительными реакциями на туберкулин до начала саркоидоза [51]. Свидетельство предыдущей туберкулезной инфекции было подтверждено введением туберкулина в вазелиновом масле [64], которое замедляет распространение антигена по сравнению с обычным водным раствором. Этот подход изменяет частоту положительных реакций среди пациентов с саркоидозом, которая приближается к частоте в группе контроля. Впоследствии было обнаружено, что при саркоидозе угнетение реакции гиперчувствительности замедленного типа (DTH) наблюдается при кожных пробах с другими антигенами.

Сообщалось, что начало системного гранулематозного воспаления связано с временным угнетением DTH [128]. В некоторых экспериментах, относительно большое количество антигена вводилось предварительно сенсибилизированным животным [26] [27] [151]. Когда животным, предварительно иммунизированным различными антигенами вводилось большое количество одного из этих антигенов, через 7- 8 дней после иммунизации развивалось угнетение DTH. Угнетение DTH не было ограничено только ''десенсибилизирующим'' антигеном, а также развивалось и на другие антигены. Между этими наблюдениями и саркоидозом есть определенная связь. Во-первых, предполагается, что при саркоидозе антиген попадает в организм в достаточном количестве, чтобы инициировать первоначальное гранулематозное воспаление. Этот факт подтверждается кожной пробой K-S , при которой у сенсибилизированных предполагаемым антигеном индивидуумов развивается гранулематозное воспаление при введении экстракта саркоидной ткани. Во-вторых, системный гранулематозный воспалительный ответ на антиген, возможно, является триггером неспецифической регуляции воспалительного процесса. В-третьих, эти неспецифические регуляционные факторы угнетают DTH на участке кожной пробы.

Возможен следующий механизм кожной анергии при саркоидозе. На участках гранулематозного воспаления, имеется преобладание лимфоцитов Т-хелпер [58] [95] [99], которые пролиферируют и вырабатывают большое количество лимфокинов, включая IL-2, MCF и MIF [13] [36] [75] [79]. Эти лимфокины усиливают иммунный ответ, увеличивая пролиферацию T-лимфоцитов и изымая моноциты из кровообращения. Лимфокины и монокины, произведенные на участках гранулематозного воспаления имеют самую высокую концентрацию в очаге воспаления. Однако, распространяясь в кровь, они устанавливают градиент концентрации между участком гранулематозного воспаления и удаленным участком кожной пробы. В результате, движение лимфоцитов T-хелпер и моноцитов преимущественно направлено к участкам формирования гранулем. Это ведет к преобладанию лимфоцитов Т-супрессор в периферической крови и изъятию из кровообращения клеток T-хелпер и моноцитов.

Гранулематозный воспалительный процесс запускает различные модуляционные механизмы. Они включают T-супрессоры, серологические факторы и иммунные комплексы, которые ингибируют функции лимфоцитов T-хелпер и макрофагов. Ингибитор лейкотаксиса моноцитов модулирует гранулематозное воспаление, препятствуя миграции моноцитов из периферической крови к участку воспаления [12] [13] [75]. Сообщалось об обнаружении субпопуляции альвеолярных макрофагов с функцией суппрессоров [144]. В исследованиях in vitro здоровых добровольцев было показано, что такая субпопуляция альвеолярных макрофагов способна уменьшить пролиферативный ответ T-клеток примерно на 40 % в присутствии стимуляторов макрофагов. У пациентов с саркоидозом, эта суппрессорная активность увеличена так заметно, что может полностью подавить ответ T-клеток. Макрофаги у пациентов с активным саркоидозом интенсивно производят простагландин E₂ (PGE₂) [159], TNF [3] и IFN-gamma [120]. Эти цитокины могут непосредственно регулировать T-клеточный ответ. PGE₂ может также ингибировать экспрессию молекул MHC класса 2 [145].

Участок кожной пробы вынужден конкурировать за те же самые клеточные элементы с участками гранулематозного воспаления. Участки гранулематозного воспаления имеют преимущество в более высоких градиентах концентрации цитокинов, чтобы привлечь больший трафик клеток T-хелпер и моноцитов. В результате, сравнительно немного клеток мигрируют к участку введения антигена при кожной пробе [95] [99]. Это было подтверждено сравнительными гистометрическими исследованиями пациентов с саркоидозом и группы контроля [95]. Уже упоминалось, что на участке кожной пробы также подавляется ''просачивание'' клеток из периферического кровообращения. Уменьшение мононуклеарно-клеточного инфильтрата на участке кожной пробы в дальнейшем дополняется уменьшением локального производства факторов хемотаксиса.

Мы считаем, что кожная анергия, характерная для саркоидоза, представляет собой проигранную конкурентную борьбу за мононуклеарные клетки между здоровыми тканями и участками системного гранулематозного воспаления. Следовательно, кожная анергия - сопутствующий признак активного саркоидоза, неспецифический процесс, который наблюдается при других гранулематозных заболеваниях и исчезает, когда активность болезни уменьшается.

Роль иммунологии в определении причин саркоидоза

Вышеописанная гипотетическая модель образования гранулем при саркоидозе, основана на обширных, хотя и косвенных свидетельствах, что неизвестный антиген является стимулом для формирования гранулемы. Главный вопрос - является ли результирующий гиперактивный клеточный ответ иммунной системы при саркоидозе ответом на специфический антигенный стимул или результатом неспецифического поликлонального феномена, аналогичного гипергаммаглобулинемии при гуморальном ответе. Исследование этого вопроса требует повторяемой экспериментальной модели, в которой введение предполагаемого антигена приводит к патологическому ответу - формированию гранулемы у пациента с саркоидозом. Для этой цели мы выбрали модель кожной пробы Квейма-Зильцбаха. Использование этой модели показывает, что индуцированные антигеном K-S гранулемы и оригинальные саркоидные гранулемы имеют гистологическое, гистохимическое, иммунофлуоресцентное и ультраструктурное подобие [44] [98] [99]. Высокая чувствительность и специфичность метода K-S делает его привлекательным инструментом для исследования сакридоза.

Исследование 1960-х годов [136] утверждает, что саркоидоз вызван единственным антигеном. Международное исследование подтвержденных биопсией случаев саркоидоза демонстрировало реакцию на реактив K-S, выделенного из селезенки единственного пациента, во всем мире. Более вероятно, что единственный антиген вызвает реакцию у пациентов во всем мире, чем утверждение, что в реактиве K-S содержится множество различных антигенов.

Мы использовали модель Квейма-Зильцбаха, чтобы определить клеточную иммунодинамику на участках кожной пробы, с которых брались образцы с различными временными интервалами. Через 6 часов, появляется коллаген, окруженный небольшим количеством CD5+ T-лимфоцитов. Большинство клеток являются CD4+ T-хелперами, CD8+ T-супрессоров немного. До дня 7 наблюдается постоянное увеличение числа T-хелпер; T-супрессоры редки. Количество CD14+ моноцитов достигает максимума через 48 часов. После 7 дней, замечены единичные Leu-M3+ моноциты. Leu-M3 антителами окрашиваются более 95 % моноцитов периферической крови, но эпителиоидные клетки и многоядерные гигантские клетки гранулемы не окрашиваются. Это позволяет предположить, что морфологические и функциональные изменения, которые сопровождают дифференцирование моноцитов, связаны с потерей этого маркера. Замечены единичные CD22+ B-лимфоциты. С дня 12 до дня 34 наблюдается постоянное увеличение числа CD4+ T-лимфоцитов, отмечены единичные CD8+ клетки. Гигантские клетки Лангханса появляются на 12 день. Материалы биопсии, взятые на 21, 28 и 34 день показали продолжающийся приток клеток с прогрессирующей консолидацией в эпителиоидную гранулему. Хотя эпителиоидные и многоядерные гигантские клетки были идентифицированы морфологически, ни одна из них не окрашивалась Leu-M3 антителами; B-клетки и моноциты фактически отсутствовали. Депозитов иммуноглобулинов обнаружено не было.

Мы размышляли о значении этих наблюдений. Скопление измененного коллагена на месте введения антигена K-S сохраняется до развития типичной эпителиоидной неказеозной гранулемы. Скопления измененного коллагена не было замечено у здоровых добровольцев при введении антигена K-S [50], что позволяет предложить, что ответ на антиген ограничен пациентами с саркоидозом. У пациентов с саркоидозом, антиген может быть связан с измененным коллагеном, иммобилизируя этот участок для фокусированного иммунного ответа.

Первоначальный приток мононуклеарных клеток, лимфоцитов T-хелпер и макрофагов - процесс, патологически аналогичный мононуклеарному альвеолиту, который предшествует формированию гранулемы в легком [124]. Понимание, что эти клетки инициируют гранулемогенез, дают ключ к изучению источника гранулемогенности антигена. Доминирование клеток T-хелпер не уникально для саркоидоза - это также характерно для ревматоидного артрита [66]. Напротив, при некоторых болезнях наблюдается преобладание T-супрессоров в вовлеченных тканях (вирусные болезни, токсоплазмоз, реакция ''трансплантант против хозяина'', идиопатический легочный фиброз и аллергический пневмонит [14] [31] [87] [113] [134]).

Дефицит B-лимфоцитов и отсутствие депозитов иммуноглобулина в материалах биопсии, подразумевает отсутствие влияния гуморального иммунитета на развитие саркоидных гранулем. В некоторых исследованиях оригинальных саркоидных гранулем сообщилось об обнаружении на периферии гранулем плазматических клеток [134] и предлагалось, что эти клетки появились на участке гранулематозного воспаления позднее. Возможно, что активация B-лимфоцитов и последующая гипергаммаглобулинемия является сопутствующим признаком увеличенной активности клеток T-хелпер [56]. Однако, в этом же исследовании было установлено, что формирование гранулемы при кожной пробе, было эффектом клеточного иммунитета.

Гранулемогенная активность клеток бронхоальвеолярного лаважа

Мы отметили поразительное сходство между притоком лимфоцитов T-хелпер, макрофагов и моноцитов, сопровождающем формирование эпителиоидных гранулем при тесте K-S и мононуклеарным альвеолитом, который предшествует формированию гранулем в легком [124]. Мононуклеарные клетки, возможно, являются медиаторами формирования гранулемы, реагируя на антиген, введенный в дерму. Мы предположили, что мононуклеарные клетки в легких аналогичным образом реагируют на гранулемогенный фактор приводя к саркоидозу, и что мы могли бы изолировать их прежде, чем, они войдут в состав гранулемы.

При альвеолите клетки легко могут быть собраны с помощью бронхоальвеолярного лаважа, в котором обеспечено представительство клеток, резидентных в ткани легкого [62] [110] [131]. Для определения гранулемогенного потенциала клеток, мы применили модель кожной пробы K-S для определении in vivo биологической активности нежизнеспособных аутогенных клеток из бронхоальвеолярного лаважа (NABC), подготовленных по методу Chase [16] [50].

22 пациентам с саркоидозом были введены NABC на одном участке и антиген K-S на втором участке. Биопсии обоих участков были сделаны через 4 недели. У 9 пациентов развились неказеозные гранулемы на участке введения NABC, но всех развились гранулемы на участке введения антигена K-S. Ни у одного из 11 здоровых добровольцев не развивились гранулемы на участке введения NABC. Пациенты, у которых развлся гранулематозный ответ на NABC, признаки заболевания проявились более резко, чем у тех, у которых реакции не было (3.2 и 23.7 месяцев, соответственно, P < 0.01). Не имелось никаких существенных различий в симптомах, рентгенографической стадии, результатах спирометрии и сцинтиграфии с галлием-67, уровнях ангиотензинпревращающего фермента или клеточном составе бронхоальвеолярного лаважа. Эпителиоидные гранулемы на участках введения NABC и антигена K-S были подобны.

Гранулемы, вызванные введением NABC и антигеном K-S также сравнивались с использованием иммуногистохимического окрашивания и имели подобный клеточный фенотип [50]. Подавляющее количество лимфоцитов на обоих участках было T-лимфоцитами (CD5+). B-лимфоциты (CD22+) практически отсутствовали. Далее, T- лимфоциты классифицировались по субпопуляциям, CD4+ доминировали в обоих случаях. CD8+ клетки были редки и были обнаружены лишь на периферии гранулемы.

Это исследование показывает, что гранулемогенный фактор, подобный антигену Квейма, существует в пределах NABC, после симптоматического начала или рецидива саркоидоза. При этом гранулемы подобны иницированным антигеном K-S, которые, в свою очередь, подобны оригинальным саркоидным гранулемам. Хотя рецепторы лимфоцитов к IL-2 в гранулемах редки, их присутствие предполагает анамнестический ответ, который иммунологически различается от ответа при гранулемах типа ''инородное тело''.

В нашем исследовании, патологический ответ на антиген K-S гарантировал аналогичный ответ на NABC. Стандартизованный антиген K-S позволял выделить пациентов с характерным для саркоидоза иммунным ответом [65] [81] [137] [148]. Поскольку все пациенты в исследовании имели положительную реакцию на антиген K-S, отрицательный ответ на NABC вероятно был вызван неадекватным количеством гранулемогенного фактора в вводимом материале. Положительная корреляция раннего проявления признаков заболевания с гранулематозным ответом на NABC говорит о том, что гранулемогенный фактор может быть ассоциирован с клетками при альвеолите. Отсутствие гранулематозного ответа на NABC у пациентов с хронической болезнью требует объяснения, особенно потому, что у них имеются свидетельства активного альвеолита и гранулематозного воспаления, которые указывают на наличие гранулемогенного фактора [1] [8] [29]. Невозможность обнаружения гранулемогенного фактора при изучении бронхоальвеолярного лаважа вероятно объясняет отрицательные результаты при исследовании пациентов, у которых признаки заболевания проявлялись продолжительное время до проведения БАЛ. Макрофаги, несущие предполагаемый гранулемогенный фактор, интегрируются в массив гранулем, и, поскольку, они дифференцируются в эпителиоидные клетки, попадание их лаваж затруднено. Кроме того, при сравнении гранулематозного ответа на антиген K-S и NABC, необходимо помнить, что первый из них является высоко чувствительным и специфичным, а последний представляет собой переходное динамическое состояние иммунных клеток, которые возможно, не содержат гранулемогенный фактор. Хотя кожная проба с клетками бронхоальвеолярного лаважа отражает гранулемогенную активность альвеолита, она, в отличие от препарата селезенки, не обязательно отражает активность при формировании гранулем в паренхиме.

При дальнейшей работе с NABC моделью кожной пробы, у 3 из 7 пациентов с положительными кожными пробами K-S, развились гранулемы после введения препарата с мембранной подготовкой клеток бронхоальвеолярного лаважа [49]. Как известно, активный компонент антигена K-S является мембранно-связанным. Затем, мы решили выяснить, мембрана какой из клеток бронхоальвеолярного лаважа является источником активности. Был подготовлен обогащенный макрофагами NABC и обогащенный лимфоцитами NABC. Из 14 пациентов, которым вводились оба реактива, у 5 развились гранулемы на месте введения реактива, обогащенного макрофагами. Реактив, обогащенный лимоцитами, вызывал гранулематозный ответ, только если он содержал существенное количество гранулемогенных макрофагов [49]. То, что источником гранулемогенной активности являются макрофаги, согласуется с работой Путконена [114], в котором потенция кожной пробы значительно уменьшается после лечения преднизоном, обладающего лимфолитическим действием. Кроме того, имеется корреляция гранулемогенности клеток бронхоальвеолярного лаважа с уровнем монокинов, и лаваж пациентов с саркоидозом имеет значительно более высокие уровни IL-1, TNF и IL-6 чем лаваж здоровых пациентов [48]. Это позволяет предположить, что гранулемогенный фактор может усиливать степень активации макрофагов.

Гранулемагенная активность моноцитов периферической крови

Поскольку предшественником альвеолярных макрофагов являются моноциты, мы сранили in vivo их гранулемогенность с клетками бронхоальвеолярного лаважа. 7 пациентам с подтвержденным биопсией саркоидозом, были введены оба реактива. У 2 пациентов развились гранулемы на обоих участках, у 2 развились гранулемы только на участке введения альвеолярных макрофагов и у 3 реакция была отрицательна на обоих участках. Результаты биопсии при тестах со стандартным препаратом K-S, аутогенными альвеолярными макрофагами и аутогенными моноцитами показаны на рис. 1.

Рис 1.

Восьмому пациенту вводился препарат с целыми моноцитами периферической крови на одном участке и фрагментированная ДНК постнуклеарных моноцитов (postnuclear monocyte sonicate) на другом участке. Гранулематозное воспаление развилось на обоих участках. Девятому пациенту вводились гранулированные постуклеарные моноциты (postnuclear pellets) на одном участке и некультивированные моноциты на другом. Гранулематозное воспаление развилось на обоих участках.

Эти данные позволяют предположить, что моноциты уже были связаны с гранулемогенным фактором перед дифференцированием в альвеолярные макрофаги. Это согласуется с мультисистемным характером саркоидоза и подтверждается недавними сообщениями о рецидиве саркоидоза после трансплантации легкого [96] и развития саркоидоза у реципиента после персадки костного мозга, взятого у пациента с саркоидозом [43].

Представленные свидетельства поддерживают интригующую концепцию, что саркоидоз является уникальным типом аутоиммуннной болезни, при которой связанный с моноцитом аутоантиген атакуется клеточным иммунным механизмом, а не гуморальным, как традиционно считалось. Гранулемогенность аутогенных моноцитов и макробактериофагов подтверждает предположение Цезаря Бека столетней давности, что саркоидоз вызван ''дефектом кроветоворения или аутоинтоксикацией'' [6], которое может оказывается пророческим.

Направления дальнейших исследований

Гранулемогенная активность альвеолярных макрофагов и моноцитов при аутогенном саркоидозе, служит маяком для дальнейшего поиска антигена, инициирующего формирование гранулем. Возможно, он связан с молекулами MHC класса 2, что дает возможность его изоляции с помощью метода моноклональной иммунопурификации. После этого, можно было бы определить, является ли он измененным эндогенным протеином или чужой нуклеиновой кислотой, например моноцитотропным вирусом.

Дальнейшие исследования регулирующей роли Th1 и Th2 CD4+ лимфоцитов позволят проводить более точные терапевтические акции, особенно у пациентов с постоянным прогрессом болезни. Возможно, определение природы антигена и его влияния на иммунную систему, позволит влиять на исход болезни.

Реферат

Из-за связи с кожной анергией, саркоидоз первоначально рассматривался как дефект клеточного иммунитета. Это неправильное восприятие поддерживалось результами ранних исследований лимфоцитов периферической крови, в которых была обнаружена лимфопения. Ключ к пониманию цепи сложных гиперактивных иммунных реакций был найден после обнаружения in vitro спонтанной бласттрансформации и спонтанного производства лимфокинов. Впоследствии, внимание исследователей было сконцентрировано на активизированных лимфоцитах T-хелпер и лимфокинах которых принимают участие в развитии гранулемы. Лимфоциты T-хелпер также вносят вклад в механизм гипергаммаглобулинемии посредством активации B-клеток. Наиболее интригующий вопрос в иммунологии саркоидоза - причина, вызывающая активизацию и пролиферацию T-лимфоцитов. Имеются основания предположить, что процесс запускается при реакции на антиген. Поскольку активизация и пролиферация лимфоцитов предшествуют формированию гранулемы при кожной пробе K-S и в легких, мы oбъединили технологию БАЛ с определением биологической активности при пробе K-S, чтобы показать, что процессинг гранулемогенного фактора производят макрофаги и моноциты. Обнаружение аутогенного гранулемогенеза макрофагами и моноцитами, увеличивает возможность того, что саркоидоз - уникальный тип клеточного аутоиммуннного процесса. Выделение и идентификация гранулемогенного фактора - главная цель будущих исследований.