The Journal of Immunology, 1998, 161: 6413-6420

Участие хемокина IP-10 в саркоидных гранулематозных реакциях

Carlo Agostini, Marco Cassatella , Renato Zambello, Livio Trentin, Sara Gasperini , Alessandra Perin, Francesco Piazza, Marta Siviero, Monica Facco, Michelle Dziejman, Marco Chilosi, Shixin Qin, Andrew D. Luster and Gianpietro Semenzato
Department of Clinical and Experimental Medicine, Padova University School of Medicine, Padova, Italy; Institutes of General Pathology and Department of Pathology, Verona University School of Medicine, Verona, Italy; Research and Discovery LeukoSite Inc., Cambridge, MA 02142; and Infectious Disease Unit, Massachusetts General Hospital, Department of Medicine, Harvard Medical School, MA 02129

Реферат

Накопление T-клеток и моноцитов на участках продолжающегося воспаления является самым ранним шагом в цепи событий, ведущих к формированию гранулемы при саркоидозе. В этом исследовании, мы оценили легочное производство IP-10, CXC хемокина, который стимулирует направленную миграцию активизированных T-клеток. Увеличенные уровни IP-10 были обнаружены в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) 24 пациентов с легочным саркоидозом и лимфоцитарным альвеолитом, по сравнению с пациентами с бездействующей болезнью или группой контроля. Наблюдалась положительная корреляция между уровнями IP-10 и числом CD45R0+/CD4+ клеток в БАЛ. Иммунохимическое исследование показало, что клетки, несущие IP-10, являются эпителиоидными клетками и CD68+ макрофагами, расположенными во внутригранулематозных областях. Макрофаги ЖБАЛ пациентов с саркоидозом, уверенно окрашивалсь для IP-10. Кроме того, альвеолярные макрофаги, изолированные у пациентов с T-клеточным альвеолитом и культивированные в течение 24 часов в присутствии IFN-gamma, вырабатывали уровни IP-10, достаточные для стимулирования хемотаксиса. Интересно, что альвеолярные лимфоциты пациентов с активным саркоидозом, были CD4+ T-клетками, экспрессированными Th1 цитокинами (IL-2 и IFN-gamma) и высокими уровнями CXCR3. Эти данные предполагают потенциальную роль IP-10 в регулировании активации и миграции T-клеток к участкам саркоидного воспалительного процесса и последующего формирования гранулемы.

Введение

Саркоидоз - хроническая, мультисистемная болезнь неизвестной причины (причин), характеризованная накоплением в вовлеченных органах активизированных CD4+ T-клеток и макрофагов, формированием эпителиоидных неказеозных гранулем и повреждением ткани. Хотя саркоидоз может воздействовать на любой орган, наиболее часто вовлекаются легкие. Морфологически, саркоидная гранулема представляет типичную гранулему при реакции гиперчувствительности замедленного типа. Центральное ядро состоит из множества моноцитов / макрофагов и эпителиоидных клеток, производных мононуклеарных фагоцитов а также содержит гигантские многоядерные клетки. Эпителиоидные клетки окружены оправой из CD4+ Т-лимфоцитов и плазматических клеток (1, 2).

Хотя этиология саркоидоза все еще неизвестна, характерный иммунологический и иммуногистологический паттерн гранулематозных повреждений говорит, что они являются результатом управляемого антигеном иммунного ответа. Исследования макрофагов показали, что при саркоидозе они ведут себя как универсальные секреторные клетки и, действуя как антигенпрезентирующие клетки, (APC), производят разнообразные цитокины, включая TNF-alpha, IL-12, IL-15 и факторы роста (3, 4, 5, 6). Также есть доказательства, что саркоидные T-клетки спонтанно производят IFN-gamma и IL-2 (10, 11). Эти данные позволяют предположить, что 1) саркоидные гранулемы формируются в ответ на персистирующий, слабо деградируемый антигенный стимул, который стимулирует локальную олигоклональную T-клеточную иммунную реакцию Th1 типа; 2) Как последствие хронической стимуляции, макрофаги производят медиаторы воспаления, что ведет к локальному накоплению Th1 клеток в местах продолжающегося воспаления и способствует развитию гранулемы.

Суперсемейство хемокинов состоит из множества белков-хемоаттрактантов, которые были разделены на четыре групы (C, CC, CXC и CXXXC) на основании относительного положения цистеина (12, 13). Было показано, что структурные вариации хемокинов были связанны с различиями в их способности регулировать траффик иммунных клеток в течение воспалительного ответа (13). Например, IP-10 (3), CXC хемокин, который индуцируется у моноцитов / макрофагов IFN-gamma (14), является хемотаксическим фактором для активизированых IL-2 T-клеток, но не для нейтрофилов (15). Факт, что IP-10 стимулирует миграцию T-клеток к участкам воспаления, делает его привлекательным кандидатом для исследования механизмов, поддерживающих развитие саркоидной гранулемы. Интересно, что экспрессия IP-10 была замечена в эпидермисе пациентов с другой гранулематозной болезнью, туберкулоидной лепрой (16).

В этой работе мы исследовали, экспрессируется ли IP-10 воспалительными клетками при клеточной иммунной реакции, характеризующей саркоидоз. Мы оценили in situ экспрессию IP-10 в тканях, представляющих гранулематозные повреждения, связанные с саркоидозом, отношение между уровнями IP-10 в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) и степень саркоидного CD4+ T-клеточного альвеолита и in vitro производством IP-10 саркоидными макрофагами. Кроме того, мы оценили, экспрессируют ли саркоидные T-клетки CXCR3, то есть, рецепторы IP-10 и других хемокинов (Mig, I-TAC) (13, 17, 18). Данные, сообщенные здесь предполагают прямое участие IP-10 в местном накоплении CD4+ T-клеток и формировании саркоидной гранулемы.

Пациенты

Были исследованы 24 пациента с недавно диагностированным саркоидозом (6 мужчин и 18 женщин; средний возраст 37.3 ± 7.4 лет; 4 курящих и 20 некурящих). Во всех случаях, диагноз был установлен при биопсии легких или лимфатических узлов, при обнаружении неказеозных эпителиоидных гранулем, без признаков наличия неорганических материалов, способых вызывать гранулематозные болезни. Согласно системе стадий саркоидоза (19), у каждого пациента проводился анализ БАЛ.

17 пациентов с саркоидозом с легочным вовлечением были оценены в начале болезни. Наличие активной болезни определялось на основании следующих характеристик: 1) лимфоцитарный альвеолит (> 30*10³ лимфоцитов в мл); 2) позитивный результат сцинтиграфии с Ga67; 3) отношение CD4/CD8 в БАЛ > 5. Кроме анализа БАЛ, оценка активности болезни включала клинические особенности, рентгенограмму, исследования функции легкого, компьютерную томографию с высоким разрешением (КТВР) и исследования крови.

Другие 7 образцов БАЛ были получены у пациентов с ранее диагностированным легочным саркоидозом, у которых проводился повторный анализ БАЛ. Все эти пациенты имели бездействующую болезнь, так как исследование БАЛ показало регресс CD4+ альвеолита, спонтанный или после терапии. В частности, во время нашего исследования, все пациенты имели нормальную функцию легкого, нормальное число клеток БАЛ, негативные результаты сцинтиграфии с Ga76 и никаких клинических признаков острой болезни. 4 из этих 7 пациентов получали стероидную терапию (преднизон 1 мг/кг в день), но ни один пациент не получал иммуносупрессивную терапию за менее чем за 6 месяцев до анализа БАЛ (средний период 35 ± 17.1 месяцев, диапазон 18-46 месяцев).

6 индивидуумов были включены в группу контроля (3 мужчины и 3 женщины; средний возраст 29.8 ± 5.8 лет; 2 некурящих здоровых мужчиы и 4 пациента, имевшие кашель без болезни легкого). Все имели нормальную физикальную экспертизу, рентгенограмму, функцию легкого и число клеток в БАЛ.

Результаты

Уровни IP-10 в БАЛ

Вследствие увеличения абсолютного числа CD4+ T-клеток, отношение CD4/CD8 в БАЛ было значительно выше у пациентов с активной болезнью (6.9 ± 2.1) по сравнению с пациентами с бездействующей болезнью (1.71 ± 0.41; p < 0.001) и группой контроля (1.65 ± 0.35; p < 0.001). Как ранее сообщалось (2), более чем 98 % Т-лимфоцитов БАЛ пациентов с саркоидозом, были CD4+/CD45R0+/CD29+.

В БАЛ пациентов с активным саркоидозом был обнаружен IP-10 (45-2639 pg/ml). Его уровни были значительно выше, чем в БАЛ пациентов с бездействующей болезнью (0-128 pg/ml). Только 3 из 6 пациентов группы контроля имели обнаружимые уровни IP-10 в БАЛ (18, 14 и 16 pg/ml, соответственно). Положительная корреляция наблюдалась между концентрацией IP-10, процентом и абсолютным числом лимфоцитов в БАЛ (0.845 и p < 0.001; и 0.816 и p < 0.001, соответственно) и процентом и абсолютным числом CD4+ T-клеток (0.815 и p < 0.001; и 0.825 и p < 0.001, соответственно). Вследствие альвеолита высокой интенсивности, число AMs и CD8 T-клеток было значительно увеличено; однако, коэффициенты корреляции между уровнями IP-10 и альвеолярными макрофагами и CD8+ были - 0.802 и - 0.693 соответственно, указывали на отрицательную корреляцию.

Экспрессия IP-10 воспалительными клетками в саркоидной гранулеме

Чтобы исследовать мембранные взаимодействия между макрофагами в пределах гранулем, был использован иммуногистохимический анализ. Центральное ядро саркоидной гранулемы состоит из множества моноцитов / макрофагов в различных стадиях активации и дифференцирования, эпителиоидных клеток и многоядерных гигантских клеток, в то время как множество CD4 лимфоцитов и плазматических клеток окружает центральное ядро гранулемы. IP-10 был преимущественно экспрессирован макрофагами и эпителиоидными клетками, расположенными внутри гранулемы, принимая во внимание, что гигантские клетки были в основном нереактивны.

Экспрессия IP-10 бронхоальвеолярными клетками

Иммунохимический анализ клеток, производящих IP-10 в БАЛ показал, что большинство AMs пациентов с саркоидозом имеют сильную экспрессию этого хемокина.

Чтобы определить, связана ли увеличенная экспрессия IP-10 с увеличенной экспрессией цитокинов, которые активно производятся в легком при саркоидозе (4, 5), клетки БАЛ были проанализированы на экспрессию IL-2, IL-4, IFN-gamma и IL-15. 47-58 % и 55-84 % AMs пяти пациентов с активным саркоидозом экспрессировали эндоплазматический IFN-gamma и IL-15, соответственно (45.1 % ± 6.3 и 66.5 % ± 8.1). Менее 5 % AMs, изолированного у пациентов с бездействующим саркоидозом показали экспрессию IFN-gamma и IL-15. T-клетки БАЛ пациентов с активным саркоидозом экспрессировали IL-2 (29 % ± 13.8) и IFN-gamma (32.3 % ± 11.7), но не IL-4. Менее 1 % T-клеток БАЛ группы контроля экспрессировали эти цитокины. Таким образом, саркоидные T-клетки показывают сильную поляризацию Th1 иммунной реакции параллельно с экспрессией IP-10.

Производство IP-10 альвеолярными макрофагами

Альвеолярные макрофаги производят IP-10 in vitro. Чтобы подтвердить данные иммунохимического исследования и проточной цитометрии, мы оценили, могут ли саркоидные AMs производить IP-10 в нормальном состоянии и после стимуляции.

После культивирования в течение 24 часов, нестимулированные AMs пациентов с активным саркоидозом были способны произвести большее количество IP-10 (354.7 ± 146.9 pg/ml) чем AMs, изолированные у пациентов с бездействующей болезнью (108.3 ± 75.6 pg/ml; p < 0.05) и группы контроля (27.6 ± 12.1 pg/ml; p < 0.001). AMs пациентов с активной и бездействующей болезнью увеличили производство IP-10 после стимуляции LPS и не имелось никаких значительных различий в производстве IP-10 между пациентами с активной и бездействующей болезнью (1714 ± 1330 pg/ml против 710.5 ± 624.6 pg/ml, соответственно). Напротив, стимулированные LPS AMs группы контроля, показали небольшое увеличение производства IP-10 (54.4 ± 9). Когда AMs были культивированы в присутствии IFN-gamma, уровни IP-10 у пациентов с активной болезнью были с в 10 раз выше (69,571 ± 25,255 pg/ml) чем уровни, полученные при культивировании AMs с IFN-gamma в группе контроля (6,722 ± 2,323 pg/ml, p < 0.001). Пациенты с бездействующим саркоидозом производили промежуточные уровни IP-10 (27,671 ± 5,459 pg/ml).

Экспрессия CXCR3 саркоидными и нормальными легочными T-клетками

Данные, сообщенные выше демонстрируют, что саркоидные AMs производят IP-10, который взаимодействует с клеточным рецептором CXCR3, экспрессированного на активизированных T-клетках и может стимулировать T-клеточное воспаление в периферических тканях (13, 18, 25). Чтобы оценить, экспрессируют ли T-клетки, накапливающиеся в легких пациентов с саркоидозом, CXCR3, была выполнена проточная цитометрия. Интересно, что T- клетки БАЛ пациентов с активным саркоидозом показали увеличенную экспрессию CXCR3 по сравнению с T-клетками из БАЛ пациентов с бездействующим саркоидозом и группой контроля. Однако, небольшое число CD8+ T-клеток в БАЛ пациентов с активным саркоидозом, также экспрессироовали CXCR3, хотя и более слабо, чем CD4+ T-клетки БАЛ.

Обсуждение

Саркоидоз характеризуется персистирующим накоплением макрофагов и активизированых CD45R0+ Th1 T-клеток, главным образом с CD4 фенотипом. Наши результаты, 1) IP-10 сильно экспрессирован в саркоидных тканях; 2) макрофаги при саркоидозе являются источником производства IP-10 и усиливают хемотаксическую активность CXCR3+ T-клеток; 3) имеется положительная корреляция между уровнями IP-10 в БАЛ и степенью CD4 альвеолита, экспрессией Th1 цитокинов и CXCR3R T-клетками, предполагают важную роль IP-10 в механизмах, которые производят активацию CD4 T-клеток и развитие саркоидных гранулем.

Большинство CXC и CC хемокинов, которые участвуют в хемотаксисе лимфоцитов, также активны для моноцитов и гранулоцитов. Этот сценарий значительно различается для IP-10. Как недавно было продемонстрировано Loetscher (17), этот цитокин увеличивает селективную миграцию IL-2-активированных T-клеток, которые эксклюзивно экспрессируют рецепторы IP-10. Наблюдение, что саркоидные AMs экспрессируют IP-10 и наблюдается значительная корреляция между концентрацией IP-10 и числом CD4+ Т-лимфоцитов в БАЛ, указывают на важную роль произведенного макрофагами IP-10 в регулировании миграции IL-2-активизированных T-клеток к участкам саркоидного воспалительного процесса. Наиболее вероятно, что тот факт, что клетки БАЛ при саркоидозе экспрессируют ряд Th1 цитокинов, включая IL-2 и IL-15, говорит о том, что IP-10 вместе с Th1 цитокинами действуют как местные факторы активации и пролиферации Т-клеток (5).

Хотя наше исследование не разъяснило факторы, регулирующие in situ производство IP-10 саркоидными макрофагами, мы предположили, что производство хемокинов индуцировано хронической активацией AMs и T-клеток IFN-gamma. AMs пациентов с саркоидозом отличаются от нормальных AMs по ряду параметров, связанных с их функциональными свойствами, таких как фенотипические характеристики и секреторные способности (26). Мы предлагаем гипотезу, что в результате хронической стимуляции IFN-gamma, AMs производят IP-10. В этом сценарии возможно, что Th1 T-клетки могут рассматриваться как индукторы производства IP-10 и как клетки-мишени для IP-10. Ось IFN-gamma / IP-10 могла бы вносить вклад в миграцию саркоидных Th1 T-клеток к участкам саркоидного воспаления, стимулируя иммунные механизмы, которые ведут к развитию саркоидной гранулемы.

Другой интересный вопрос - участвует ли IP-10 вместе с другими хемокинами в регулировании воспалительного инфильтрата в саркоидных повреждениях. Было показано, что CC хемокин RANTES, сильно экспрессирован в саркоидных тканях (27). Подобно IP-10, RANTES активизирует специфические субпопуляции Т-клеток (28). Кроме того, иммуноцитохимическое окрашивание саркоидных гранулем лимфатического узла и легкого показало, что хемоаттрактант CD4+ T-клеток IL-16, экспрессирован в областях, в которых имеется периваскулярное накопление лимфоцитов (29). Наконец, наши предварительные данные показали присутствие Mig в саркоидных гранулемах (30). Мы также показали, что небольшое число CD8+ T-клеток в БАЛ пациентов с саркоидозом с серьезным альвеолитом, также экспрессируют CXCR3, хотя и менее сильно, чем CD4+ T-клетки. Это говорит, что различные цитокины, участвующие в привлечении T-клеток, могли бы играть роль в регулировании развития саркоидной гранулемы, возможно, управляя траффиком субпопуляций T-клеток.

Данные, полученные на животных моделях показали, что Th1 клетки усиливают, в то время как супрессорные T-клетки ослабляют рост гранулематозного процесса (2). Кроме того, в то время как CD4+ T-клетки преобладают во внутренней области саркоидных гранулем, CD8+ T-клетки преобладают во внешнем окружении гранулемы (1, 2). По нашим наблюдениям, производство IP-10 является более высоким у пациентов с саркоидозом с массивными CD4+ T-клеточными инфильтратами, чем у пациентов с бездействующей болезнью. Саркоидные CD4+ T-клетки производит Th1 цитокины, включая IL-2 и IFN-gamma (4, 5, 11, 31); результат Th1 ответа - развитие гранулемы (32). Однако, в зависимости от восприимчивости хозяина, переключение на Th2 ответ может происходить у пациентов с саркоидозом, у которых развивается фиброз легкого с сопутствующим производством Th2 цитокинов, включая IL-4, который стимулирует производство внеклеточного матрикса и/или хемоаттрактантов фибробластов (32). С тех пор, как было показано, что IL-4 уменьшает производство хемокинов (33), исследования паттерна Th1/Th2 в течение различных фаз саркоидного воспалительного процесса могли бы разъяснить, имеет ли Th2 супрессивный эффект на производстве in situ IP-10 и, таким образом, на формирование гранулемы и развитие фиброза.

Настоящее исследование показало, что саркоидные T-клетки экспрессируют CXCR3. Были идентифицированы 5 CXC рецепторов (CXCR1 - CXCR5), 9 CC рецепторов (CCR1 - CCR9) и 1 CXXXC рецептор (CX3R1) (13). Так как увеличение секреции различных хемокинов и модуляция некоторых рецепторов хемокинов могли бы иметь значительный эффект на регулирование паттерна Th1/Th2 в процессе воспаления (34), в наших лабораториях проходят исследования участия других хемокинов и рецепторов хемокинов в патогенезе саркоидного воспалительного процесса.

Это исследование поддерживает гипотезу, что IP-10 участвует в сложной цепи взаимодействий между легочными иммунокомпетентными клетками и цитокинами, которые устанавливают стадию развития саркоидных гранулем. Понимание местных механизмов, управляющих производством IP-10 разъяснит цепь событий, ведущих к легочному фиброзу. Кроме того, наши результаты предполагают, что in situ производство IP-10 отражает развитие Th1 воспалительного процесса при саркоидозе. В этом контексте, использование измерения уровней IP-10 в БАЛ как маркера активности саркоидоза, должно быть подтверждено дополнительными исследованиями.