Chest. 2004;125:1005-1011.

Уровни 8-изопростана, маркера окислительного стресса, увеличены в выдыхаемом воздухе пациентов с легочным саркоидозом

Kostas Psathakis, MD; George Papatheodorou, PhD; Maria Plataki, MD; Panayotis Panagou, MD; Stelios Loukides, MD; Nikolaos M. Siafakas, MD, PhD, FCCP and Demosthenes Bouros, MD, FCCP
From the Department of Pneumonology (Drs. Psathakis, Panagou, and Loukides) and Clinical Research Unit (Dr. Papatheodorou), Army General Hospital of Athens, Athens; and Departments of Pneumonology (Drs. Plataki and Siafakas), University Hospital of Heraklion, University of Crete, Heraklion; and University Hospital of Alexandroupolis (Dr. Bouros), University of Thrace, Alexandroupolis, Greece.

Реферат

Цель исследования: 8-изопростан является индексом окислительного стресса. Измерение 8-изопростана в выдыхаемом воздухе, атравматичный метод, который ранее не использовался для исследования уровня воспаления при легочном саркоидозе. Цель нашего исследования состояла в том, чтобы измерить уровни 8-изопростана в выдыхаемом воздухе пациентов с саркоидозом и исследовать связь уровня 8-изопростана с активностью болезни. Пациенты: мы исследовали 30 пациентов с легочным саркоидозом (активная болезнь n = 14; неактивная болезнь n = 16) и 12 здоровых индивидуумов в группе контроля. Методы: 8-изопростан был измерен в выдыхаемом воздухе всех пациентов и его уровни были сравнены с группой контроля, а также между подгруппами пациентов с активной и неактивной болезнью. В группе пациентов с саркоидозом, уровни 8-изопростана коррелировали с маркерами, которые отражают активность болезни, такими как серологический уровень ангиотензинпревращающего фермента (АПФ), серологический уровень кальция и результаты исследования функции легких. Результаты: концентрация 8-изопростана была увеличена у пациентов с саркоидозом, по сравнению с группой контроля (средний уровень 64.23 pg/mL; 95 % CI, диапазон от 37.00 до 91.46 pg/mL у пациентов; против среднего уровня 20.75 pg/mL; 95 % CI, диапазон от 16.06 до 25.44 pg/mL; p = 0.04). Пациенты с активной болезнью имели значительно более высокие уровни 8-изопростана (средний уровень 111.4 pg/mL; 95 % CI, диапазон от 62.56 до 160.30 pg/mL; p < 0.001) по сравнению с пациентами с неактивной болезнью (средний уровень 22.94 pg/mL; 95 % CI, диапазон от 15.89 до 29.99 pg/mL) и группой контроля. Уровни 8-изопростана у пациентов с неактивной болезнью не отличались от уровней в группе контроля (p> 0.05). У пациентов с саркоидозом, уровни 8-изопростана положительно коррелированые с уровнем АПФ (p < 0.0001, r = 0.69), но не коррелировали с серологическим уровнем кальция или результатами исследования функции легких. Заключения: наши данные говорят, что уровни 8-изопростана увеличены в выдыхаемом воздухе у пациентов с саркоидозом и могут служить индексом активности болезни.

Введение

Окислительный стресс обычно рассматривается как усиления воздействия оксидантов на клети. В контексте местного воспаления, воспалительные клетки, такие как нейтрофилы и макрофаги локально производят так называемые реактивные соединения кислорода (ROS), такие как суперокисные анионы, перекись водорода и гидроксильные радикалы, которые действиют как оксиданты на соседние клетки (1, 2). ROS влияют на компоненты клеток, такие как липиды клеточных мембран, ДНК и белки клеточной стенки, изменяя их структуру и/или функцию и приводя к нарушению функционирования или смерти клеток (3, 4). Окислительный стресс может быть определен количественно, непосредственно измеряя уровни ROS (например H₂O₂) или измеряя продукты действия продуктов окислительного стресса на компоненты клеток. F2 изопростан - стабильная простагландин-F2-подобная субстанция, которая формируется при окислении арахидоновой кислоты в клеточной мембране неферментативным путем, которая была предложена как новый индекс окислительного стресса (5). 8-изопростан - наиболее распространенный F2 изопростан у человека, уровни котрого увеличены при многих легочных болезнях (6).

Саркоидоз - хроническая воспалительная болезнь неизвестного происхождения, характеризованная формированием неказеозных эпителиоидноклеточных гранулем. Воспалительные клетки, главным образом лимфоциты и макрофаги, вносят основной вклад в воспалительный процесс при саркоидозе (7). Было показано, что альвеолярные макрофаги, изолированные у пациентов с саркоидозом, производят увеличенное количество суперокисных анионов in vitro (8, 9). Маркеры окислительного стресса, особенно 8-изопростан, были увеличены в БАЛ пациентов с саркоидозом (10, 11).

Мы выдвинули гипотезу, что уровни 8-изопростана могли бы быть также увеличены в выдыхаемом воздухе этих пациентов, и что уровни 8-изопростана могли бы различаться между пациентами с различной активностью болезни. Так как исследование выдыхаемого воздуха - атравматичная процедура, это могло могло бы быть удобным методом контроля пациентов с саркоидозом. Цель этого исследования состояла в том, чтобы определить уровни 8-изопростана в выдыхаемом воздухе пациентов с саркоидозом и оценить, отражает ли уровень 8-изопростана активность болезни.

Пациенты

Мы исследовали 30 пациентов с саркоидозом и 12 здоровых индивидуумов в группе контроля. Все пациенты имели гистологически доказали легочный саркоидоз без сопутствующих болезней. Мы исключили из исследования 18 пациентов с саркоидозом, из-за истории курения, бронхиальной астмы, аллергии, недавней респираторной инфекции или отказа от проведения клинической оценки. Индивидуумы в группе контроля не имели истории аллергии или любой хронической болезни, не получали никакого лечения и имели нормальные результаты спирометрии. Все участники исследования не курили и не имели респираторных инфекций по крайней мере за 6 недель до начала исследования.

В группе пациентов с саркоидозом, 7 имели недавно диагностированую болезнь и 23 прибыли в клинику для регулярного 3-месячного наблюдения ранее диагностированной болезни. 9 больных получали кортикостероиды во время исследования. Продолжительность болезни составляла 3±2 года.

Результаты

Все недавно диагностированные пациенты с саркоидозом (n = 7) имели лимфоцитарный альвеолит и рентгенографические результаты, совместимые с саркоидозом. Симптомы включали сухой кашель, одышку при физической нагрузке, полиартралгию и узловатую эритему, 3 пациента были бессимптомны. Уровни АПФ были увеличены у всех пациентов, кроме одного. Во время исследования, ни один из пациентов не имел признаков внелегочной болезни, кроме 2 пациентов, имевших увеличенные уровни ферментов печени.

Среди пациентов с ранее диагностированным саркоидозом (n = 23), 5 пациентов имели сухой кашель или одышку. 5 пациентов имели прогресс рентгенографической болезни или новые области с эффектом ''матового стекла'' на КТВР. Один из них имел ухудшение функции легкого. У остальных пациентов болезнь была устойчивой. У одного пациента с активной болезнью, единственным признаком активной болезни было увеличение ранее нормального уровня АПФ. Спустя 1 месяц, у этого пациента был идентифицирован рецидив.

Концентрация 8-изопростана в выдыхаемом воздухе у пациентов с саркоидозом была значительно выше чем в группе контроля (среднее значение 64.23; 95 % CI, диапазон от 37.00 до 91.46 pg/mL; против среднего значения 20.75; 95 % CI, диапазон от 16.06 до 25.44 pg/mL; p = 0.04). Концентрация 8-изопростана у пациентов с активным саркоидозом (среднее значение 111.4 pg/mL; 95 % CI, диапазон от 62.56 до 160.30 pg/mL) была значительно увеличена (p < 0.001) по сравнению с пациентами с неактивной болезнью (среднее значение 22.94; 95 % CI, диапазон от 15.89 до 29.99 pg/mL) и группой контроля.

Различие между уровнями 8-изопростана в группе контроля и у пациентов с неактивным саркоидозом не было существенным (p > 0.05). В пациентов с саркоидозом, уровень 8-изопростана положительно коррелировал с уровнем АПФ (p < 0.0001, r = 0.69). Уровень 8-изопростана не имел существенной корреляции с функцией легкого (FEV1, FVC, отношение FEV1/FVC, TLC, DLCO) или сывороточным уровнем Ca++. Уровни 8-изопростана не отличались среди пациентов с различными рентгенографическими стадиями (p = 0.2).

Обсуждение

Мы впервые измерили уровни 8-изопростана в выдыхаемом воздухе пациентов с саркоидозом, и обнаружили, что уровни 8-изопростана были увеличены только у пациентов с признаками активной болезни.

Ранее было показано (11), что уровни 8-изопростана увеличены в БАЛ пациентов с саркоидозом, и было предположено, что это увеличение может отражать основной патофизиологический процесс. В нашем исследовании мы показали, что уровни 8-изопростана увеличены в выдыхаемом воздухе пациентов с саркоидозом. Не все пациенты в нашем исследовании имели маркеры, показательные для активной болезни и различие в уровнях 8-изопростана между группой контроля и пациентами с саркоидозом наблюдалось прежде всего для подгруппы пациентов, имевших признаки активной болезни. Когда пациенты были разделены на подгруппы с активной и неактивной болезнью, мы обнаружили, что пациенты с активной болезнью имели значительно увеличенные уровни 8-изопростана по сравнению с пациентами с неактивной болезнью и группой контроля. Уровень 8-изопростана у пациентов без признаков активной болезни не отличался от уровня в группе контроля. Этот результат был ожидаем, так как неактивная болезнь не производит признаков легочного воспаления.

Уровень 8-изопростана коррелировал с уровнем АПФ, независимо от активности болезни. Известно, что АПФ производится эпителиоидными клетками и альвеолярными макрофагами. Уровень АПФ отражает интегральное поражение всего органа гранулемами и является косвенным индексом степени и активности болезни (16). 8-изопростан в выдыхаемом воздухе - индекс окислительного стресса органов дыхания. Все наши пациенты имели легочный саркоидоз и следовательно можно было бы ожидать, что легкие этих пациентов будут основным источником АПФ. Общий источник АПФ и 8-изопростана мог бы объяснять корреляцию между уровнями этих двух субстанций. Было показано, что уровни АПФ находятся под влиянием полиморфизма гена АПФ (17, 18). Корреляция уровней 8-изопростана с уровнями АПФ также может подразумевать связь с генетикой саркоидоза.

Уровни 8-изопростана не имели корреляции с легочной функцией. Этот результат также был ожидаем, так как уровни маркеров окислительного стресса отражают процесс, продолжающий во время измерения, в то время как легочная функция отражает результат процессов, происходивших ранее во времени. Это наблюдение согласуется с исследованием Montuschi (11, 14). Возможно этой причине, мы не могли обнаружить корреляцию уровней 8-изопростана с рентгенографической стадией саркоидоза.

Анализ выдыхаемого воздуха в течение последних лет привлек к себе внимание, потому что он представляет абсолютно атравматичный метод получения исследовательского материала непосредственно из органов дыхания. Подобные исследования были проведены при различных болезнях легкого (19, 20). Было показано, что уровни окислительного стресса, такие как H₂O₂ или 8-изопростан, отражают интенсивность воспаления при астме (14, 21) ХОБЛ (22, 23), бронхоэктазах (24), муковисцидозе (25), остром респираторном дистресс синдроме (26, 27) и при табакокурении (23, 28).

Наши результаты позволяют предположить, что уровни 8-изопростана в выдыхаемом воздухе могут использоваться как индекс активности болезни при легочном саркоидозе. Некоторые из предложенных маркеров активности саркоидоза требуют обнаружения изменений при последовательно проведенных тестах, чтобы классифицировать болезнь как активную или бездействующую, но измерение 8-изопростана в выдыхаемом воздухе может позволить более быстро и точно обнаружить активную болезнь. Этот маркер может отражать активность болезни как в дыхательных путях так и легочной паренхиме, так как саркоидоз может поражать дыхательные пути в 62 % случаев (29). В этом исследовании мы не проводили длительного наблюдения наших пациентов, поэтому мы не знаем о ''поведении'' этого индекса в течение болезни. Эта проблема может быть изучена в дальнейшем.

Если будет доказано, что 8-изопростан является хорошим маркером прогресса болезни при легочном саркоидозе, возникает вопрос, превосходит ли измерение уровней 8-изопростана в выдыхаемом воздухе измерение 8-изопростана в БАЛ. Явное преимущество этого метода состоит в том, что он является абсолются атравматичным и может быть повторен в любое время в течение болезни, в то время как получение БАЛ требует проведения бронхоскопии. С этой точки зрения, этот метод был бы очень удобен для контроля курса болезни или ответа на терапию. Кроме того, в отличие от БАЛ, который отражает события, происходящие только в части легкого, и не захватывает события в дыхательных путях, измерение 8-изопростана в выдыхаемом воздухе позволяет отразить процессы, происходящие во всем легком. Чтобы сравнить эти два метода и их возможную роль в исследовании легочного саркоидоза необходимы дальнейшие исследования.

Большинство наших пациентов не получало кортикостероидную терапию. Пациенты, у которых проводилась терапия (n = 9), получали низкие дозы кортикостероидов, и это может быть причиной, по которой три пациента имели признаки активности болезни. Эти три пациента имели уровни 8-изопростана, подобные или даже более высокие, чем уровни у остальной части группы с активной болезнью. Число этих пациентов не было достаточно большим для проведения отдельного анализа, и дальнейшие исследования должны определить роль кортикостероидов в экспрессии окислительного стресса при саркоидозе.

Термин ''активность'' до настоящего времени окончательно не определен. При саркоидозе, из-за изменчивости патологической картины и вовлечения различных систем, было предложено множество маркеров активности, каждый из которых оценивал один аспект развития болезни (30, 31). Определение активности, которое использовалась для саркоидоза, является описательным и довольно неточным, если его использовать для строгого определения, какие пациенты являются ''активными'', а какие нет. Одной из причин этой неопределенности может быть большое число предложенных маркеров активности, которые часто несоответствуют друг другу. Другой причиной может быть то, что ''активность'' не коррелирует с прогнозом, ответом на терапию или потребностью в лечении. По этой причине, ''активность'' имеет ограниченную клиническую ценность при саркоидозе (32, 33). Для целей нашего исследования, мы категоризировали в группу с активной болезнью пациентов, которые имели любой признак активной болезни, согласно маркерам активности, описанным выше, в группу с неактивной болезнью попадали пциенты, не имевшие ни одного из этих признаков. Конечно, эта классификация является эмпирической и не может использоваться как ''определение'' активности.

Маркеры, которые мы использовали, обычно используются в нашем институте для оценки и наблюдения саркоидоза. Эти маркеры ориентированны клинически: они предназначены, чтобы оценить воздействие саркоидоза на системы, которые наиболее сильно затрагивают активность пациента и качество жизни, или могут вести к внезапной смерти (7, 31). В результате, использование этих маркеров для оценки связи между активностью воспалительного процесса при саркоидозе и окислительным стрессом имеет ограничения, потому что может недооценивать активность болезни. Например, поскольку мы не выполнили исследования БАЛ у пациентов с ранее диагностированным саркоидозом, мы не можем исключать продромальный лимфоцитарный альвеолит, который переместил бы некоторых пациентов из группы с неактивной болезнью в группу с активной болезнью. В клинической практике, у бессимптомного пациента с отрицательной клинической и лабораторной оценкой для саркоидоза мы не выполняем бронхоскопию и БАЛ, чтобы исключить возможность продромального воспаления. Даже если такое воспаление существует, это не будет изменять режим лечения.

В настоящее время, ''клиническая активность'' рассматривается как лучший способ оценить активность при саркоидозе (31). Как было упомянуто ранее, одним из ограничений этого исследования было то, что мы не проводили длительного наблюдения с измерением 8-изопростана. Исследование относительно небольшой группы пациентов в течение небольшого промежутка времени, возможно, внесло ошибку в наши результаты. Ценность измерения 8-изопростана при саркоидозе должна быть исследована в большей группе пациентов, с различными стадиями в течение болезни и в связи с потребностью в терапии и отдаленным прогнозом.