Экспериментальный кожный саркоидоз у добровольца

Экспериментальный кожный саркоидоз у добровольца

E. Kalfin M. D., Ph. D.
Laboratory of Microbiology State University Hospital of Pulmonary Diseases ''St. Sofia''

Причинный агент саркоидоза не удалось обнаружить в течение более 100 лет. Ткань легкого пациента с саркоидозом (синдром Лёфгрена) использовалась, чтобы изолировать эритроцит-подобные микроорганизмы (ELM) на кровяном агаре человека. Через 5 месяцев инкубации при 37°C ткань была введена добровольцу с целью воспроизвести экспериментальный кожный саркоидоз. Через 2 года на участке введения развились типичные саркоидные гранулемы с положительным тестом Квейма. Для развития экспериментального кожного саркоидоза потребовались два введения суспензии, содержащей 1 миллион колониеформирующих единиц (CFU) с интервалом 7 дней. Наличие саркоидных гранулем при биопсии кожи было подтверждено четырьмя независимыми специалистами. Биопсийная ткань и культуры ELM могут быть предоставлены любому специалисту, который специализируется на ПЦР при саркоидозе и болезни Крона.

В течение более 100 лет в литературе опубликовано множество сообщений относительно саркоидоза (1). Однако, об экспериментальном саркоидозе ранее никогда не сообщалось.

Эксперименты на животных бесполезны, так как саркоидоз - болезнь человека. Это означает, что для воспроизведения экспериментального саркоидоза необходимы эксперименты на добровольцах. Причинный агент саркоидоза может быть обнаружен в саркоидных гранулемах, поскольку причинный агент туберкулеза может быть обнаружен в туберкулезных гранулемах. Проблема состоит в том, что причинный агент саркоидоза имеет иной внешний вид и свойства, чем Mycobacterium tuberculosis и все другие известные микроорганизмы. Этот неизвестный микроорганизм не может размножаться на известных к настоящему времени питательных средах.

В мае 1993 г. у 31-летней женщины с саркоидозом (синдром Лёфгрена) был выполнена трансбронхиальная биопсия легкого. Биопсийный материал был измельчен в 1 мл стерильной дистиллированной воды и автор ввел себе 0.5 мл этого раствора в левое предплечье. Остальные 0.5 мл раствора использовались для посева на кровяной агар человека, агар Сабуро (Sabouraud agar) и кровяной агар овцы, которые культивировались при 35°C в течение 5 месяцев.

Результат введения гистологического препарата легкого в левое предплечье автора был отрицательным. K. sarcoidosis впервые была обнаружена 23 октября 1993 г. через пять месяцев инкубации при 35°C на препарате кровяного агара человека, окрашенного по Грамму, но не на агаре Сабуро и кровяном агаре овцы. При изучении с помощью светового микроскопа, K. sarcoidosis имела дрожже-подобный вид. Также имелись группа из нескольких дрожже-подобных микроорганизмов (Рис. 1). В саркоидных гранулемах наблюдались несколько дрожже-подобных телец Hamazaki-Wesenberg (рис. 2).


Рис. 1. ELM. Маслянная иммерсия.	Рис. 2. Тельца Hamazaki-Wesenberg в саркоидных гранулемах. Маслянная иммерсия.

Фотографии, сделанные с помощью электронного микроскопа демонстрируют, что K. sarcoidosis имеет морфологию, иную чем все микроорганизмы, известные к настоящему времени. K. sarcoidosis не имеет видимого ядра или клеточной стенки. Иногда можно заметить микроорганизмы с несколькими белыми включениями (рис. 3) идентичные белым включениям в желто-коричневых тельцах саркоидных гранулем (рис. 4). Более молодые микроорганизмы имеют меньший размер и содержат пилли (pilli), которые показывают, что это не эритроциты (рис. 4).


Рис 3. ELM. Электронная микроскопия.	Рис. 4. Желто-коричневые тельца в саркоидных гранулемах. Электронная микроскопия.

Автор ввел себе приблизительно 1,000,000 CFU K. sarcoidosis подкожно в переднюю часть правой ноги. После инокуляции кожа оставалась нормальной в течение недели. Это было причиной второй аутоинокуляции с той же самой дозой микроорганизма. Однако, на сей раз введение производилось внутрикожно. После второй аутоинокуляции развилась немедленная реакция с зудящией, красной кожной папулой диаметром 10 мм, похожая на укус насекомого. Мы полагаем, что это была аллергическая реакция немедленного типа.

Через несколько часов кожа стала нормальной. Только через 25 дней на коже развилось фиолетовое образование диаметром 8-10 см. В середине фиолетового образования имелось красное пятно диаметром 3 см. Через 35 дней цвет кожи стал нормальным и была выполнена биопсия кожи. При гистологической экспертизе были найдены саркоидные гранулемы (Рис. 5, 6).


Рис. 5, 6. Саркоидные гранулемы при экспериментальном кожном саркоидозе

Чтобы выделить K. sarcoidosis из биопсийного материала, проводилось культивирование на среде с добавлением 10 % человеческой крови. После инкубации в течение 3 месяцев при температуре 35° С, окрашивание по Грамму показало наличие сферических колоний K. sarcoidosis.

K. sarcoidosis как специфический антиген в тесте Квейма

Через 2 года после начала эксперимента, культура K. sarcoidosis была разведена в стерильной дистиллированной воде и приблизительно 10,000,000 CFU были зафиксрованы в 0.4 % формалине и через 3 дня использовались как антиген для проведения теста Квейма у автора. Через 2 месяца была выполнена биопсия кожи и вновь были обнаружены саркоидные гранулемы (Рис. 7, 8).


Рис. 7, 8. Саркоидные гранулемы при тесте Квейма

K. sarcoidosis может быть культивирована только на человеческом кровяном агаре. Колонии были обнаружены после окрашивания препарата по Грамму. Новый микроорганизм имел вид дрожже-подобных клеток. Субкультуры K. sarcoidosis на различных средах (тиогликолат, агар Сабуро и другие) не демонстрировали роста, если к среде не было добавлено 5-10 % человеческой крови. Наблюдения с помощью стереомикроскопа показали, что колонии K. sarcoidosis на человеческом кровяном агаре меньше, чем колонии M. Pneumoniae. Микроколонии были серыми, плоскими или рельефными.

Идентификация нового микроорганизма в определенном смысле является легкой. В литературе не описано никаких иных микроорганизмов, которые не растут на кровяном агаре овцы и быстро формируют невидимые колонии только на человеческом кровяном агаре. Результаты могут быть получены через 20-30 дней при окрашивании по Грамму.

Субкультуры K. sarcoidosis в человеческой крови были исследованы на электронном микроскопе, чтобы изучить циклы развития нового микроорганизма. Было обнаружно, что K. sarcoidosis вероятно использует мимикрию. Было отмечено, что K. sarcoidosis может находится внутри человеческих эритроцитов и имеет вид ядра (4). Однако, затем “ядро” выталкивается и мы наблюдали безъядерные клетки, абсолютно подобные окружающим эритроцитам (мимикрия). Некоторые фотографии показывают, что K. sarcoidosis имеет циклы развития и может проникать через стенку эритроцитов.

Эксперимент по аутоинфекции тканью легкого, полученной при трансбронхиальной биопсии, содержащей саркоидные гранулемы, был неудачным. Возможными объяснениями являются малое количество причинного агента саркоидоза внутри гранулем и низкая вирулентность этих микроорганизмов. Второй эксперимент с 1,000,000 CFU чистой культуры K. sarcoidosis был успешным и произвел саркоидные гранулемы.

Эксперимент показал, что человеческая кровь - ключевой пункт при культивировании причинного агента саркоидоза. Культивирование в среде кровяного агара человека позволило изолировать K. sarcoidosis из биопсийной ткани легкого, в то время как эксперимент по аутоинфекции потерпел неудачу, поскольку гранулемы содержат очень маленькое число K. sarcoidosis. Мы полагаем, что ELM является причинным агентом саркоидоза и болезни Крона. Однако, для доказательства этой гипотезы необходима ПЦР.

K. sarcoidosis удовлетворяет постулатам Генле-Коха, этот организм может быть изолирован в чистой культуре из саркоидных гранулем, экспериментальный саркоидоз был воспроизведен при введении чистой культуры и тот же самый микроорганизм был изолирован из ткани экспериментального кожного саркоидоза у добровольца. K. sarcoidosis - реально существующий антиген, поскольку в тесте Квейма он производил типичные саркоидные гранулемы в коже автора.

Относительно новой группы микроорганизмов имеется много нерешенных проблем:

Мы полагаем, что различные типы ELM имеют общие антигены к M. tuberculosis и М. Bovis. Это объясняет, почему M. bovis (БЦЖ) может использоваться как вакцина против туберкулеза и почему K. sarcoidosis, смешанная с ELM (в составе нормальной флоры крови) может производить экспериментальный кожный саркоидоз у человека.

Культивирование ELM невозможно без нативной человеческой крови. Только человеческая кровь может использоваться для получения субкультур, потому что ELM всегда присутствуют в человеческой крови.

Культивирование ELM требует времени и этот факт объясняет, почему большинство эритроцитов у пациентов с саркоидозом является нормальными.

Эксперименты по аутоинфекции в литературе по саркоидозу не описаны и они должны быть разработаны специалистами. Окрашенные препараты будут сохраняться в течение 30 лет в NBIMCC 3300, 1995, Kalfinella sarcoidosis sp. Novo.