The Internet Journal of Microbiology 2009 : Volume 6 Number 2

E. Kalfin M.D., Ph.D.
Laboratory of Microbiology, State University Hospital of Pulmonary Diseases, Sofia Bulgaria

Реферат

S. J. Lu, Q. Feng, J. S. Park, Vida L, Lee BS, Strausbauch M, Wettstein PJ, Honig GR, Lanza R (1) сообщили, что эритроциты, произведенные in vitro в культуре эмбриональных стволовых клеток теряют ядро и становятся безъядерными клетками, подобными эритроцитам человеческой крови. Причина этого явления не была обнаружена, однако, гипотеза, что ''ядро'' эритроцита является неизвестным микроорганизмом, который является частью флоры нормальной крови, поддержана нашими экспериментами.

Введениие

В октябре 1992 г. в Referent laboratory for tuberculosis bacteria, Higher Medical Institute, Sofia, при проведении экспериментов по изоляции агента, вызывающего саркоидоз, в безъядерных эритроцитах человеческой крови были открыты ранее неизвестные микроорганизмы (2). Впервые было выполнен культивирование на человеческом кровяном агаре, обычно не используемом в микробиологии по этическим причинам (3). Мы наблюдали неизвестные, медленно растущие микроорганизмы, которые являются частью флоры нормальной крови, которые назвали эритроцит-подобными микроорганизмами (ELM). ELM были культивированы в течение 5 месяцев в различных средах. При электронной микроскопии, формирование колоний ELM на агаре Сабуро и кровяном агаре овцы не наблюдалось. Попытки уничтожить ELM уксусной, серной, соляной и азотной кислотой, гидроокисью натрия и калия были неудачны.

Обзор медицинской литературы показал, что в крови здоровых индивидуумов многие авторы наблюдали различные микроорганизмы, такие как плеоморфные бактерии (4), бактериальную рибосомную ДНК (5), микоплазмы или L-формы (6, 7), неизвестные патогенные микроорганизмы (8), фильтрующиеся формы (9), новые бактериальные структуры (10) и персистирующие бактерии (11). Эти микроорганизмы были интерпретированы как нестабильные L-формы Staphylococcus epidermidis, дифтероиды, кокки или листерии. Описанные микроорганизмы были изолированы у здоровых и больных индивидуумов, однако не было разъяснено, являются ли они причиной болезни или являются частью флоры нормальной крови.

Метод культивирования ELM

100ml BBLВ^® с 0.25 % цитратом натрия и 0.1 % витамином K3 в стерильных пробирках 2.0 и 4.5 мл были стерилизованы в автоклаве при 121°C в течение 15 минут. 0.2 или 0.5 мл венозной крови были добавлены пробирку, содержащую 2 или 4.5 мл описанной выше жидкой среды. Культивирование производилось в течение 72 часов при 43°C.

Результаты

Культивирование ELM

1 г/л витамина K3 - мощный фактор роста ELM. Оценка роста культур ELM могла быть выполнена через 48-72 часа вместо обычного 21 дня. Необычный эффект высокой концентрации витамина K3 был обнаружен опытным путем и пока еще не объяснен. При окрашивании по Грамму наблюдались дрожже-подобные клетки, расположенные вне эритроцитов.

Рост ELM на агаре также стимулировался 1 г/л витамина K3. Размер колоний был намного больше и был сравним с колониями других микроорганизмов. Колонии ELM были прозрачными и при интесивном росте темнели. Для культивировании на агаре был необходим период 3-4 недели и температура 43°C.

Морфология ELM

Электронная микроскопия показала, что при неблагоприятных внешних условиях микроорганизмы имеют дрожже-подобную форму, в то время как при их росте в человеческих эритроцитах они могут иметь дрожже-подобную или хламидия-подобную форму.

При электронном микроскопии микроорганизмы имеют вид гомогенных сферических клеток, без признаков ядра и клеточной стенки. Клеточная поверхность имеет множественные тонкие пилли, сильнее выраженные у более молодых микроорганизмов.

Рост колоний дрожжи-подобных форм может происходить при простом делении материнских клеток с последующим объединением протоплазмы или при формировании кластеров и слиянии нескольких отдельных клеток. Вероятно, дрожжи-подобные формы ELM могут существовать в виде спор при неблагоприятных условиях внешней среды, например при высыхании крови.

При электронной микроскопии, хламидия-подобные формы могут быть замечены внутри и вне эритроцитов, как клетки с расположенным внутри образованием, походящими на ядро. Это образование может спонтанно ''выталкиваться''. В эритроцитах можно обнаружить как ядерные, так и неядерные клетки, последние походят на элементарные и ретикулярные тельца хламидий. При электронной микроскопии была обнаружена способность ELM проникать через стену эритроцита, делая ее более толстой. Наличие каналов на стенке эритроцита не могло быть оценено из-за недостаточного усиления микроскопа.

Мимикрия ELM

Термин ''мимикрия'' не используется в учебниках микробиологии, поэтому результаты электронной микроскопии, показывающие подобие между новыми микроорганизмами и эритроцитами, уникальны. ELM могут быть обнаружены среди эритроцитов как маленькие безъядерные эритроциты. Дискриминация этих двух видов клеток может быть сделана при оценке их размеров: новые микроорганизмы имели размер 0.3- 2.6 мкм, в то время как эритроциты были значительно больше, от 3.5 до 7.5 мкм.

Биохимические характеристики ELM

Никакой специфической биохимической активности у дрожже-подобных форм ELM обнаружено не было. Кислота или газы из глюкозы, мальтозы, сахарозы и лактозы не производились. Тесты на уреазу, лизин декарбоксилазу и каталазу были положительны, но тесты на орнитин декарбоксилазу, индол и сероводород были отрицательны.

ELM были резистентены к антибиотикам, используемым в рутинной клинической практике. Поиск специфических антибиотиков, пригодных для лечения болезней, вызванных ELM, был слишком дорог для нашей лаборатории.

Рост ELM ингибировался полианетолсульфонатом натрия (SPS). Однако, после удаления SPS из культуральной среды, которую обычные исследования оценили как стерильную, происходил дальнейший рост ELM.

Происхождение ELM

Возможность внутриматочной трансмиссии ELM в эмбриональные эритроциты была доказана исследованиями плацентарной крови. Возможно ли обнаружить ELM в эмбриональных стволовых клетках и в неядерных эритроцитах остается неизвестным.

Патогенность ELM для человека

Интенсивный рост и нетипичная локализация ELM могут быть причиной болезни (14,15,16,17). Исследование различных форм анемии у 20 пациентов в клинике профессора Петрова (2-я городская больница, София), показало, что интенсивный рост ELM наблюдался только у 2 пациентов, что возможно было причиной серьезной железодефицитной анемии. Наблюдение 20 пациентов в отделении интенсивной терапии (профессор Османлиев, Higher Medical Institute, Sofia), показало интенсивный рост ELM у одного пациента с хронической пневмонией, которая была резистентна к антибиотикам.

Генетический анализ ELM

Хотя ELM были открыты еще 1992 г., генетический анализ этих микроорганизмов в Болгарии не проводился из-за отсутствия средств. Чистая культура, изолированная в Болгарии была послана в NBIMCC, где была лиофилизирована и будет хранится в замороженном виде в течение 30 лет под названием Kalfinella bulgarica gen.nov. 3300.

Было обнаружено, что ELM, изолированные экспертами BAS и NCIPD, непригодны для анализа ДНК из-за невозможности разрушения генома (17). Из-за ограниченных финансовых возможностей NBIMCC, мы обратились к специалистами CDC, института Пастера, ECDPC и RAS и к 182 исследователям из США, Англии, Франции, Германии и 44 других стран с просьбой помочь провести генетические исследования. Однако, мы не получили ответа.

Генетический анализ, являющийся основой современной микробиологии, мог быть выполнен только после того, стал известен метод изоляции ELM из культуры в питательной среде. В 2008 г. была сформирована команда ученых, из трех стран. Расшифровка генетической структуры ELM успешно продвигается, исследование предполагается закончить в конце 2008 г. В 2009 г. детальный анализ ДНК K. bulgarica gen.nov. будет доступен через интернет.