Am. J. Respir. Crit. Care Med., Volume 159, Number 6, June 1999, 1981-1984

Анализ реактива Квейма - Зильцбаха на наличие бактериальной ДНК

ELVIRA RICHTER, Y. P. KATARIA, G. ZISSEL, J. HOMOLKA, M. SCHLAAK, J. MULLER-QUERNHEIM
Research Centre Borstel, Medical Hospital, and National Reference Center for Mycobacteria, Borstel, Germany; Pulmonary and Critical Care Section, Department of Medicine, East Carolina University School of Medicine, Greenville, North Carolina; and First Lung Department, Charles University, Prague, Czech Republic

Реферат

Реактив для теста Квейма - Зильцбаха (KST = Kveim-Siltzbach test) позволяет выявить саркоид-специфический гранулематозный кожный ответ, по которому обычно устанавливается диагноз саркоидоз. В контексте продолжающегося обсуждения бактериальной причины саркоидоза, мы исследовали вопрос, могла бы бактериальная ДНК содержаться в реактиве KST. Для этой цели два различных реактива KST, идентично подготовленных из ткани здоровой селезенки и саркоидной селезенки были проанализированы с помощью полимеразной цепной реакцией (ПЦР) для обнаружения бактериальной рибосомной 16S РНК. Исследования реактива KST и контрольного образца показали, что реактивы не имеют бактериального загрязнения. Поскольку реактив KST производит гранулему, эти результаты не поддерживают гипотезу бактериальной причины саркоидоза.

Введение

Реактив, приготовленный из ткани селезенки или лимфатических узлов пациентов с саркоидозом, обычно называемый антигеном Квейма, является единственным реактивом, выявляющим саркоидоз-специфический ответ in vivo (1, 2). У пациентов с саркоидозом приблизительно через 4 недели после внутрикожного введения антигена Квейма, развивается неказеозная гранулема, идентичная саркоидным гранулемам. Эта реакция, названная по имени авторов Ансгара Квейма и Луиса Зильцбаха, может использоваться, чтобы установить диагноз саркоидоза (3, 4), однако, активная составляющая реактива все еще остается неустановленной.

Было приложено много усилий, чтобы установить механизм действия KST in vitro, однако, окончательных результатов получено не было (5). Исследования позволяют предположить участие белка или белков (6) расположенных в иммунных клетках или мембранных фрагментов этих клеток (7). Ввиду того факта, что предлагаются гипотезы бактериальной (8), медленно растущей (slow-growing) бактериальной (9) или микобактериальной (10) этиологии саркоидоза, мы исследовали реактив KST на присутствие бактериальной ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения бактериальной рибосомной 16S РНК, чтобы получить информацию о возможном бактериальном механизме действия KST. Недавно, с использованием этого технического подхода было обнаружено отсутствие микобактериальной ДНК в саркоидных повреждениях (11).

Методы

Реактив KST и контрольный реактив

Реактив KST был куплен в Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Wiltshire, United Kingdom. Второй реактив KST и контрольный реактив из здоровой селезенки (CSP) были подготовлены согласно оригинального протокола (2), но добавление фенола для консервации было опущено. Реактив KST, используемый в нашем исследовании был KST реактив Тип 1, с концентрацией 6 mg/ml осажденных этиловым спиртом белков, разбавленных фосфорнокислым буферном солевом раствором. Пенициллин / стрептомицин (100 µg/ml) и фунгизон (250 ng/ml) были добавлены как фиксаторы. CSP был подготовлен согласно того же протокола. Реактивы сохранялись при - 70°C. Было показано, что подготовленный таким способом реактив саркоидной селезенки уступает оригинальному диагностическому реактиву KST (7, 12). Оба реактива KST были проанализированы с помощью ПЦР без дальнейшей очистки.

ДНК из саркоидной селезенки

Экстракция ДНК проводилась из образцов селезенки другого пациента с саркоидозом полученных при спленэктомии, проведенной из-за тромбоцитопении. Образцы были культивированы в трис-буфере титрованном 50 мм HCl (pH 7.4) (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) с 1 % додецилсульфатом натрия (SDS) в течение от 1 до 2 часов при 37°C. Затем образцы были поочередно культивированы в водяной бане при 100° C в течение 1 минуты и заморожены в течение 1 минуты в жидком азоте 4 раза. ДНК была очищена с помощью экстракции фенолом / хлороформом, осаждена изопропиловым спиртом, повторно разбавлена в трис-буферном растворе (pH 8.0) и сохранялись при - 70°C.

Результаты

Чувствительность протокола усиления была проверена с помощью последовательного разведения суспензии, содержащей известное количество ДНК Escherichia coli. По крайней мере 10 геномов дали положительный результат усиления. Дополнительные эксперименты, оценивающие чувствительность ПЦР показали, что в присутствии от 1 до 2 µl реактива KST чувствительность ПЦР была от 100 до 200 организмов E. coli; в присутствии 5 µl реактива KST было необходимо 1,000 организмов.

При проведении ПЦР никакая бактериальная ДНК не была усилена. Анализ фенолизированного KST и KST из саркоидной селезенки с помощью того же самого протокола дал идентичные результаты.

Обсуждение

ПЦР была выполнена, чтобы усилить фрагмент ДНК, кодирующей рибосомную 16S РНК, которая является частью бактериальной рибосомы. Чувствительность этого метода позволяет обнаружить небольшое число бактерий (приблизительно 100 геномов даже в присутствии от 1 до 2 µl KST) и сопоставима с чувствительностью методов, использованых при поиске бактериальной ДНК в саркоидых гранулемах и бронхоальвеолярном лаваже (11,15,16). Однако, реактив KST - сконцентрированный экстракт ткани селезенки и содержание действующего начала в реактиве изменяется от партии к партии. Из-за этого, прямое вычисление по первоначальной массе ткани селезенки, отраженной в нашем подходе оценить трудно. Грубая оценка показывает, что 4 µg реактива KST можно экстрагировать из 10 µg ткани селезенки (фактор концентрации 2.5). Это означает, что 2 µl реактива KST представляет 30 µg ткани селезенки, которая может содержать менее 100 геномов, то есть, приблизительно < 3*10⁵ бактерий в 100 милиграммах ткани. В экспериментальных инфекциях такая бактериальная масса может быть достигнута при использовании авирулентных микобактерий без развития системной болезни (17). Однако, полученные отрицательные результаты не поддерживают гипотезу, что кожные гранулемы на месте введения реактива KST вызваны бактериями. Однако, возможность того, что бактериальные продукты, такие как суперантигены или мембранные фрагменты (9) стимулируют эти реакции, не может быть исключена.

Если мы принимаем во внимание факт, что реактив KST используется для анализа гранулематозной реакции при саркоидозозе (18), необходимо рассмотреть специфичность KST. Реактивы были проверены и получено несколько ложноположительных результатов (3, 4, 19). Однако, при болезни Крона (20), лепроматозной лепре (21), гранулематозном хейлите (22), эозинофильной пневмонии (23), синдроме Мелькерсона - Розенталя (24) и в животных моделях гранулематозных болезней (25), наблюдалась положительная реакция на KST. Кроме того, некоторые контрольные реактивы из здоровой селезенки вызывали положительные реакции у пациентов с саркоидозом (26). Другие группы не могли воспроизводить эти ''неспецифические'' положительные результаты (27). Чтобы увеличить специфичность теста, для диагностических целей использовались только высоко специфические партии реактива (2).

Public Health Laboratory Service of the United Kingdom изготавливает клинически утвержденный реактив KST, используемый для диагностических целей, который содержит фенол в качестве фиксатора. ПЦР этого реактива дала отрицательные результаты, принимая во внимание, что контрольная реакция показала увеличение гена бета-актина, демонстрируя присутствие ДНК человека. Ложноотрицательный результат реакции из-за использования фенола не мог быть исключен. Однако, нефенолизированный реактив не был доступен в Public Health Laboratory Service of the United Kingdom. По этой причине, нефенолизированный KST реактив был подготовлен в East Carolina University School of Medicine, Greenville и проверен, используя идентичную методику ПЦР и также показал негативные результаты. Использование этого KST реактива, как известно, дает высоко специфические результаты для диагностических и исследовательских целей (7, 12). Идентично подготовленный реактив из здоровой селезенки также дал отрицательные результаты при ПЦР. Тот же результат был получен от при исследовании дополнительного реактива из саркоидной селезенки, таким образом последовательно демонстрируя отицательные результаты.

Исследования Williams и Nickerson (28) и Квейма (1), в котором наблюдалась реакция Квейма, высказывалась гипотеза, что саркоидоз вызван инфекционным возбудителем и что специфический иммунный ответ против этого агента, походящий на туберкулин-подобную реакцию, мог быть индуцирован при введении реактива Квейма. Хотя эта гипотеза все еще дебатируется (10), инфекционный возбудитель для саркоидоза остается не идентифицированым. Должно быть отмечено, что реактив KST стимулирует гранулематозное воспаление через 3-6 недель, но без любой сопутствующей туберкулин-подобной реакции.

Многочисленные иммунобиологические исследования, особенно имеющие дело с лимфоцитами, показали, что большинство иммунных характеристик саркоидной реакции является общими с нормальной иммунной реакцией, поддерживая гипотезу инфекционной этиологии саркоидоза (18, 29). Факт, что бактериальная ДНК не была найдена в реактиве KST или в саркоидных повреждениях говорит о том, что, если саркоидоз имеет инфекционную этиологию, любые бактерии или вирусы могут быть триггерами саркоидного ответа, который может поддерживаться аутоиммунным или перекрестным иммунным ответом хозяина после того, как триггер был уничтожен, как было продемонстрировано для инфекционного артрита (9). Это предположение поддержано исследованиями, указывающими, что действующее начало реактива KST имеет белковую природу (6, 30).