Thorax 1997;52:76–83

Производство простагландина E2 и лейкотриена B4 альвеолярными макрофагами у пациентов с саркоидозом

Virginia De Rose, Livio Trentin, Maria T Crivellari, Angiolo Cipriani, Giuliana Gialdroni Grassi, Ernesto Pozzi, Giancarlo Folco, Gianpietro Semenzato
Department of Clinical and Biological Sciences, Respiratory Disease Division, University of Turin, Italy, Department of Clinical Medicine, First Medical Clinic leukoand Clinical Immunology Branch, University of Padua, Italy, Institute of Pharmacological Sciences, University of Milan, Italy, Institute of Respiratory Diseases, University of Pavia, Italy

Реферат

Медиаторы, произведенные альвеолярными макрофагами, являются важными факторами модуляции местных иммунных процессов при саркоидозе. Среди медиаторов, производимых альвеолярными макрофагами, метаболиты арахидоновой кислоты известны как регуляторы воспалительных и иммунных реакций. Было предположено, что циклооксигеназа и метаболиты арахидоновой кислоты модулируют развитие гранулематозного воспалительного ответа в легком по-разному. Методы: альвеолярные макрофаги из бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) 32 пациентов с саркоидозом в различных стадиях активности болезни и 10 здоровых индивидуумов были оценены на способность производить простагландин E2 (PGE2) и лейкотриен B4 (LTB4). Альвеолярные макрофаги были культивированы в присутствии или отсутствии опсонизированного зимосана (500 lg/ml). Уровни PGE2 и LTB4 в супернатанте были определены с помощью иммунферментного анализа (EIA). Результаты: стимулированные альвеолярные макрофаги пациентов с активным саркоидозом производили более высокие уровни LTB4, чем альвеолярные макрофаги в группе контроля, но никаких различий в производстве PGE2 между этими двумя группами не наблюдались. Изучение временного профиля производства LTB4 активизированными альвеолярными макрофагами показало, что производство LTB4 активизированными клетками пациентов с саркоидозом заметно увеличивалось после 60 минут культивирования, оставаясь увеличенным в течении 24 часов. Индометацин (3.10-6 M) вызывал ожидаемое ингибирование производства PGE2 без воздействия на производство LTB4. Заключение: эти результаты говорят, что альвеолярные макрофаги БАЛ пациентов с активным саркоидозом производят LTB4, что может вносить вклад усиление иммунной реакции.

Введение

Саркоидоз - мультисистемная хроническая гранулематозная болезнь неизвестной этиологии, характеризованная усилением иммунных процессов на участках активности болезни (1). В частности, происходит привлечение и активация иммунокомпетентных клеток (альвеолярные макрофаги и T-клетки) в альвеолярные структуры. После активизации, эти клетки приобретают широкий спектр эффекторных функций, включая секрецию различных медиаторов, которые играют важную роль в развитии и модуляции местных иммунных процессов при саркоидозе (1-3).

Среди секретируемых альвеолярными макрофагами продуктов, метаболиты арахидоновой кислоты, как известно, регулируют воспалительные и иммунные реакции (3-5). Хотя в последнее время интерес к иммуномодуляционной роли этих метаболитов увеличился, очень немногие исследования определили характеристики метаболизма арахидоновой кислоты при болезнях легкого (6-12).

Арахидоновая кислота - один из наиболее широко представленных липидов клеточной мембраны у макрофагов и моноцитов. Ее метаболизм происходит двумя основными путями: (1) путь циклооксигеназы, ведущий к формированию простагландина и тромбоксиназы и (2) путь липоксигеназы, ведущий к формированию гидроксиэйкозотетраеновой кислоты и лейкотриенов (LT) (13). Несколько исследований предложили, что эти продукты имеют модуляционный эффект на клеточные иммунные реакции. Простагландин E (PGE) подавляет различные функции лимфоцитов, например пролиферацию Т-лимфоцитов (14) и секрецию лимфокинов антиген-активированными лимфоцитами (15) а также ингибирует экспрессию Ia антигена на макрофагах (16). Роль липоксигеназы в регулировании клеточных иммунных реакций более сложна и зависит от местных иммунных условий (17). Однако, лейкотриены и другие производные липоксигеназы, как известно, обладают мощным провоспалительным действием, модулируют проницаемость сосудов (LTC4, LTD4), привлечение и активацию фагоцитов (LTB4) (5, 18).

Кроме того, несколько исследований обнаружили, что метаболиты арахидоновой кислотны, производимые альвеолярными макрофагами могут участвовать в модуляции гранулематозного воспаления в легком (6, 19, 20). Сообщалось, что экзогенный PGE1 может подавлять индуцированное шистосомами формирование гранулем в легких мышей (19). Подобный эффект был получен при использовании ингибиторов липоксигеназы, которые дозозависимо подавляли развитие легочных гранулем (20).

Мы выдвинули гипотезу, что дисразбаланс метаболитов арахидоновой кислотны, произведенной альвеолярными макрофагами, может происходить при саркоидозе и участвовать в модуляции гранулематозного ответа при этой болезни. Чтобы проверить эту гипотезу, мы исследовали способность альвеолярных макрофагов производить PGE2 и лейкотриен B4 (LTB4) in vitro у пациентов с саркоидозом в различных состояниях активности болезни и сравнили эту способность с нормальными альвеолярными макрофагами.

Методы

Пациенты

Исследуемая группа состояла из 32 пациентов с саркоидозом (18 мужчин) средний возраст 34.2 года. Диагноз саркоидоза был основан на клинических особенностях и гистопатологических результатах, совместимых с диагнозом саркоидоз. Другие гранулематозные болезни были исключены. Активность болезни была оценена согласно следующих критериев: (1) клинические результаты (недавнее развитие или прогрессирование респираторных симптомов, таких как кашель и одышка, или системных симптомов, таких как лихорадка, потеря веса, серьезная усталость или прогрессирующие ненормальности на рентгенограмме или ухудшение функции легкого в пределах последних трех месяцев); (2) процент лимфоцитов и абсолютное число T-клеток в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ); и (3) позитивный результат сцинтиграфии с цитратом галлия 67. Согласно этим критериям 18 пациентов имели активный саркоидоз, 14 пациентов имели неактивную фазу болезни. В первой группе, 10 пациентов имели рентгенографическую стадию I и 8 стадию II. Во второй группе 6 пациентов имели стадию I и 8 стадию II. Пациенты с активной болезнью были недавно диагностированы и на момент начала исследования имели среднюю продолжительность болезни 3.9 месяца.

Все пациенты имели признаки клинического ухудшения, определенные как ухудшение респираторных симптомов, прогрессирующее ухудшение рентгенограммы или функции легкого. Напротив, пациенты с бездействующей болезнью имели клинически стабильную болезнь средней продолжительностью 2.5 года, у них не проводилось лечение стероидами и не было респираторных симптомов, прогрессирующего ухудшения рентгенограммы или функции легкого. Все пациенты не курили, ни один не получил стероиды или нестероидные противовоспалительные средства в предыдущие 3 месяца. В группу контроля вошли 10 здоровых некурящих добровольцев (6 мужчин), средний возраст 39.2 года. Все они имели нормальную рентгенограмму и легочную функцию. Ни один не не принимал никаких лекарственных средств в последнее время.

Исследование соответствовало Хельсинкской Декларации и информированое согласие было получено у каждого пациента.

Результаты

Исследование БАЛ

Общее количество клеток, процент лимфоцитов и абсолютное число лимфоцитов было значительно увеличено в БАЛ пациентов с активным саркоидозом по сравнению с соответствующими значениями, полученными у пациентов с бездействующей болезнью и группой контроля (p < 0.001). Абсолютное число альвеолярных макрофагов было также значительно больше в БАЛ пациентов с активным саркоидозом по сравнению с пациентами с бездействующей болезнью (p < 0.01) и группой контроля (p < 0.05).

Производство PGE2 и LTB4

PGE2 и LTB4 были невыявляемы в супернананте до начала культивирования. Производство PGE2 нестимулированными альвеолярными макрофагами имело обнаруживаемые уровни только после 24-часового культивирования и подобный профиль наблюдался у стимулированных альвеолярных макрофагов.

Без стимуляции, клетки пациентов с саркоидозом и группы контроля производили низкие уровни эйкосаноидов. После стимуляции зимосаном наблюдалось значительное увеличение производства PGE2 клетками пациентов с саркоидозом и группы контроля (p < 0.05 и p < 0.001, соответственно) по сравнению с нестимулированными клетками. Никаких значительных различий в производстве PGE2 стимулированными или нестимулированными альвеолярными макрофагами между группами замечено не было.

Исследование кинетики производства LTB4 нестимулированными альвеолярными макрофагами показало, что более высокие уровни LTB4 были произведены в течение ранней стадии культивирования (30-120 минут) у пациентов с саркоидозом и группе контроля, с тенденцией к уменьшению в следующие 24 часа. Это уменьшение, однако, было статистически значимым только для нормальных альвеолярных макрофагов. Исследование кинетики производства LTB4 после стимуляции зимосаном, показало различное поведение нормальных альвеолярных макрофагов и альвеолярных макрофагов пациентов с саркоидозом. Нормальные альвеолярные макрофаги производили подобные уровни LTB4 в течение ранней и поздней стадии культивирования, в то время как производство LTB4 у пациентов с активным саркоидозом заметно увеличилось через 60 минут культивирования, оставаясь на высоком уровне в течение 24 часов.

Стимуляция зимосаном вызвала значительное увеличение производства LTB4 альвеолярными макрофагами пациентов с саркоидозом и группы контроля (p < 0.05 и p < 0.01, соответственно), по сравнению с нестимулированными клетками.

Стимулированные альвеолярные макрофаги пациентов с активным саркоидозом производили значительно более высокие уровни LTB4 чем альвеолярные макрофаги здоровых индивидуумов (активный саркоидоз, 8.82 ng/10⁶ клеток; группа контроля, 2.81ng/10⁶ клеток, p < 0.05), принимая во внимание, что никаких значительных различий не наблюдались между уровнями LTB4, произведенными альвеолярными макрофагами пациентов с бездействующей болезнью (6.01ng/10⁶ клеток) и группой контроля. Чтобы оценить, могут ли ингибиторы циклооксигеназы влиять на производство LTB4 альвеолярными макрофагами пациентов с саркоидозом, индометацин (3.10-6 M) был добавлен к культивированным клеткам за 30 минут до добавления опсонизированного зимосана.

Как ожидалось, в присутствии индометацина синтез PGE2 не наблюдался, даже после стимуляции зимосаном. Эти результаты говорят, что в присутствии индометацина, стимуляция зимосаном альвеолярных макрофагов пациентов с саркоидозом привело почти к полному ингибированию производства продуктов циклооксигеназы и не имело никакого влияниия на производство липоксигеназы.

Обсуждение

Наше исследование показало, что стимулированные альвеолярные макрофаги пациентов с активным саркоидозом производят значительно более высокие уровни LTB4 чем нормальные альвеолярные макрофаги. Напротив, никаких различий не наблюдались в производстве PGE2 между нормальными макрофагами и макрофагами пациентов с саркоидозом. Наши наблюдения совместимы с предыдущими исследованиями, показавшими, что стимулированные альвеолярные макрофаги кроликов, иммунизированных БЦЖ, производят большее количество LTB4 чем макрофаги неиммунизированных кроликов, в то время как производство простагландина было уменьшенным (26). Однако, наши результаты отличаются от данных Bachwich (6), который не обнаружил увеличение производства LTB4 альвеолярными макрофагами пациентов с саркоидозом и наблюдал уменьшение их способности производить метаболиты арахидоновой кислотны по сравнению с нормальными альвеолярными макрофагами.

Эти несоответствия могут быть объяснены следующим образом. Bachwich (6) оценивал метаболизм липоксигеназы у меньшего числа пациентов, только 2 из которых имели активную болезнь. Использовались различные условия культивирования и различные стимуляторы, метаболизм липоксигеназы был оценен после использования экзогенных арахидонатов. Большие различия в метаболизме экзогенных и эндогенных жирных кислот у нормальных и стимулированых клеток, были описаны Peters-Golden (27). Лейкотриены (особенно LTB4) были основными метаболитами эндогенной арахидоновой кислоты, произведенной при стимуляции, экзогенные арахидонаты метаболизируются преимущественно к продуктам циклооксигеназы и моно-HETE, но только минимально к лейкотриенам.

Полученные в настоящем исследовании результаты не отражают полное производство альвеолярными макрофагами этих метаболитов. По нашим данным, физиологически уместное внутриклеточное ''хранилище'' (intracellular storage site) для эйкосаноидов описано не было. Эйкосаноиды синтезируются de novo при взаимодействии различных стимулов с клеточной мембраной и немедленно диффундируют в окружающую среду. Однако, Damon (28) не наблюдал никаких значительных различий уровней LTB4, произведенных альвеолярными макрофагами здоровых индивидуумов и пациентов с астмой, принимая во внимание, что уровни LTB4 были немного выше у пациентов с астмой. Это говорит, что различия в производстве эйкосаноидов между клетками различных пациентов не всегда одинаковы, когда они анализируются в супернатанте, после спиртовой деструкции клеток или при комбинации этих двух способов. На основании результатов нашего исследования мы не можем исключить возможность, что увеличенные уровни LTB4, произведенные альвеолярными макрофагами пациентов с саркоидозом отражают не общее увеличение производства эйкосаноидов, а скорее увеличение транспорта через клеточную мембрану. В любом случае, увеличенные уровни LTB4, у пациентов с активным саркоидозом могут вносить вклад в усиление местной иммунной реакции.

Наше исследование также показало различную кинетику производства циклооксигеназы и метаболитов липоксигеназы нестимулированными альвеолярными макрофагами. Принимая во внимание, что уровни PGE2 были невыявляемы на ранних стадиях культивирования, увеличиваясь только через 24 часа, уровни LTB4 были высокими в течение первых часов культивирования с тенденцией уменьшения в течение следующих 24 часов. Этот паттерн совместим с предыдущими исследования метаболизма арахидоновой кислоты (29-31).

Интересно, что после стимуляции зимосаном, у нормальных клеток и клеток пациентов с активным саркоидозом наблюдалось различная кинетика. Нормальные клетки производили подобные уровни LTB4 в течение ранней и позденй фазы культивирования. Производство LTB4 клетками пациентов с активным саркоидозом значительно увеличилось после 60 минут культивирования и оставалось увеличенным в течение 24 часов. Использование ингибиторов циклооксигеназы, приводящее почти к полному ингибированию производства продуктов циклооксигеназы, не влияло на производство липоксигеназы у пациентов с саркоидозом.

Легочный саркоидоз - болезнь, характеризованная усилением иммунных / воспалительных процессов. Увеличенное число активизированных Т-лимфоцитов и альвеолярных макрофагов присутствуют в альвеолах пациентов. Эти клетки взаимодействуют, спонтанно производя большое количество медиаторов, которые необходимы для развития гранулемы. В этом контексте, увеличение производства LTB4 альвеолярными макрофагами у пациентов с активной болезнью в ответ на неизвестный стимул, потенциально уместно. LTB4 - продукт метаболизма арахидоновой кислоты, которая имеет мощную хемотаксическую активность для полиморфонуклеарных и мононуклеарных лейкоцитов (36-39), и его производство альвеолярными макрофагами у пациентов с саркоидозом может участвовать в усилении гранулематозного ответа, привлекая мононуклеарные фагоциты из крови в легкое. Кроме того, некоторые наблюдения указывают, что LTB4 увеличивает производство IL-1 моноцитами (40).

Кроме того, Pleszczynski с коллегами (42) показали, что производство IL-2 и IFN-gamma лимфоцитами было значительно увеличено в присутствии LTB4 и индометацина и что уменьшение субпопуляции T8+ супрессорных клеток приводит к увеличению производства лимфокинов и дальнейшему увеличению LTB4. Таким образом, LTB4 может производить множество “положительных” сигналов, когда “отрицательные” сигналы, ведущие к увеличению функции супрессорных клеток блокированы. Такое состояние может наблюдаться в альвеолах пациентов с активным саркоидозом, у которых значительное увеличенное количество лимфоцитов T-хелпер спонтанно производят увеличенные уровни IL-2 и IFN-gamma. В этом контексте, увеличенное производство LTB4 альвеолярными макрофагами может вносить вклад в усиление иммунной реакции, которая характеризует эту болезнь. Даже если увеличенное производство LTB4 стимулированными альвеолярными макрофагами может рассматриваться как дополнительный маркер функциональной активации этих клеток при саркоидозе, это не может быть полезным маркером активности болезни. Хотя пациенты с активной болезнью производят высокие уровни LTB4 по сравнению с пациентами с бездействующей болезнью, это различие не является статистически значимым. Необходимы дополнительные исследования, включающие оценку производства LTB4 альвеолярными макрофагами у большего числа пациентов, чтобы определить клиническую уместность этих результатов и, в частности, связь между уровнями LTB4, произведенными альвеолярными макрофагами и исходом болезни. Это особенно интересно в контексте недавних фармакологических успехов в области синтеза антагонистов лейкотриенов, которые могут представлять новую терапевтическую стратегию для ингибирования иммунных процессов при саркоидозе.

Результаты этого исследования показывают, что стимулированные альвеолярные макрофаги пациентов с активным саркоидозом, производят более высокие уровни LTB4, чем в группе контроля. Увеличенное производство LTB4 in vivo вероятно отражает клеточную активацию, которая происходит в легком при активном саркоидозе и может вносить вклад в местное усиление иммунной реакции.