Am. J. Respir. Crit. Care Med., Volume 165, Number 2, January 2002, 236-241

Увеличенные уровни MIP-1alpha и MIP-1beta в бронхоальвеолярном лаваже пациентов с различными стадиями легочного саркоидоза

ARMANDO CAPELLI, ANTONINO DI STEFANO, MIRCO LUSUARDI, ISABELLA GNEMMI, and CLAUDIO F. DONNER
''Salvatore Maugeri'' Foundation, Istituto de Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS), Scientific Institute of Veruno (Italy), Division of Pulmonary Disease, Veruno, Italy

Реферат

Воспалительный белок макрофагов MIP-1alpha и MIP-1beta являются хемокинами, которые стимулируют миграцию лимфоцитов. MIP-1alpha предпочтительно влияет на хемотаксис CD8, скорее чем CD4 лимфоцитов, принимая во внимание, что для MIP-1beta истинно обратное. Клеточным рецептором для этих хемокинов у T-лимфоцитов и альвеолярных макрофагов является CCR5 . Мы измерили концентрацию MIP-1alpha и MIP-1beta в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) 30 пациентов с различными стадиями легочного саркоидоза и у 18 здоровых индивидуумов. Мы также оценили экспрессию CCR5 у альвеолярных макрофагов и лимфоцитов. Уровни MIP-1alpha в БАЛ были значительно увеличены только в стадиях II и III саркоидоза. Напротив, уровни MIP-1beta были значительно увеличены во всех стадиях саркоидоза. Значительное увеличение экспрессии CCR5 наблюдалось у лимфоцитов и макрофагов всех пациентов, наряду с тенденцией к уменьшению числа CCR5+ лимфоцитов и макрофагов от стадии I к стадии III болезни. Уровни MIP-1beta коррелировали с общим количеством (r = 0.65, p = 0.0001) CD4 (r = 0.64, p = 0.0001) и CD8 (r = 0.62, p = 0.0001) лимфоцитов; напротив, уровни MIP-1alpha коррелировали только с числом CD8 лимфоцитов (r = 0.45, p = 0.002). Отрицательная корреляция наблюдались между процентом нейтрофилов и экспрессией CCR5 у альвеолярных макрофагов (r = -0.53, p = 0.005) и лимфоцитов (r = -0.43, p = 0.01). Наши результаты помогают объяснять механизм миграции CD4 и CD8 и возможное участие CC хемокинов в прогрессе саркоидоза к фиброзу.

Введение

Саркоидоз - системная гранулематозная болезнь неизвестной причины, которая чаще всего воздействует на легкое и лимфатическую систему. Спонтанная ремиссия происходит у почти двух третей пациентов, но курс болезни является хроническим или прогрессирующим у 10-30 % пациентов (1). Саркоидоз характеризуется накоплением активизированных T-клеток и макрофагов на участках воспаления, особенно в легком (2). У большинства пациентов, саркоидные T-лимфоциты имеют CD4 фенотип; редко преобладают CD8+ лимфоциты (3). Эти клетки спонтанно производят интерферон гамма (IFN-gamma) и интерлейкин-2 (IL-2), цитокины, связанные Th1 ответом (4, 5). Одним из ключевых цитокинов для индукции Th1 клеток является IL-12, продукт активизированных макрофагов, который является сильным индуктором Th1 ответа. Увеличенные уровни IL-12 производят дисрегуляцию развития Th1 клеток и усиливают производство Th1 цитокинов, особенно IFN-gamma (6). Саркоидные альвеолярные макрофаги ведут себя как универсальные секреторные клетки, которые производят другие цитокины, такие как фактор некроза опухоли альфа (TNF-alpha), IL-15, факторы роста и хемокины, такие как MCP-1, RANTES и воспалительный белок макрофагов MIP-1alpha и MIP-1beta. (7, 8).

При саркоидозе, эти хемокины были обнаружены в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) и супернатанте культуры клеток БАЛ; они являются медиаторами хемотаксической активности моноцитов, лимфоцитов и нейтрофилов и способны к активированию этих клеток (8). Увеличение производства этих хемокинов наблюдается у пациентов с активной или прогрессирующей болезнью. В модели идиопатического легочного фиброза, была установлена критическая роль хемокинов в инициировании и развитии легочных повреждений и их ангиогенеза (9). Исследований легочного фиброза при саркоидозе очень мало (8).

Баланс между двумя хемокинами, MIP-1alpha и MIP-1beta, потенциально может быть вовлечен в развитие хронического курса саркоидоза, потому что MIP-1alpha предпочтительно влияет на хемотаксис CD8, скорее чем CD4 лимфоцитов, принимая во внимание, что для MIP-1beta истинно обратное. Клеточным рецептором для этих хемокинов у T-лимфоцитов и альвеолярных макрофагов является CCR5 (11). Экспрессия рецептора хемокинов может быть главным регулирующим элементом, определяющим состав лимфоцитарных инфильтратов при различном паттерне воспалительной патологии. Высокий уровень экспрессии CCR5 наблюдается у CD4+ Th1 лимфоцитов, и их активация стимулирует каскад цитокинов с увеличенным производством IL-2 и IFN-gamma (12). Чтобы оценить роль MIP-1alpha, MIP-1beta и их рецептора CCR5 в патогенезе и прогрессе саркоидоза, мы оценили концентрацию хемокинов в БАЛ и экспрессию CCR5 у альвеолярных клеток пациентов с различными стадиями саркоидоза.

Пациенты

48 некурящих индивидуумов были включены в исследование: 18 здоровых индивидуумов в группе контроля и 30 пациентов с легочным саркоидозом, диагностированных согласно клиническими, функциональным, рентгенографическим и гистологическим критериям. Ни один из пациентов не имел альтернативного диагноза или воздействия любого неорганического материала, способного вызывать гранулематозную болезнь. Информированное согласие было получено у каждого пациента и протокол исследования был одобрен наблюдательным советом Scientific Institute in Veruno, Italy.

30 пациентов с саркоидозом были разделены на три группы: 12 со стадией I (двусторонняя внутригрудная лимфаденопатия без паренхиматозного вовлечения), 9 со стадией II (двусторонняя внутригрудная лимфаденопатия с паренхиматозным вовлечением) и 9 со стадией III/IV (легочные инфильтраты или терминальная стадия легочногго фиброза без внутригрудной лимфаденопатии). Лечение стероидами или нестероидными противовоспалительными средствами было приостановлено по крайней мере за 1 месяц до начала исследования. Ни у одного пациента никогда не проводилась цитотоксическая терапия.

Результаты

Функция легкого

Мы наблюдали прогрессирующее ухудшение функции легкого с уменьшением DLco и PaO₂ от стадии I (98.0 ± 8.9 % и 85.4 ± 3.8 mm Hg) к стадии III саркоидоза (53.8 ± 14.4 % и 72.3 ± 18.2 mm Hg).

Дифференциальный индек клеток БАЛ и субпопуляций лимфоцитов

Дифференциальный индек клеток БАЛ помимо лимфоцитоза, отражал развитие фиброза с существенным увеличением числа нейтрофилов [от 2.6 (от 0.7 до 12.7) к 11.6 (от 1.9 до 103.0)*10³/ml, p < 0.01] и эозинофилов [от 0.9 (от 0 до 2.8) до 5.5 (от 0.4 до 15.6)*10³/ml, p < 0.005] от стадии I к стадии III.

Интересно, что между группами пациентов с саркоидозом, мы наблюдали уменьшение CD4+ лимфоцитов (68.4 [от 54.2 до 87.8] против 45.5 [от 20.2 до 64.0] %, p < 0.01) и увеличение CD8+ лимфоцитов (14.3 [от 6.1 до 45.0] против 41.0 [от 29.4 до 48.6] %, p < 0.01) в стадии III по сравнению со стадией I, и следовательно уменьшение отношения CD4/CD8 (4.9 [от 1.9 до 10.3] против 1.2 [от 0.5 до 1.7], p < 0.001). Тот же самый результат наблюдался при анализе абсолютного числа CD4+ и CD8+ лимфоцитов.

Уровни MIP-1beta и MIP-1alpha в БАЛ

Увеличение MIP-1alpha у пациентов с саркоидозом было статистически существенным по сравнению с группой контроля (1.2 [от 0 до 3.8] pg/ml) только для стадии II (2.2 [от 1.0 до 4.3] pg/ml, p < 0.02) и стадии III (2.5 [от 1.6 до 13.1] pg/ml, p < 0.001); никаких существенных различий не наблюдалось для стадии I (1.6 [от 0 до 3.8] pg/ml).

Уровни MIP-1beta были выше в БАЛ в стадии I (8.8 [от 1.2 до 68.2] pg/ml), стадии II (14.8 [от 8.6 до 41.8] pg/ml) и стадии III (9.6 [от 1.6 до 14.6] pg/ml) саркоидоза чем в группе контроля (3.4 [от 0.3 до 6.8] pg/ml).

Свяь между характеристиками БАЛ и уровнями MIP-1alpha и MIP-1beta

Уровни MIP-1beta (r = 0.65, p = 0.0001) и MIP-1alpha (r = 0.4, p = 0.007) коррелировали с общим количеством лимфоцитов. При включении в статистический анализ пациентов и группы контроля, положительная корреляция была найдена между уровнями MIP-1beta в БАЛ и CD4+ (r = 0.64, p = 0.0001) и CD8 + (r = 0.62, p = 0.0001), принимая во внимание, что уровни MIP-1alpha коррелировали только с CD8 лимфоцитами (r = 0.45, p = 0.002). Эти корреляции не были статистически значимы, если мы исключали группу контроля из анализа. Кроме того, уровни MIP-1alpha коррелировали с числом нейтрофилов (r = 0.46, p = 0.002).

CCR5-иммунопозитивные (CCR5+) клетки в БАЛ

Наблюдались существенные различия в реакции клеток БАЛ на анти-CCR5 антитела между пациентами с саркоидозом и группой контроля. И макрофаги и лимфоциты были CCR5+ в БАЛ пациентов с саркоидозом; напротив, большинство клеток в группе контроля было CCR5-. Фактически, уровень экспрессии CCR5 у лимфоцитов и макрофагов пациентов с саркоидозом были почти всегда выше верхнего предела нормы у здоровых индивидуумов. Кроме того, мы наблюдали существенное уменьшение абсолютного числа и процента (p < 0.001) CCR5+ лимфоцитов и макрофагов от стадии I к стадии III.

Оценивая только пациентов с саркоидозом, мы наблюдали отрицательную корреляцию между процентом нейтрофилов и процентом CCR5+ лимфоцитов (r = -0.43, p < 0.01) и с процентом CCR5+ альвеолярных макрофагов (r = -0.53, p < 0.005).

Обсуждение

Наши результаты демонстрируют увеличенный уровень двух хемокинов, MIP-1alpha и MIP-1beta в БАЛ пациентов с различными стадиями саркоидоза. Эти результаты были связаны с увеличенной экспрессией CCR5, специфического рецептора этих двух хемокинов у лимфоцитов и альвеолярных макрофагов.

Большинство исследований саркоидоза проводилось в стадии I болезни. Ни одно из проведенный исследований не показало, почему вовлечение легкого персистирует у одних пациентов, но не у других, и ни одно из исследований не показало, как персистирующая болезнь прогрессирует к фиброзу. Стадии II и III, по сравнению со стадией I, характеризуются изменением численности клеточных субпопуляций в легком, с прогрессирующим увеличением нейтрофилов и эозинофилов, связанных с ухудшением клинических и функциональных параметров. Prasse с коллегами недавно наблюдали, что CD8+ T-лимфоциты могут производить IL-2, TNF-alpha и INF-gamma подобо CD4+ клеткам. Следовательно, клетки CD8+ могут быть возможным источником этих провоспалительных цитокинов у пациентов со стадией II и III саркоидоза (17). Исследования участия T-клеток в легочном фиброзе на блеомицин-индуцированной модели фиброза дали противоречивые результаты (9,18).

Синтез хемокинов MIP-1alpha, MIP-1beta и экспрессии их рецептора CCR5 связаны с Th1 иммунным ответом (12, 19). В нашем исследовании, уровни MIP-1alpha были значительно увеличены только в БАЛ пациентов со стадией II и III саркоидоза, где вовлечение легочного интерстиция является очевидным. Важная роль MIP-1alpha наблюдалась при исследовании фиброзных болезней легкого и в блеомицин-индуцированной модели легочного фиброза у мышей (9, 20), где лечение анти-MIP-1alpha антителами уменьшило содержание гидроксипролина в легком на 49 % (21). McKee с коллегами наблюдали, что фрагменты соединений гиалуроновой кислоты, наблюдаемые при воспалительных состояниях, стимулируют приток воспалительных клеток, отложение коллагена и экспрессию нескольких генов макрофагов, включая гены семейства хемокинов MIP-1alpha и MIP-1beta (22). Мы наблюдали существенную корреляцию уровней MIP-1alpha в БАЛ с числом CD8+ лимфоцитов и нейтрофилов, что согласуется с результатами предыдущих наблюдений (9). Cocchi с коллегами документировали способность CD8+ лимфоцитов производить MIP-1alpha, MIP-1beta и RANTES (23).

Наконец, наше исследование сообщает о существенной отрицательной корреляции между уровнями MIP-1alpha и PaO₂ (r = -0.43, p = 0.01) и DLco (r = -0.58, p = 0.001), параметрами, указывающими на ухудшение газообмена в легком, индуцированного развитием фиброза. Наши результаты позволяют предположить прямое участие MIP-1alpha в воспалительном процессе, лежащем в основе фиброза при саркоидозе.

По нашим даным, это первое исследование, оценивающее участие MIP-1beta в прогрессе фиброза, который может происходить при саркоидозе. В недавнем исследовании Katoh с коллегами оценили уровни MIP-1beta в БАЛ пациентов со стадией I саркоидоза, идиопатическим легочным фиброзом и эозинофильной пневмонией (24). Уровни MIP-1beta были выше в БАЛ пациентов с эозинофильной пневмонией и коррелировали с числом эозинофилов, но не с числом других клеток. В нашем исследовании, мы наблюдали увеличение уровней MIP-1beta во всех стадиях саркоидоза с хорошей корреляцией с CD4 + и CD8 + лимфоцитами, что согласуется с наблюдениями, что этот хемокин производится T-клетками и участвует в их хемотаксисе (10, 23). Никакой корреляции не было найдено между уровнями MIP-1beta в БАЛ при саркоидозе и числом нейтрофилов или эозинофилов. Различия между нашими результатами и результатами Katoh с коллегами, можно объяснять различной методологией исследования БАЛ (мы исследовали супернатант) и число пациентов в нашем исследовании было значительно больше. Bless с коллегами, недавно обнаружили важную роль MIP-1beta в индуцированном IgG повреждении легкого. MIP-1beta действует как аутокринный активатор альвеолярных макрофагов и вызывает увеличение сосудистой проницаемости (25), что весьма подобно некоторым аспектам патогенетического механизма саркоидоза (8). Согласно нашим результатам, MIP-1beta участвует в ранней стадии болезни. Напротив, действие MIP-1alpha наблюдается в поздних стадиях саркоидоза.

CCR5 является клеточным рецептором MIP-1alpha и MIP-1beta (11), что по наблюдениям Loetscher с коллегами, является характерным для Th1 воспалительного ответа. Активация CCR5 стимулирует увеличение производства IL-2 и IFN-gamma (12), что согласуется с увеличением уровней этих двух цитокинов, наблюдаемых при саркоидозе (1, 8). Интересно, что мы обнаружили уменьшение экспрессии CCR5 у макрофагов и лимфоцитов БАЛ пациентов со стадией II и III саркоидоза. Это уменьшение экспрессии CCR5 может быть связано с фиброзом. Petrek с коллегами в группе Чешских пациентов с легочным саркоидозом без спонтанной ремиссии и требовавших лечения кортикостероидами, наблюдали увеличение частоты аллеля CCR5delta32 (26) и делеции 32-bp гена CCR5, что приводило к нефункциональности поверхностного рецептора с неспособностью связывать лиганды хемокинов RANTES, MIP-1alpha и MIP-1beta (27). Мы не изучали эти генетические характеристики у наших пациентов, но мы наблюдали уменьшение экспрессии рецептора CCR5, параллельное прогрессу болезни. Так как экспрессия CCR5 - характеристика Th1 иммунной реакции (12), ее уменьшение, наблюдаемое в поздних стадиях болезни, может быть свидетельством ''переключения'' иммунной реакции к Th2, которая может происходить у пациентов с саркоидозом, у которых развивается фиброз легкого, как продемонстрировали Kunkel с коллегами (28). Мы также показали статистически существенную отрицательную корреляцию между экспрессией CCR5 и нейтрофилами, воспалительными клетками, вовлеченные в прогресс фиброза. В нашем предыдущем исследовании, экспрессия CCR5 у альвеолярных макрофагов и лимфоцитов у пациентов с хроническим бронхитом, мы получили подобный результат (29). В исследовании in vitro, нейтрофилы были способны ингибировать экспрессию лимфоцитов CD3, CD4, CD8 и CD2 (30). Поэтому, хотя это пока не документировано, мы можем предположить, что нейтрофилы могут уменьшать экспрессию CCR5.

Наши наблюдения указывают на важную роль хемокинов MIP-1alpha и MIP-1beta и их рецептора CCR5 в патогенезе воспалительного процесса, в раней и поздней (фиброзной) стадии легочного саркоидоза. Поскольку маркеры прогресса к фиброзу отсутствуют, дальнейшее изучение цитокинов и хемокинов в различных стадиях болезни, могут помочь разъяснить, почему некоторые пациенты имеют спонтанную ремиссию, а у других развивается легочный фиброз.